These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington&#8217;s Center for AIDS Research (P30 AI027757).

<ol>
	<li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival.">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li><li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+viral+emergence.">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38 (2010).</li><li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness:+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo.">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li><li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+(CTL)+response.">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365 (2009).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C:+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics.">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463 (2010).</li><li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes:+implications+for+the+epidemic.">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li><li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+infection/competition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression.">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li><li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes.">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li><li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses.">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li><li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q/E+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine.">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li><li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation.">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li><li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li><li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A,+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors,+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA(Lys,+3)+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency.">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li><li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted/founder+genome.">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li><li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay.">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li><li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and/or+reverse+transcriptase+variants.">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes:+fitness-balanced+escape.">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li><li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41.">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li><li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness.">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture.">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li><li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers.">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in.">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+conserved-element+vaccines:+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity.">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li><li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li><li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A.">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li><li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li><li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density.">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints.">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines.">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins.">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li><li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlap+extension+PCR+cloning:+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids.">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li><li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro.">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li><li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface.">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065 (2013).</li><li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing.">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li><li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies.">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة. إن الآراء الواردة في هذه الوثيقة هي آراء المؤلفين، وينبغي ألا يفسر على أنه مسؤول أو تمثل وجهة نظر وزارة الدفاع الأمريكية أو وزارة الجيش.

