These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington&#8217;s Center for AIDS Research (P30 AI027757).

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Die hier geäusserten Meinungen sind diejenigen der Autoren und sind nicht als offizielle oder repräsentieren die Ansichten des US Department of Defense oder die Abteilung der Armee aufgefasst werden.

Die vorgestellten Protokolle bestand aus zwei Hauptteilen: Konstruktion von rekombinanten HIV-1 molekularen Klonen und Wachstum Kompetitionsassays. Um zwei Viren in einer doppelt infizierten Zellkultur zu unterscheiden, ist es wichtig, dass die konkurrierenden molekulare Klone enthalten Sequenz-Tags, die durch eine RT-qPCR-Primer-Sonden-Tests oder durch die Sanger-Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Dieses Protokoll verwendet die VIFA und VIFB Tags, welche den gleichen Bereich von HIV-1 NL4-3 vif zu besetzen und codieren die gleiche Aminosäuresequenz, unterscheiden sich jedoch von sechs auch Mutationen. Diese Mutationen zeigten keine Auswirkungen auf virale Replikation Fitness 20. Die in diesem Protokoll verwendeten PCR-basierten Klonierungsverfahren bietet mehr Flexibilität bei der Auswahl der Klonierungsstellen, im Vergleich zu basierte Klonen Restriktionsstelle. Allerdings nimmt die Effizienz der PCR-Klonierung wie die Insertgröße zunimmt. Die Stromgrenze des Einsatzes Größe ist ~ 5 kb 34. Für die PCR-basierte Klonen und die Website geleitet mutagenesis, ist die Verwendung eines High-Fidelity-DNA-Polymerase entscheidend, um die Wahrscheinlichkeit von zusätzlichen Mutationen, zu verringern. Verwendung der minimalen Anzahl von PCR-Zyklen erforderlich, um ausreichende Mengen an Produkten zu ergeben wird auch empfohlen. Nach unserer Erfahrung haben wir keine zusätzlichen Mutationen nach den hier beschriebenen PCR-basierte Klonen und ortsgerichtete Mutagenese Schritte zu erkennen. Dennoch sollte die PCR-Produkte sequenziert, um für jegliche unerwünschte Mutationen zu überprüfen. Idealerweise sollte die gesamte HIV kodierende Region erneut sequenziert werden. Mindestens drei Abtastzeitpunkte innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase 9 untersucht werden. Die viralen Wachstumskinetik muss zuvor mit täglichen Probenahme, um die entsprechenden Kulturdauer und Abtastzeitpunkte für das Wachstum Wettbewerb festzustellen, festgelegt werden. Ein Faktor, der die virale Wachstumskinetik beeinflusst, ist die Multiplizität der Infektion (MOI). Dieses Protokoll verwendet insgesamt MOI von 0,005 für beide Monoinfektion und Wachstum Wettbewerb, wie es dargestellt wurde, um mehr zu erhalten roBüste Ergebnisse als untere MOIs 9. Dennoch kann unteren MOIs verwendet werden, um eine längere Phase exponentiellen Wachstums falls erforderlich zu erhalten, aber auf Kosten der Folge Konsistenz. Dieses Protokoll legt eine erste Infektion Verhältnis von 50:50, unter der Annahme, dass das Fitness Unterschiede der Viren sind in der Regel nicht im voraus. Die Verwendung von ungleichen Eingangsverhältnisse sind jedoch geeignet, wenn es vorläufige Daten, die auf signifikante Unterschiede in der Kinetik der viralen Replikation. In diesen Fällen ist eine Infektion von 70:30 empfohlen, für