These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington&#8217;s Center for AIDS Research (P30 AI027757).

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Las opiniones expresadas aquí son las de los autores y no deben interpretarse como oficial o que representa los puntos de vista del Departamento de Defensa de Estados Unidos o del Departamento del Ejército.

Los protocolos presentados consistían en dos partes principales: la construcción del VIH-1 clones moleculares recombinantes y ensayos de competición crecimiento. A fin de distinguir dos virus en un cultivo celular doblemente infectada, es importante que los clones moleculares que compiten contienen etiquetas de secuencias, que pueden ser detectados por un ensayo de cebador-sonda RT-qPCR o por secuenciación de Sanger. Este protocolo hace uso de las etiquetas Vifa y VifB, que ocupan la misma región del VIH-1 NL4-3 vif y codifican la misma secuencia de aminoácidos pero que difieren por seis mutaciones sinónimas. Estas mutaciones se muestran no afectar gimnasio replicación viral 20. El método de clonación basada en PCR utilizada en este protocolo proporciona una mayor flexibilidad en la selección de sitios de clonación, en comparación con la clonación basada sitio de restricción. Sin embargo, la eficiencia de la clonación PCR disminuye a medida que aumenta el tamaño de inserción. El límite actual del tamaño de inserto es de ~ 5 kb 34. Para la clonación basada en PCR y sitios dirigida mutagenesis, el uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad es crucial para reducir la probabilidad de mutaciones adicionales. También se recomienda el uso del número mínimo de ciclos de PCR necesarios para producir cantidades adecuadas de productos. En nuestra experiencia, no detectamos ningún mutaciones adicionales después de los pasos de clonación y mutagénesis dirigida al sitio basados ​​en PCR que aquí se describen. Sin embargo, los productos de PCR deben ser secuenciados para comprobar que no existen mutaciones indeseadas. Idealmente, toda la región de codificación de VIH debe ser resequenced. Por lo menos tres puntos de tiempo de muestreo deben ser examinados dentro de la fase de crecimiento exponencial 9. La cinética de crecimiento viral primero deben establecerse mediante muestreo diario para determinar el período de la cultura y el tiempo de muestreo apropiadas puntos para el concurso de crecimiento. Un factor que afecta a la cinética de crecimiento viral es la multiplicidad de infección (MOI). Este protocolo utiliza un total de 0,005 MOI tanto para monoinfección y la competencia de crecimiento, como se demostró para producir más roresultados busto que baja MOI 9. No obstante, las MOI inferiores se pueden utilizar para obtener una fase de crecimiento exponencial ya si es necesario, pero a expensas de la consistencia resultado. Este protocolo sugiere una relación de la infección inicial de 50:50, suponiendo que las diferencias de aptitud de los virus son generalmente desconocido de antemano. Sin embargo, el uso de relaciones desiguales de entrada son apropiadas cuando hay datos preliminares que sugieren diferencias significativas en la cinética de la replicación viral. En estos casos, se recomienda una proporción de infección de 70:30 a permitir la detección de una diferencia grande de la aptitud donde el virus menos aptos se coloca en exceso 9. El protocolo para la determinación de la TCID 50, la cinética de crecimiento viral, y para llevar a cabo el crecimiento ensayos de competición se optimizaron usando el VIH-1 subtipo B, NL4-3 COTB-p24, y PBMCs de un único donante cuya PBMC han demostrado susceptibilidad consistente para el VIH 1 infección in vitro. El período de cultivoy los puntos de tiempo de muestreo presentados en este protocolo es probable que sean adecuados para el estudio de VIH-1 grupo M virus en PBMC humanas. El uso de PBMCs de una sola fuente es muy recomendable para obtener resultados consistentes como la replicación viral puede variar en diferentes células del donante 35. Aunque menos deseable, PBMCs agrupados a partir de múltiples donantes se pueden utilizar como una sustitución, siempre que la misma agrupación se utiliza en todos los experimentos. Otra alternativa es el uso de líneas celulares. El protocolo que aquí se presenta se utilizó con éxito con la línea de células T CEMx174 23,36. Sin embargo, es importante que el número de células sembradas son re-optimizados para lograr un crecimiento celular consistente. Cinética de crecimiento viral también deben ser restablecidos, ya que es probable que varíe en diferentes líneas celulares, para determinar los puntos de tiempo de muestreo apropiados en los pasos de competencia crecimiento. Dos métodos diferentes para determinar la relación viral para el cálculo de fitness están incluidas en el protocol. El primero utiliza RT-qPCR para medir el número de copias de ADNc viral en cada punto de tiempo de muestreo. A continuación, la aptitud replicación viral se calcula a partir de la relación viral, basado en el número de copias de ADNc. Alternativamente, la relación viral puede ser determinado basado en la relación de altura del pico del cromatograma en los sitios de la etiqueta VifAB. Los dos métodos dieron resultados comparables (Figura 4). El método de la altura del pico del cromatograma se puede aplicar a otras cepas del VIH-1 sin una etiqueta de secuencia