البروتوكولات قدم تتكون من جزئين رئيسيين: بناء المؤتلف HIV-1 استنساخ الجزيئية وفحوصات المنافسة النمو. من أجل التمييز بين نوعين من الفيروسات في زراعة الخلايا المصابة بشكل مزدوج، فمن المهم أن استنساخ الجزيئية المتنافسة تحتوي على علامات تسلسل، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة RT-QPCR التمهيدي مسبار الفحص أو عن طريق سانجر التسلسل. هذا البروتوكول يجعل من استخدام VIFA وVifB العلامات، والتي تحتل نفس المنطقة من HIV-1 NL4-3 VIF وترميز نفس تسلسل الأحماض الأمينية ولكنها تختلف من ست طفرات مرادفة. وقد أظهرت هذه الطفرات لا تؤثر تكاثر الفيروس لياقة بدنية (20). طريقة استنساخ PCR القائم المستخدمة في هذا البروتوكول يوفر المزيد من المرونة في اختيار مواقع الاستنساخ، بالمقارنة مع موقع تقييد الاستنساخ القائمة. ومع ذلك، فإن كفاءة PCR الاستنساخ عكسيا مع زيادة حجم إدراج. الحد الحالي من حجم إدراج هو ~ 5 كيلو بايت 34. لاستنساخ PCR القائم والموقع موجه mutagenesiالصورة، استخدام الحمض النووي بوليميريز عالية الدقة أمر حاسم للحد من احتمالات حدوث طفرات إضافية. ويوصى أيضا استخدام أقل عدد ممكن من دورات PCR اللازمة لانتاج كميات كافية من المنتجات. في تجربتنا، ونحن لم يكشف عن أي طفرات إضافية بعد الاستنساخ وموقع الموجه الخطوات الطفرات PCR القائم هو موضح هنا. مع ذلك يجب أن تكون متسلسلة منتجات PCR للتحقق من أي طفرات غير مرغوب فيها. من الناحية المثالية، ينبغي resequenced المنطقة بأسرها الترميز فيروس نقص المناعة البشرية. يجب فحص ثلاث نقاط على الأقل وقت أخذ العينات في مرحلة النمو الأسي 9. لا بد أولا أن تنشأ حركية النمو الفيروسية باستخدام أخذ العينات اليومية لتحديد الفترة الثقافة ووقت أخذ العينات النقاط المناسبة للمنافسة النمو. أحد العوامل التي تؤثر على حركية النمو الفيروسي هو وافر من العدوى (وزارة الداخلية). يستخدم هذا البروتوكول في وزارة الداخلية إجمالية قدرها 0.005 لكل من عدوى أحادية والمنافسة النمو، كما تبين أن تسفر عن مزيد من ريال عمانيالنتائج تمثال نصفي من أقل موييس 9. ومع ذلك، يمكن استخدام موييس أقل للحصول على مرحلة النمو يعد الأسي إذا لزم الأمر، ولكن على حساب نتيجة الاتساق. يوحي هذا البروتوكول نسبة الإصابة الأولية من 50:50، على افتراض أن الاختلافات اللياقة البدنية للفيروسات غير معروفة عموما مسبقا. ومع ذلك، فإن استخدام نسب مدخلات غير متكافئة ومناسبة عندما يكون هناك بيانات أولية تشير إلى اختلافات كبيرة في حركية تكاثر الفيروس. في هذه الحالات، لذا ينصح باستخدام أي نسبة إصابة 70:30 للسماح للكشف عن فارق اللياقة البدنية كبير حيث يتم وضع الفيروس أقل مناسبا تتجاوز 9. بروتوكول لتحديد TCID 50، حركية النمو الفيروسي، وأداء النمو وتحسين المقايسات المنافسة باستخدام HIV-1 سلالة B، وقد أثبتت NL4-3 COTB-P24، وPBMCs من متبرع واحد الذي PBMC قابلية متسقة لبفيروس نقص المناعة البشرية إصابة 1 في المختبر. الفترة الثقافةونقاط الوقت أخذ العينات الواردة في هذا البروتوكول من المرجح أن تكون مناسبة لدراسة HIV-1 مجموعة الفيروسات M في PBMCs الإنسان. ينصح بشدة باستخدام PBMCs من مصدر واحد للحصول على نتائج متسقة كما تكاثر الفيروس يمكن أن تختلف في خلايا مختلفة المانحة 35. على الرغم من أن أقل من المرغوب فيه، PBMCs مجمعة من جهات مانحة متعددة يمكن استخدامها على النحو المنصوص إجراء تبديل أن هذا المجمع نفسه يستخدم في جميع التجارب. بديل آخر هو استخدام خطوط الخلايا. تم استخدام بروتوكول المعروضة هنا بنجاح مع خط T-خلية CEMx174 23،36. ومع ذلك، فمن المهم أن أعداد الخلايا المزروعة هي تحقيق نمو الخلايا ثابت الأمثل إعادة. حركية النمو الفيروسية كما يجب إعادة تأسيس، كما أنه من المرجح أن تختلف في خطوط مختلفة من الخلايا، لتحديد نقاط الوقت أخذ العينات المناسبة في الخطوات المنافسة النمو. وشملت اثنين من أساليب مختلفة لتحديد نسبة الفيروسية لحساب اللياقة البدنية في protocرأ. أول يستخدم RT-QPCR لقياس الفيروسي في عدد النسخ [كدنا في كل نقطة زمنية أخذ العينات. ثم تم حساب الفيروسية اللياقة البدنية النسخ المتماثل من نسبة الفيروسية، استنادا إلى عدد كدنا] نسخة. بدلا من ذلك، يمكن تحديد نسبة الفيروسية على أساس نسبة ارتفاع اللوني الذروة في مواقع العلامة VifAB. طريقتين تعطي نتائج متشابهة (الشكل 4). طريقة ذروة الذروة اللوني يمكن تطبيقها على غيرها من HIV-1 سلالات دون علامة تسلسل هندسيا. لRT-QPCR، واستخدام البادئات أو تحقيقات لتمييز المتغيرات الفيروسية يجب أولا أن تقيم بعناية (انظر 20). ومع ذلك، يوفر RT-QPCR حساسية أفضل للعينات مع كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي الفيروسي، مثل تلك التي من وجهة أول مرة في مرحلة النمو الأسي. القياس المباشر للكدنا] الفيروسية كما يتيح الكشف عن المشاكل الفنية التي قد تنشأ عن استخراج الحمض النووي الريبي وكدنا] التوليف. استخدام الحيوانات المستنسخة الجزيئية مع به تسلسل يوفر فعالة من حيث التكلفة حل رس الطرق RT-QPCR، وهناك حاجة فقط اثنين من أزواج من الاشعال وتحقيقات لدراسة الفيروسات متعددة. يتجنب هذه الاستراتيجية أيضا مشكلة تباين ذروة الارتفاع في تسلسل الاستشرابية بسبب القواعد المجاورة 37، كما هو الحال التسلسل في نفس الموقع في جميع الفيروسات في الدراسة. المنتجات PCR المنتجة للRT-QPCR وسانجر تسلسل ويمكن أيضا أن يكون استخدام مع أساليب أخرى لتحديد نسبة الفيروسية مثل التسلسل الجزء الأكبر من الحيوانات المستنسخة الفردية 12،13، HTA 4،7،17،19، أو قليل النوكليوتيد ربط الفحص (OLA) 38 .