die Erfassung eines großen Fitness Unterschied wo die weniger fit Virus im Überschuß 9 platziert ermöglichen. Das Protokoll für die Bestimmung der TCID 50, virale Wachstumskinetik und zur Durchführung der Wachstums Kompetitionstests wurden optimiert unter Verwendung von HIV-1 Subtyp B haben NL4-3 COTB-p24 und PBMCs von einem einzelnen Spender, deren PBMC konsistent Empfindlichkeit nachgewiesen, HIV- 1-Infektion in vitro. Die Kulturzeitund Abtastzeitpunkten in diesem Protokoll dargestellt sind wahrscheinlich für das Studium von HIV-1 Gruppe M-Viren in menschlichen PBMCs sein. Verwenden von PBMCs aus einer Hand ist sehr zu empfehlen, um konsistente Ergebnisse zu erhalten, wie die Virusreplikation in verschiedenen Spenderzellen 35 variieren. Obwohl weniger wünschenswert, kann PBMCs von mehreren Spendern gebündelt eingesetzt werden als Ersatz zur Verfügung gestellt, dass der gleiche Pool ist in allen Versuchen verwendet. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von Zelllinien. Die hier vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich mit der T-Zelllinie CEM × 174 23,36 verwendet. Es ist jedoch wichtig, dass die Anzahl von Zellen ausgesät werden neu optimiert werden, um konsistente Zellwachstum zu erzielen. Viral Wachstumskinetik muss auch wieder hergestellt werden, da sie wahrscheinlich in verschiedenen Zelllinien variieren, um die entsprechenden Abtastzeitpunkten in den Wachstums Wettbewerb Schritte zu bestimmen. Zwei verschiedene Methoden, um die virale Verhältnis zur Berechnung Fitness zu bestimmen sind in der Protok inbegriffenol. Die erste nutzt RT-qPCR, um virale cDNA Kopienzahl zu jedem Probenahmezeitpunkt zu messen. Virusreplikation Fitness wurde dann aus dem viralen Verhältnisses berechnet, basierend auf cDNA-Kopie-Nummer. Alternativ kann die virale Verhältnis basierend auf dem Verhältnis der Peakhöhe bei Chromatogramm der VifAB tag Sites bestimmt werden. Die beiden Verfahren ergab vergleichbare Ergebnisse (Figur 4). Das Chromatogramm-Peakhöhe Verfahren auf andere HIV-1-Stämme ohne konstruiert Sequence Tag angewendet werden. Für RT-qPCR, die Verwendung von Primern oder Sonden zu Virusvarianten unterscheiden muss zunächst sorgfältig geprüft werden (siehe 20). Dennoch bietet RT-qPCR bessere Empfindlichkeit für Proben mit einer geringen Menge an viraler RNA, wie die von dem ersten Zeitpunkt in der exponentiellen Wachstumsphase. Direkte Messung der viralen cDNA ermöglicht auch Detektions technischer Probleme, die von der RNA-Extraktion und cDNA-Synthese entstehen können. Mit molekular Klone mit Sequenz-Tags bietet eine kostengünstige Lösung to die RT-qPCR Verfahren, da nur zwei Paare von Primern und Sonden benötigt werden, um mehrere Viren zu studieren. Diese Strategie vermeidet auch das Problem der Spitzenhöhenvariation nacheinander Chromatogramme durch benachbarte Basen 37, die Sequenzierung wird an der gleichen Stelle für alle Viren in der Studie durchgeführt. Die für die RT-qPCR und Sanger-Sequenzierung hergestellt PCR-Produkte können auch Verwendung bei anderen Methoden zur viralen Verhältnis zu bestimmen, wie Schütt Sequenzierung von einzelnen Klonen 12,13 HTA 4,7,17,19 oder Oligonukleotid-Ligation-Assay (OLA) 38 .