de ingeniería. Para RT-qPCR, el uso de cebadores o sondas para distinguir variantes virales primero debe ser evaluado cuidadosamente (ver 20). Sin embargo, RT-qPCR proporciona una mejor sensibilidad para muestras con una pequeña cantidad de ARN viral, tales como los que desde el primer punto de tiempo dentro de la fase de crecimiento exponencial. La medición directa de ADNc viral también permite la detección de los problemas técnicos que puedan surgir de la extracción de RNA y la síntesis de ADNc. Usando clones moleculares con etiquetas de secuencias proporciona una solución rentable to los métodos de RT-qPCR, como sólo se necesitan dos pares de cebadores y sondas para estudiar múltiples virus. Esta estrategia también evita el problema de la variación de altura de pico en la secuencia de cromatogramas debido a bases vecinos 37, como la secuenciación se realiza en el mismo sitio a través de todos los virus en el estudio. Los productos de PCR producidos por RT-qPCR y secuenciación Sanger también pueden estar en uso con otros métodos para determinar la relación viral como la secuenciación mayor parte de clones individuales 12,13, HTA 4,7,17,19, o ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA) 38 .

Aptitud La replicación viral se define como la capacidad de un virus para producir progenie infecciosa en un ambiente dado 1 y es un importante factor que contribuye a determinar la prevalencia de una variante del virus en la población a través del tiempo 2. Al igual que en estudios in vivo de la aptitud no son factibles con virus patógenos humanos, como el VIH-1, varios in vitro y ex vivo ensayos de aptitud de replicación se han desarrollado para estudiar los efectos sobre la aptitud derivadas de resistencia a los medicamentos y las mutaciones de escape inmune, epistasis y la evolución de las poblaciones virales 3-6. Entre los diferentes ensayos de aptitud, ensayos de competición de crecimiento se reconocen para producir medidas más sensibles y válidos de diferencias de aptitud, como dos o más variantes virales compiten por la misma población celular bajo exactamente las mismas condiciones ambientales, como ocurre en vivo 1,7,8. Antes de comenzar los experimentos de competición de crecimiento, varios variables necesita ser determinado, incluyendo el uso de diferentes multiplicidades de infección (MOI), la relación de entrada viral, y el tiempo de muestreo para el análisis. Hemos estudiado los efectos de estos parámetros en la cinética de crecimiento virales y sobre los resultados de los experimentos de competición, y hemos identificado los factores clave necesarios para las mediciones robustas de VIH-1 de la aptitud en el cultivo celular 9. Además de las variables de ensayo, hay una variedad de métodos para la cuantificación de variantes virales en experimentos de competición crecimiento. Bulk 10,11 o 12,13 secuenciación clonal se ha utilizado para determinar la relación de los virus que compiten sobre la base de las frecuencias de nucleótidos en el sitio (s) de interés. Aptitud relativa se deriva de cambios en esta relación con el tiempo. Este método es conveniente como servicios de secuenciación de ADN están ampliamente disponibles. El método (PASS) específica de alelo secuenciación paralela permite la secuenciación en múltiples sitios y la detección de recombinantes 14 </sup&gt;, Pero también requiere reactivos desarrollados específicamente y sistemas de detección. Esencialmente, se desarrollaron estos métodos para estudiar las cepas virales con un pequeño número de diferencias de nucleótidos en una región de interés. Otros métodos utilizan un pequeño gen reportero de 15 o sinónimo mutaciones 4,16-18 como etiquetas para distinguir los virus que compiten por la secuenciación, análisis de seguimiento de heterodúplex (HTA) 4,7,17,19 o revertir en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción cuantitativa (RT-qPCR) 15,16,18,20, todos los cuales pueden ser aplicables para estudiar cepas competir independientemente de similitud de secuencia. Se requiere un paso adicional para introducir etiquetas en los genomas virales y el ensayo de RT-qPCR también requiere reactivos e instrumentación específicos. Hemos encontrado que los rendimientos de secuenciación de Sanger a granel resultados comparables 9. A raíz de la competencia el crecimiento, la aptitud replicación viral se presenta como la aptitud relativa, o una relación de la aptitud entre two variantes virales. La aptitud relativa de un virus se puede definir como la proporción final de una variante viral normalizado por su proporción en el inóculo inicial o como la diferencia tasa de crecimiento neto entre los dos virus en competencia. Hemos encontrado que el último método, usando puntos de datos longitudinales sólo dentro de la fase de crecimiento exponencial, produjo los resultados más robustos 9,20. En ensayos in vitro de la aptitud se utilizan principalmente para estudiar clones biológicos 6-8 y clones moleculares infecciosos del VIH-1. Este último, al ser susceptibles de manipulación genética, se emplean a menudo para estudiar el efecto sobre la aptitud de mutaciones particulares o secuencias específicas de interés 3-5,21,22. Los siguientes protocolos describen un flujo de trabajo desde el punto de construcción de nuevo de larga duración infecciosas del VIH-1 clones moleculares usando 1-VIH vectores que contienen una etiqueta