يتم تعريف الفيروسية اللياقة البدنية التكرار بوصفه قدرة الفيروس على إنتاج ذرية المعدية في بيئة معينة 1 و هو عامل مساهم مهم في تحديد مدى انتشار فيروس متغير على مستوى السكان على مر الزمن 2. كما هو الحال في الدراسات المجراة اللياقة البدنية ليست مجدية مع الفيروسات المسببة للأمراض البشرية، مثل HIV-1، ومختلف في المختبر، وبحكم فيفو تكرار فحوصات اللياقة البدنية وضعت لدراسة الآثار المترتبة على اللياقة البدنية الناشئة عن مقاومة المخدرات والطفرات الهروب المناعة، قشوة والتطور السكان الفيروسي 3-6. بين فحوصات اللياقة البدنية المختلفة، يتم التعرف على المقايسات المنافسة النمو لانتاج تدابير أكثر حساسية وصالحة للاختلافات اللياقة البدنية، واثنين أو أكثر من المتغيرات الفيروسية تتنافس على السكان الخلية نفسه ضمن نفس الظروف البيئية ذاتها، كما يحدث في الجسم الحي 1،7،8. قبل بدء النمو التجارب المنافسة، والعديد من variabليه بحاجة إلى أن تحدد، بما في ذلك استخدام مولتيبليكيتييس مختلفة من العدوى (وزارة الداخلية)، ونسبة المدخلات الفيروسية، وتوقيت أخذ العينات لتحليلها. درسنا آثار هذه المعايير على حركية النمو الفيروسية وعلى نتائج التجارب المنافسة، وحددت العوامل الأساسية اللازمة لقياس قوة من HIV-1 للياقة البدنية في الثقافة خلية 9. بالإضافة إلى المتغيرات الفحص، وهناك مجموعة متنوعة من الطرق لquantitating المتغيرات الفيروسية في التجارب المنافسة النمو. وقد استخدم الجزء الأكبر 10،11 أو 12،13 نسيلي التسلسل لتحديد نسبة الفيروسات المتنافسة على أساس ترددات النوكليوتيدات في موقع (ق) من الفائدة. ويستمد اللياقة البدنية النسبية من التغيرات في هذه النسبة مع مرور الوقت. هذه الطريقة مريحة كما هي خدمات تسلسل الحمض النووي على نطاق واسع. أليل محددة مواز التسلسل (PASS) طريقة يمكن التسلسل في مواقع متعددة والكشف عن recombinants 14 </sup&gt;، ولكنه يتطلب أيضا الكواشف وضعت خصيصا وأنظمة الكشف. في الأساس، وقد وضعت هذه الأساليب لدراسة السلالات الفيروسية مع عدد قليل من الاختلافات النوكليوتيدات في المنطقة من اهتمام. أساليب أخرى تستخدم الجين مراسل صغيرة 15 أو مرادف الطفرات 4،16-18 كعلامات لتمييز الفيروسات المتنافسة بواسطة التسلسل، المقايسات تتبع مضاعف متغاير (HTA) 4،7،17،19 أو عكس في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل-النسخ الكمي (RT-QPCR) 15،16،18،20، وكلها يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لدراسة السلالات المنافسة بغض النظر عن تشابه تسلسل. مطلوب خطوة إضافية لإدخال العلامات إلى الجينومات الفيروسية ويتطلب فحص RT-QPCR أيضا الكواشف والأجهزة محددة. لقد وجدنا أن معظم سانجر عوائد التسلسل نتائج مماثلة 9. بعد منافسة النمو، ويقدم الفيروسية اللياقة البدنية التكرار بوصفه اللياقة البدنية النسبية، أو نسبة اللياقة البدنية بين رالتعليم الجامعي المتغيرات الفيروسية. لياقة النسبية للفيروس يمكن تعريفها بأنها نسبة النهائية لنسخة الفيروسي تطبيع من قبل نسبة الأولية في اللقاح أو بالفرق صافي معدل نمو بين اثنين من الفيروسات المتنافسة. وجدنا أن الأسلوب الأخير، وذلك باستخدام نقاط البيانات الطولية فقط في مرحلة النمو الأسي، أنتج نتائج أقوى 9،20. في المختبر يتم استخدام فحوصات اللياقة البدنية في المقام الأول لدراسة استنساخ البيولوجية 6-8 واستنساخ الجزيئية المعدية من HIV-1. هذا الأخير، ويجري قابلة للتلاعب الجيني، وغالبا ما تستخدم لدراسة تأثير على اللياقة البدنية من الطفرات معينة أو متواليات محددة من الفائدة 3-5،21،22. البروتوكولات التالية تصف سير العمل من وجهة بناء جديد كامل طول-1 فيروس نقص المناعة البشرية استنساخ الجزيئية المعدية باستخدام HIV-1 ناقلات تحتوي على علامة تسلسل، وإدخال طفرات من الفائدة، مما أسهم الفيروسية وإقامة حركية النمو الفيروسي، لأداء الفحص المنافسة النمو وحساب لياقة بدنية النسبية (الشكل 1). باستخدام إجراءاتنا الأمثل، أنشأنا ثلاثة المؤتلف HIV-1 المسوخ وتحديد اللياقة البدنية تكرارها. شيد استنساخ الجزيئي المؤتلف أولا عن طريق استبدال هفوة-P24 منطقة الجين HIV-1 من pNL4-3، البلازميد التي تحتوي على طول الجينوم المعدية الكامل HIV-1 سلالة مختبر NL4-3، مع COTB الاصطناعية (مركز-وغالبا شجرة، سلالة B) تسلسل هفوة-P24 23 لإنشاء سلالة النموذج. تغييرات الأمينية واحدة (T186M، T242N، وI256V) ثم تم عرض لإنشاء ثلاثة استنساخ متحولة. وقد تنافس كل متحولة من فيروس النموذج الأولي لمراقبة تأثير اللياقة البدنية من كل طفرة في الخلفية الوراثية معين. المسوخ ثلاثة مستويات كما يتجلى ذلك من تكرار fsitness متفاوتة من خفيف إلى أقل بكثير من فيروس النموذج. وأفادت التقارير طفرة T242N سابقا أن يكون fitne المعتدلتكلف SS 24-26، على غرار النتيجة المعروضة في هذه الدراسة. لم يتم الإبلاغ عن تكلفة اللياقة البدنية الأخريين الطفرات سابقا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:484px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:196px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Construction of recombinant clones</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid</td>