Virale Replikation Fitness ist als die Fähigkeit eines Virus der infektiösen Nachkommen in einer bestimmten Umgebung 1 produzieren definiert und ist ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Prävalenz von einer Virusvariante auf Bevölkerungsebene im Laufe der Zeit 2. In vivo-Studien Fitness nicht machbar mit humanpathogenen Viren, wie HIV-1, verschiedene in vitro und ex vivo-Replikation Fitness Assays wurden entwickelt, um die Auswirkungen auf die Eignung, die aus Arzneimittelresistenz und Immun-Escape-Mutationen epistasis und der Entwicklung zu untersuchen viraler Populationen 3-6. Unter den verschiedenen Fitness Assays werden Wachstums Kompetitionstests erkannt empfindlicher und gültig Maßnahmen Kondition Unterschiede ergeben, da zwei oder mehrere virale Varianten konkurrieren um die gleiche Zellpopulation unter exakt denselben Umweltbedingungen wie in vivo 1,7,8 auftritt. Vor Beginn der Wachstums Kompetitionsexperimente mehrere variables muss bestimmt werden, einschließlich der Verwendung von verschiedenen Multiplizitäten der Infektion (MOI), virale Eingangsverhältnis, und der Zeitpunkt der Probenahme für die Analyse. Wir haben die Auswirkungen dieser Parameter auf die virale Wachstumskinetik und auf das Ergebnis der Konkurrenzexperimenten studiert und haben wichtige Faktoren für robuste Messungen von HIV-1 Fitness erforderlich in Zellkultur 9 identifiziert. Zusätzlich zum Test Variablen gibt es eine Vielzahl von Verfahren zur Quantifizierung Virusvarianten in Wachstums Kompetitionsexperimenten. Bulk 10,11 oder 12,13 klonale Sequenzierung wurde verwendet, um das Verhältnis der konkurrierenden Viren auf der Grundlage der Nucleotid-Frequenzen an der Stelle (n) von Interesse zu bestimmen. Relative Fitness von Änderungen in diesem Verhältnis im Laufe der Zeit ab. Dieses Verfahren ist praktisch, da die DNA-Sequenzierung Dienstleistungen sind überall erhältlich. Die parallele allelspezifische Sequenzierung (PASS) Verfahren ermöglicht die Sequenzierung an mehreren Standorten und den Nachweis von Rekombinanten 14 </sup&gt;, Aber es erfordert auch speziell entwickelten Reagenzien und Nachweissystemen. Im Wesentlichen wurden diese Methoden entwickelt, um Virusstämme mit einer geringen Anzahl von Nukleotid-Differenzen in einer Region von Interesse zu untersuchen. Andere Methoden mit einem kleinen Reporter-Gen 15 oder auch Mutationen 4,16-18 als Tags, die konkurrierenden Viren durch Sequenzierung, Heteroduplex-Tracking-Tests (HTA) 4,7,17,19 unterscheiden oder reverse Transkription-quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) 15,16,18,20, von denen alle für studieren konkurrierenden Stämme unabhängig von Sequenzähnlichkeit werden. Ein zusätzlicher Schritt ist erforderlich, um Tags in virale Genome einführen und die RT-qPCR-Assay erfordert auch spezifische Reagenzien und Instrumentierung. Wir haben festgestellt, daß Schütt Sanger Sequenzierung Ausbeuten 9 vergleichbare Ergebnisse. Nach einem Wachstum Wettbewerb wird die virale Replikation Fitness als relative Fitness, oder ein Fitness-Verhältnis zwischen t vorgestelltwo Virusvarianten. Die relative Eignung eines Virus kann als der endgültige Anteil einer Virusvariante durch die ursprüngliche Anteil im Inokulum oder als die Netto-Wachstumsrate Differenz zwischen den zwei konkurrierenden Viren normalisiert definiert werden. Wir fanden, dass das letztgenannte Verfahren, mit Längsdatenpunkte nur in der exponentiellen Wachstumsphase, erzeugt die robustesten Ergebnisse 9,20. In-vitro-Assays Fitness in erster Linie verwendet werden, um biologische Klone 6-8 und infektiöse molekulare Klone von HIV-1 zu untersuchen. Letzteres ist zugänglich Genmanipulation werden oft eingesetzt, um die Wirkung auf die Eignung von bestimmten Mutationen oder spezifische Sequenzen von Interesse 3-5,21,22 studieren. Die folgenden Protokolle beschreiben einen Workflow unter dem Aspekt der Bau neuer voller Länge infektiösen HIV-1 molekulare Klone mit HIV-1-Vektoren, die eine Sequenz-Tag, die Einführung von Mutationen von Interesse, so dass virale Bestände und zur Errichtung virale Wachstum KinetikZur Durchführung der Wachstums Kompetitionsassays und die Berechnung der relativen fitness (Abbildung 1). Mit unserer optimierten Verfahren, wir drei rekombinanten HIV-1-Mutanten erzeugt und bestimmt ihre Replikation Fitness. Das rekombinante molekularen Klon wurde zuerst durch Ersetzen des HIV-1 gag-p24-Genregion pNL4-3, einem Plasmid, das ein Volllängen-infektiöse Genom des HIV-1-Stamm NL4-3 Labor, mit einem synthetischen COTB (Mitte-of konstruiert Baum, Subtyp B) gag-p24-Sequenz 23, um den Prototyp-Stamm zu erstellen. Einzel amino Änderungen (T186M, T242N und I256V) wurden dann eingebracht, um drei mutierten Klone erstellen. Jede Mutante wurde gegenüber dem Prototyp-Virus konkurrierten um die Fitness Auswirkungen der einzelnen Mutation im gegebenen genetischen Hintergrund zu beobachten. Die drei Mutanten demonstrierten unterschiedlichem Replikation fsitness von gering bis deutlich niedriger als der Prototyp-Virus. Die T242N Mutation wurde bereits berichtet, eine moderate fitne habenss kosten 24-26, ähnlich zu dem in dieser Untersuchung gezeigte Ergebnis. Der Fitnesskosten der anderen zwei Mutationen zuvor nicht berichtet worden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:484px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:196px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Construction of recombinant clones</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid</td>