de secuencia, la introducción de mutaciones de interés, por lo que las poblaciones virales y el establecimiento de la cinética de crecimiento virales, Para realizar el ensayo de competición crecimiento y el cálculo de la aptitud relativa (Figura 1). El uso de nuestros procedimientos optimizados, creamos tres recombinantes del VIH-1 mutantes y se determinó su estado físico replicación. El clon molecular recombinante se construyó primero mediante la sustitución del VIH-1 gag-p24 región del gen de pNL4-3, un plásmido que contiene una longitud de genoma completo infeccioso del VIH-1 NL4-3 cepa de laboratorio, con un COTB sintético (Center-cina Árbol, subtipo B) secuencia gag-p24 23 para crear la cepa prototipo. Cambios aminoácidos individuales (T186M, T242N, y I256V) se introdujeron a continuación para crear tres clones mutantes. Cada mutante se compitió contra el virus prototipo para observar el impacto de la aptitud de cada mutación en el fondo genético determinado. Los tres mutantes demostraron diferentes niveles de fsitness replicación de leve a significativamente menor que el virus prototipo. La mutación T242N se informó anteriormente para tener un fitne moderadass cuesta 24-26, similar al resultado se muestra en este estudio. El costo de la aptitud de las otras dos mutaciones no había sido informado previamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:484px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:196px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Construction of recombinant clones</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid</td>
			<td style="width:484px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-fidelity buffer</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems&#174; GeneAmp&#174; PCR System 9700</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA loading dye</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">DpnI enzyme</td>
			<td style="width:484px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TOP10 chemically competent Escherichia coli</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Luria Broth base powder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:484px;">Research Products International</td>
			<td style="width:137px;">C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEK 293T-17</td>
			<td style="width:484px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">CRL-11268</td>
			<td>http://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.22um filter top tube</td>
			<td style="width:484px;">VWR International</td>
			<td>89220-716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#8242;s Modified Dulbecco&#8242;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phytohemagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Human Interleukin-2</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>11147528001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:484px;">JR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">43640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:484px;">Corning Cellgro</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">62407-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td style="width:137px;">T-3015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well round-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:137px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:484px;">Mt. Baker Bio</td>
			<td style="width:137px;">MBD-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 mL tubes w/ O-ring</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td>C-3317-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">glycerol</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tween 20</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td>
			<td style="width:484px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:137px;">4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">52-00-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HIV p24 standard</td>
			<td style="width:484px;">AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:484px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA isolation cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxtractor</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">SuperscriptIII</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">First-strand buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Rnase inhibitor</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RnaseH</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18021-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Real-time qPCR machine</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan&#174; Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Forward, reverse primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Probe</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">optical 96 well reaction plate</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">I19N3Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR+sequencing</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Taq DNA polymerase (Biolase)</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NH4 buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgCl2</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sequencing primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxcel</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA sequencing service provider</td>