			<td style="width:484px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-fidelity buffer</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems&#174; GeneAmp&#174; PCR System 9700</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA loading dye</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">DpnI enzyme</td>
			<td style="width:484px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TOP10 chemically competent Escherichia coli</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Luria Broth base powder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:484px;">Research Products International</td>
			<td style="width:137px;">C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEK 293T-17</td>
			<td style="width:484px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">CRL-11268</td>
			<td>http://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.22um filter top tube</td>
			<td style="width:484px;">VWR International</td>
			<td>89220-716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#8242;s Modified Dulbecco&#8242;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phytohemagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Human Interleukin-2</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>11147528001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:484px;">JR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">43640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:484px;">Corning Cellgro</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">62407-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td style="width:137px;">T-3015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well round-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:137px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:484px;">Mt. Baker Bio</td>
			<td style="width:137px;">MBD-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 mL tubes w/ O-ring</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td>C-3317-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">glycerol</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tween 20</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td>
			<td style="width:484px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:137px;">4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">52-00-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HIV p24 standard</td>
			<td style="width:484px;">AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:484px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA isolation cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxtractor</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">SuperscriptIII</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">First-strand buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Rnase inhibitor</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RnaseH</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18021-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Real-time qPCR machine</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan&#174; Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Forward, reverse primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Probe</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">optical 96 well reaction plate</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">I19N3Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR+sequencing</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Taq DNA polymerase (Biolase)</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NH4 buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgCl2</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sequencing primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxcel</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA sequencing service provider</td>
			<td>http://www.htseq.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GRC web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ChromatQuan web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pairwise growth competition assay for determining the replication fitness of human immunodeficiency viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