			<td style="width:484px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-fidelity buffer</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems&#174; GeneAmp&#174; PCR System 9700</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA loading dye</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">DpnI enzyme</td>
			<td style="width:484px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TOP10 chemically competent Escherichia coli</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Luria Broth base powder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:484px;">Research Products International</td>
			<td style="width:137px;">C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEK 293T-17</td>
			<td style="width:484px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">CRL-11268</td>
			<td>http://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.22um filter top tube</td>
			<td style="width:484px;">VWR International</td>
			<td>89220-716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#8242;s Modified Dulbecco&#8242;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phytohemagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Human Interleukin-2</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>11147528001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:484px;">JR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">43640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:484px;">Corning Cellgro</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">62407-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td style="width:137px;">T-3015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well round-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:137px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:484px;">Mt. Baker Bio</td>
			<td style="width:137px;">MBD-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 mL tubes w/ O-ring</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td>C-3317-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">glycerol</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tween 20</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td>
			<td style="width:484px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:137px;">4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">52-00-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HIV p24 standard</td>
			<td style="width:484px;">AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:484px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA isolation cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxtractor</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">SuperscriptIII</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">First-strand buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Rnase inhibitor</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RnaseH</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18021-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Real-time qPCR machine</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan&#174; Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Forward, reverse primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Probe</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">optical 96 well reaction plate</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">I19N3Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR+sequencing</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Taq DNA polymerase (Biolase)</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NH4 buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgCl2</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sequencing primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxcel</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA sequencing service provider</td>