			<td>http://www.htseq.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GRC web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ChromatQuan web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pairwise growth competition assay for determining the replication fitness of human immunodeficiency viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Para estudiar el impacto de la aptitud de los cambios de aminoácidos individuales en el VIH-1 Gag-p24, utilizamos oligonucleótido mutagénesis dirigida para introducir mutaciones en un plásmido pNL4-3 contiene el VIH-1 COTB-p24 gen 23,32,33. Stocks virales se generaron mediante transfección de células 293T y se recogieron después de 48 hr. Estimamos el cultivo de tejidos dosis infecciosa 50% (DICT50) de cada acción viral por el método de Reed-Muench 31. La TCID 50 del prototipo y los virus mutantes variaron de 04 10 hasta 5 10 UI / ml (Figura 3A). La cinética de crecimiento de los virus recombinantes se establecieron en PBMCs de un solo donante a una MOI de 0,005. RT-qPCR se utilizó para medir el número de copias de ADNc viral al día durante seis días. Todos los virus mutantes y de prototipo crecieron de manera exponencial entre el día 2 y día 4, después de lo cual se redujo el crecimiento viral, tal como se indica por una disminución de la pendiente del número de copias de ARN viral aumento (&lt;strong&gt; Figura 3B). La disminución en el número de copias de cDNA entre el día 0 (correspondiente al inóculo) y día 2 se debe a la absorción de virus a las células y la eliminación de los viriones no unidas por el día 1 de lavado (etapa 5.1.6). En la fase de crecimiento exponencial, los tres mutantes tenían una tasa de crecimiento más lento (g) que el virus prototipo (Figura 3C). Los tres mutantes fueron compitieron contra el virus prototipo en ensayos de competición crecimiento a una MOI total de 0.005. Cinética de crecimiento viral en cultivos doblemente infectadas fueron similares a la de monoinfección; la fase de crecimiento exponencial viral fue entre los días 2 y 4, y el crecimiento viral llegó a una meseta alrededor del día 5 (Figura 4A). Las diferencias de crecimiento viral se derivaron del cambio en la relación viral con el tiempo. La relación viral se calculó basándose en el número de copias de ADNc de la referencia y los virus mutantes utilizando RT-qPCR, y al comparar alturas de los picosen secuencia cromatogramas en los sitios de nucleótidos que distinguen los dos virus (Figura 4B). Las diferencias de crecimiento determinado usando el pico de altura y métodos virales número de copias de ARN arrojado resultados similares (Figura 4C). Los tres mutantes tenían menor aptitud de replicación de los virus prototipo con el I256V mutante que tiene la aptitud más baja (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de flujo de los protocolos presentados en este documento La protocolos de preparación de la preocupación de la construcción del virus del VIH-1 clones recombinantes y la generación de las reservas virales.. Los protocolos de la aptitud para el establecimiento de ensayos son cinética de crecimiento viral y la determinación de la aptitud viral relativa. Las líneas discontinuas representan los flujos alternativos para los protocolos. Por ejemplo, una mutación puede introducirse directamente en el VIH-1 NL4-3clon molecular sin generar un clon recombinante. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Figura 2:. Construcción de VIH-1 NL4-3 COTB Gag-p24 clones moleculares recombinantes usando PCR de extensión por solapamiento (A) Diseño de los cebadores quiméricos. El 5 &#39;mitades de los cebadores contienen la secuencia del vector NL4-3 y el 3&#39; mitades contienen los extremos de la secuencia de inserción. (B) cebadores quiméricos se utilizan para amplificar el fragmento de inserción, COTB Gag-p24. (C) Los fragmentos de inserción se utilizan como cebadores para una segunda PCR para generar un nuevo plásmido recombinante. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Figura 3:. Características de crecimiento virales en PBMC (A) Log 10 DICT 50 </sub&gt; de las reservas virales. (B) la cinética de crecimiento viral en monoinfections comenzado en una MOI = 0,005. (C) las tasas de crecimiento viral de más de seis días, incluyendo la fase exponencial de crecimiento (días 2-4) derivado de panel (B). Los valores mostrados representan la media de tres repeticiones de un experimento. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Figura 4: crecimiento viral y de la aptitud relativa determinaciones (A) el crecimiento viral en cultivos de PBMC doblemente infectados.. (B) Las relaciones de los virus T242N y prototipos determinaron utilizando RT-qPCR o el método de secuenciación de pico de altura. Diferencias netas virales tasa de crecimiento (D) entre el mutante y los virus prototipo en cultivos doblemente infectadas (C), como se muestra en (A). Se calcularon los valores d fesde los datos de relación virales que se muestran en (B). Los valores mostrados representan la media de tres repeticiones de un experimento. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%.

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Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K vistas.  University of Washington. Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.