لدراسة تأثير اللياقة البدنية من واحد التغييرات الأحماض الأمينية في HIV-1 الكمامة-P24، كنا النوكليوتيد الموجهة الطفرات لإدخال طفرات في البلازميد pNL4-3 تحتوي على HIV-1 COTB-P24 23،32،33 الجينات. تم إنشاء مخزون الفيروسية التي ترنسفكأيشن من خلايا 293T وتحصد بعد 48 ساعة. قدرنا 50٪ زراعة الأنسجة الجرعة المعدية (TCID 50) لكل سهم الفيروسي من خلال طريقة ريد مونش 31. وTCID 50 من النموذج وفيروسات متحولة تراوحت من 10 أبريل - 10 مايو IU / مل (الشكل 3A). تم إنشاء حركية نمو الفيروسات المؤتلف في PBMCs من متبرع واحد في وزارة الداخلية من 0.005. وقد استخدم RT-QPCR لقياس الفيروسي في عدد النسخ [كدنا يوميا لمدة ستة أيام. نمت كل متحولة والنموذج الفيروسات بشكل كبير بين يوم 2 و 4 يوم، وبعد ذلك تباطأ النمو الفيروسي، كما يتبين من منحدر انخفضت الزيادة في عدد النسخ RNA الفيروسي (&lt;قوي&gt; الشكل 3B). انخفاض كدنا] نسخ هو رقم بين يوم 0 (المقابلة لقيحة)، ويوم 2 يرجع ذلك إلى امتصاص الفيروس إلى الخلايا وإزالة virions غير منضم يوما بعد يوم 1 غسل (الخطوة 5.1.6). في مرحلة النمو الأسي، كان كل المسوخ ثلاثة معدل نمو أبطأ (ز) من الفيروس النموذج (الشكل 3C). وقد تنافس كل المسوخ ثلاثة ضد الفيروس النموذج في المقايسات المنافسة النمو في وزارة الداخلية إجمالية قدرها 0.005. كانت حركية النمو الفيروسي في الثقافات المصابة بشكل ثنائي مماثلة لتلك التي من عدوى أحادية. كانت مرحلة النمو الأسي الفيروسية بين أيام 2 و 4، وبلغ معدل النمو الفيروسي هضبة اليوم حوالي 5 (الشكل 4A). وقد استمدت الخلافات الفيروسية معدل النمو من التغير في نسبة الفيروسية مع مرور الوقت. تم احتساب نسبة الفيروسية على أساس كدنا] عدد نسخة من المرجعية والفيروسات متحولة باستخدام RT-QPCR، وبمقارنة مستويات الذروةفي تسلسل الاستشرابية في مواقع النوكليوتيدات التمييز بين الفيروسين (الشكل 4B). الاختلافات معدل النمو تحديدها باستخدام ذروة الارتفاع ونسخة RNA طرق عدد الفيروسية أسفرت عن نتائج مماثلة (الشكل 4C). كان كل المسوخ الثلاث السفلى اللياقة البدنية النسخ من الفيروسات النموذج مع I256V متحولة وجود أدنى اللياقة البدنية (الشكل 4C). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> الشكل 1: مخطط التدفق من البروتوكولات المعروضة في هذه الورقة فيروس بروتوكولات إعداد القلق بناء HIV-1 استنساخ المؤتلف وجيل من الأسهم الفيروسية. بروتوكولات اللياقة البدنية فحوصات هي لإنشاء حركية النمو الفيروسية وتحديد اللياقة البدنية الفيروسية النسبية. الخطوط المتقطعة تمثل تدفقات بديلة للالبروتوكولات. على سبيل المثال، يمكن إدخال طفرة مباشرة إلى HIV-1 NL4-3استنساخ الجزيئي دون توليد استنساخ المؤتلف. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> الشكل 2: بناء HIV-1 NL4-3 COTB الكمامة-P24 استنساخ الجزيئية المؤتلف باستخدام تمديد تداخل PCR (A) تصميم الاشعال خيالية. 5 &#39;نصفي الاشعال تحتوي على تسلسل ناقلات NL4-3 و3&#39; نصفين تحتوي على نهايات تسلسل إدراج. وتستخدم (B) الاشعال خيالية لتضخيم جزء إدراج، COTB الكمامة-P24. وتستخدم (C) وشظايا إدراج كما الاشعال لPCR الثاني لتوليد البلازميد المؤتلف الجديد. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> الرقم 3: خصائص النمو الفيروسي في PBMCs (A) سجل 10 TCID 50 </sيو بي&gt; الأسهم الفيروسية. (B) حركية النمو الفيروسي في monoinfections بدأت في وزارة الداخلية = 0.005. (C) معدلات النمو الفيروسي أكثر من ستة أيام، بما في ذلك مرحلة النمو الأسي (2-4 أيام) مشتقة من لوحة (B). القيم المبينة تمثل بمعدل ثلاثة مكررات من تجربة واحدة. تمثل أشرطة الخطأ فترات الثقة 95٪. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> الرقم 4: النمو الفيروسي واللياقة البدنية النسبية قرارات (A) النمو الفيروسي في الثقافات PBMC المصابة بشكل مزدوج. (B) نسب T242N والنموذج الفيروسات مصممة باستخدام RT-QPCR أو طريقة التسلسل ذروة الارتفاع. (C) صافي الاختلافات معدل النمو الفيروسي (د) بين متحولة والفيروسات النموذج في الثقافات المصابة بشكل ثنائي، كما هو مبين في الفقرة (أ). تم حساب القيم د وROM البيانات نسبة الفيروسية هو مبين في (B). القيم المبينة تمثل بمعدل ثلاثة مكررات من تجربة واحدة. تمثل أشرطة الخطأ فترات الثقة 95٪.