			<td>http://www.htseq.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GRC web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ChromatQuan web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pairwise growth competition assay for determining the replication fitness of human immunodeficiency viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Um die Fitness Auswirkungen der einzelnen Aminosäureänderungen in HIV-1 Gag p24-Studie verwendeten wir Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese, um Mutationen in ein pNL4-3 Plasmid, das die HIV-1-p24-Gen COTB 23,32,33 einzuführen. Virusstammlösungen wurden durch Transfektion von 293T-Zellen erzeugt, und nach 48 h geerntet. Wir schätzten die 50% Gewebekulturinfektionsdosis (TCID 50) jedes virale Stamm durch die Reed-Muench-Methode 31. Die TCID 50 des Prototyps und Mutantenviren reichten von 10. April - 10. MAI IU / ml (Abbildung 3a). Die Wachstumskinetik der rekombinanten Viren wurden in PBMCs aus einem einzigen Spender bei einer MOI von 0,005 hergestellt. RT-qPCR wurde verwendet, um virale cDNA Kopienzahl täglich für sechs Tage zu messen. Alle Mutanten und Prototypen Viren wuchs exponentiell zwischen Tag 2 und Tag 4, wonach das virale Wachstum verlangsamt, wie durch eine verringerte Neigung der Virus-RNA-Kopienzahl erhöhen (angegeben &lt;strong&gt; 3B). Die Abnahme der cDNA-Kopienzahl zwischen Tag 0 (entsprechend dem Inokulum) und am Tag 2 aufgrund der Absorption von Virus an Zellen und die Entfernung von ungebundenem Virionen von Tag zu Tag 1 Wäsche (Schritt 5.1.6) ist. In der exponentiellen Wachstumsphase, hatten alle drei Mutanten eine langsamere Wachstumsrate (g) als das Prototyp-Virus (Abbildung 3c). Alle drei Mutanten wurden gegenüber dem Prototyp-Virus in Wachstums Kompetitionsassays an insgesamt MOI von 0,005 konkurrierten. Virale Wachstumskinetik in doppelt infizierten Kulturen waren ähnlich der Monoinfektion; das virale exponentiellen Wachstumsphase wurde zwischen den Tagen 2 und 4 und das Viruswachstum ein Plateau um Tag 5 (4A). Virale Wachstum Unterschiede wurden aus der Änderung in der viralen Verhältnis über die Zeit abgeleitet wird. Die virale Verhältnis wurde auf Basis von cDNA Kopienzahl der Referenz und den mutierten Viren unter Verwendung von RT-qPCR, und durch Vergleichen Spitzenhöhen berechnetnacheinander Chromatogramme bei Nukleotid Sites Unterscheidung der zwei Viren (4B). Die Wachstumsdifferenzen unter Verwendung des Spitzenhöhe und Virus-RNA-Kopienzahl Methoden ergab ähnliche Ergebnisse (4C). Alle drei Mutanten hatten niedrigere Replikation Fitness als die Prototypen-Viren mit dem mutierten I256V mit der niedrigsten Fitness (4C). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Abbildung 1: Flussdiagramm der Protokolle in diesem Papier Das Virus Vorbereitung Protokolle Sorge Bau von HIV-1 rekombinanten Klonen und die Erzeugung von Virusbestände.. Der Fitness-Assays Protokolle sind für die Festlegung virale Wachstum Kinetik und Bestimmung der relativen viralen Fitness. Gestrichelten Linien alternative Strömungen für die Protokolle. Zum Beispiel kann eine Mutation direkt in HIV-1 NL4-3 eingeführt werdenmolekularen Klon ohne Erzeugung eines rekombinanten Klons. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Abb. 2: Der Bau der HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 rekombinante molekulare Klone mit Overlap-Extension-PCR (A) Gestalten Sie die chimären Primer. Die 5&#39;-Hälften der Primer enthalten die NL4-3 Vektorsequenz und dem 3&#39;-Hälften enthalten die Enden des Einsatzes Folge. (B) chimäre Primer werden verwendet, um die Insertfragment, COTB Gag-p24 zu verstärken. (C) Die Insert-Fragmente als Primer für eine zweite PCR verwendet, um ein neues rekombinantes Plasmid zu erzeugen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Abb. 3: Viral Wachstumseigenschaften in PBMCs (A) Log 10 TCID 50 </sub&gt; viraler Aktien. (B) Viral Wachstumskinetik in Monoinfektionen bei einer MOI = 0.005 begonnen. (C) Viral Wachstumsraten über sechs Tagen, einschließlich der exponentiellen Wachstumsphase (Tage 2-4) von der Platte (B) abgeleitet ist. Die gezeigten Werte stellen den Durchschnitt von drei Replikaten von einem Experiment. Die Fehlerbalken stellen 95% Konfidenzintervall. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Abbildung 4: Viral Wachstum und relative Fitness-Bestimmungen (A) das virale Wachstum in doppelt infizierten PBMC-Kulturen.. (B) Verhältnisse von T242N und Prototypen Viren bestimmt mittels RT-qPCR oder die Sequenzierung Spitzenhöhe Methode. (C) Net virale Wachstum Unterschiede (d) zwischen der Mutante und der Prototyp-Viren in doppelt infizierten Kulturen, wie in (A) gezeigt. d Werte f berechnetROM Die in (B) gezeigt, virale Verhältnisdaten. Die gezeigten Werte stellen den Durchschnitt von drei Replikaten von einem Experiment. Die Fehlerbalken stellen 95% Konfidenzintervall.

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Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Aufrufe.  University of Washington. Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.