Watch this Scientific Journal Video about Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses at JoVE.com

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Views.  University of Washington. Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Video: Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood cells are particularly useful targets as they are readily available and agglutination is observable using the naked eye. This technique is commonly used to determine the titre of an antibody (Ab), for blood grouping and viral quantification. In this video, the steps involved in preparing and performing a haemagglutination assay is demonstrated using antibodies specific to blood group A-antigens added to red blood cells (Revercells). The antiserum is serially diluted in a 96 well U-bottom microtitre tray, to which is added a suspension of Revercells. The samples are mixed and then incubated at 37&deg;C for 60 minutes. After this time, the samples can then be easily scored for  ve, +ve and intermediate (-/+) haemagglutination reactions. This approach allows for the reactivity and titre of a serum sample to be assessed using a rapid and simple technique. The video will cover the theory behind the assay, how the results are read and interpreted, how the titre is determined, how the assay can be modified and any issues associated with the use of this technique.

Haemagglutination is a form of agglutination where antibodies bind to red blood cells. Red blood cells are both readily available and the results are readily observable using the naked eye. This video demonstrates the steps involved in a haemagglutination assay, interpreting the results and determining the titre.

تحديد التفاعل وعيار من المصل باستخدام الفحص Haemagglutination

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

تحديد نشاط السامة للخلايا الأمثل للHer2neu CD8 خلايا تي محددة الإنسان من خلال مقارنة الفحص الإصدار Cr51 إلى نظام xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

Soil-transmitted helminth (STH) infections are common. Indeed, more than 1 billion people are affected, mainly in the developing world where poverty prevails and hygiene behavior, water supply, and sanitation are often deficient1,2. Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, and the two hookworm species, Ancylostoma duodenale and Necator americanus, are the most prevalent STHs3. The estimated global burden due to hookworm disease, ascariasis, and trichuriasis is 22.1, 10.5, and 6.4 million disability-adjusted life years (DALYs), respectively4. Furthermore, an estimated 30-100 million people are infected with Strongyloides stercoralis, the most neglected STH species of global significance which arguably also causes a considerable public health impact5,6. Multiple-species infections (i.e., different STHs harbored in a single individual) are common, and infections have been linked to lowered productivity and thus economic outlook of developing countries1,3.
For the diagnosis of common STHs, the World Health Organization (WHO) recommends the Kato-Katz technique7,8, which is a relatively straightforward method for determining the prevalence and intensity of such infections. It facilitates the detection of parasite eggs that infected subjects pass in their feces.
With regard to the diagnosis of S.stercoralis, there is currently no simple and accurate tool available. The Baermann technique is the most widely employed method for its diagnosis. The principle behind the Baermann technique is that active S.stercoralis larvae migrate out of an illuminated fresh fecal sample as the larvae are phototactic9. It requires less sophisticated laboratory materials and is less time consuming than culture and immunological methods5.
Morbidities associated with STH infections range from acute but common symptoms, such as abdominal pain, diarrhea, and pruritus, to chronic symptoms, such as anemia, under- and malnutrition, and cognitive impairment10. Since the symptoms are generally unspecific and subtle, they often go unnoticed, are considered a normal condition by affected individuals, or are treated as symptoms of other diseases that might be more common in a given setting. Hence, it is conceivable that the true burden of STH infections is underestimated by assessment tools relying on self-declared signs and symptoms as is usually the case in population-based surveys.
In the late 1980s and early 1990s, Stephenson and colleagues highlighted the possibility of STH infections lowering the physical fitness of boys aged 6-12 years11,12. This line of scientific inquiry gained new momentum recently13,14,15. The 20-meter (m) shuttle run test was developed and validated by L&eacute;ger et al.16 and is used worldwide to measure the aerobic fitness of children17. The test is easy to standardize and can be performed wherever a 20-m long and flat running course and an audio source are available, making its use attractive in resource-constrained settings13. To facilitate and standardize attempts at assessing whether STH infections have an effect on the physical fitness of school-aged children, we present methodologies that diagnose STH infections or measure physical fitness that are simple to execute and yet, provide accurate and reproducible outcomes. This will help to generate new evidence regarding the health impact of STH infections.

Chronic infection with soil-transmitted helminths (STHs) causes malabsorption, stunting, and wasting in the growing child. Hence, it is plausible that these infections also reduce the physical fitness of children. Here, we visualize two techniques for the diagnosis of STHs and the 20-meter shuttle run test for assessing children's physical fitness.

تحديد التربة المنقولة الإصابة بالديدان الحالة واللياقة البدنية من الأطفال في سن المدرسة

Soil-transmitted helminth (STH) infections are common. Indeed, more than 1 billion people are affected, mainly in the developing world where poverty ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

تقييد أنزيم الاستنساخ القائم على أسلوب لتقييم<em&gt; في المختبر</em&gt; القدرة تكرار HIV-1 النوع الفرعي C-الكمامة MJ4 همي الفيروسات

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under controlled laboratory conditions. Ex vivo infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV), among other viruses, has been successfully used to investigate early disease pathogenesis, as well as a platform to test the efficacy and toxicity of antiviral drugs. In the present protocol, we explain how to process and infect with HIV-1 tissue explants from human tonsils and cervical mucosae, and maintain them in culture on top of gelatin sponges at the liquid-air interface for about two weeks. This non-polarized culture setting maximizes access to nutrients in culture medium and oxygen, although progressive loss of tissue integrity and functional architectures remains its main limitation. This method allows monitoring HIV-1 replication and pathogenesis using several techniques, including immunoassays, qPCR, and flow cytometry. Of importance, the physiologic variability between tissue donors, as well as between explants from different areas of the same specimen, may significantly affect experimental results. To ensure result reproducibility, it is critical to use an adequate number of explants, technical replicates, and donor-matched control conditions to normalize the results of the experimental treatments when compiling data from multiple experiments (i.e., conducted using tissue from different donors) for statistical analysis.

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infection of human tissues with human immunodeficiency virus (HIV) ex vivo provides a valuable 3D model of virus pathogenesis. Here, we describe a protocol to process and infect tissue specimens from human tonsils and female genital mucosae with HIV-1 and maintain them in culture at the liquid-air interface.