These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington&#8217;s Center for AIDS Research (P30 AI027757).

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Le opinioni qui espresse sono quelle degli autori e non devono essere interpretati come ufficiale o che rappresentano il punto di vista del Dipartimento della Difesa statunitense e il Dipartimento dell&#39;Esercito.

I protocolli presentati consisteva di due parti principali: costruzione di ricombinanti HIV-1 cloni molecolari e saggi di competizione crescita. Per distinguere due virus in coltura cellulare infettata doppiamente, è importante che i cloni molecolari concorrenti contengono tag di sequenza, che può essere rilevata da un RT-qPCR assay primer sonda o da Sanger sequenziamento. Questo protocollo fa uso di tag VIFA e VifB, che occupano la stessa regione del virus HIV-1 NL4-3 vif e codificano la stessa sequenza aminoacidica ma differiscono da sei mutazioni sinonimi. Queste mutazioni non hanno mostrato di influenzare virale replica fisica 20. Il metodo di clonazione PCR-based utilizzati in questo protocollo offre una maggiore flessibilità nella selezione dei siti clonazione, rispetto alla clonazione basata sito di restrizione. Tuttavia, l&#39;efficienza di clonazione PCR diminuisce all&#39;aumentare della dimensione dell&#39;inserto aumenta. Il limite di corrente della dimensione inserto è ~ 5 kb 34. Per clonazione PCR-based e sito diretto mutagenesis, l&#39;uso di una DNA polimerasi ad alta fedeltà è fondamentale per ridurre la probabilità di mutazioni supplementari. È anche raccomandato l&#39;uso di un numero minimo di cicli di PCR necessari a produrre adeguate quantità di prodotti. Nella nostra esperienza, non abbiamo rilevato alcun mutazioni in più dopo la clonazione e sito-passi mutagenesi basate sulla PCR qui descritti. Tuttavia i prodotti di PCR devono essere sequenziati per verificare eventuali mutazioni indesiderate. Idealmente, l&#39;intera regione codificante HIV dovrebbe essere resequenced. Almeno tre punti di tempo di campionamento dovrebbero essere esaminate entro la fase di crescita esponenziale 9. La cinetica di crescita virale devono prima essere stabilite mediante campionamento giornaliero di determinare il periodo della cultura e tempo di campionamento punti appropriati per il concorso di crescita. Un fattore che influenza la cinetica di crescita virale è la molteplicità di infezione (MOI). Questo protocollo utilizza un MOI totale di 0,005 per entrambi monoinfezione e la concorrenza la crescita, come è stato dimostrato per produrre più rorisultati busto di basso MOI 9. Tuttavia, MOI inferiore possono essere utilizzati per ottenere una fase di crescita esponenziale più se necessario, ma a scapito della consistenza risultato. Questo protocollo suggerisce un rapporto infezione iniziale di 50:50, supponendo che le differenze di idoneità dei virus sono generalmente sconosciuti anticipo. Tuttavia, l&#39;uso di tali rapporti ineguali sono appropriati quando ci sono dati preliminari suggeriscono differenze significative nella cinetica di replicazione virale. In questi casi, un rapporto di infezione di 70:30 è raccomandato per consentire il rilevamento di una grande differenza di fitness dove il virus meno allenati è posto in eccesso 9. Il protocollo per la determinazione della TCID 50, cinetica di crescita virale, e per l&#39;esecuzione di saggi di crescita della concorrenza sono stati ottimizzati utilizzando HIV-1 sottotipo B, NL4-3 COTB-p24 e PBMC da un singolo donatore il cui sangue periferico hanno dimostrato sensibilità coerente per HIV 1 infezione in vitro. Il periodo di colturae punti di tempo di campionamento presentate in questo protocollo sono suscettibili di essere adatto per studiare HIV-1 gruppo M virus in PBMC umani. Utilizzando PBMC da una singola fonte è altamente raccomandato per ottenere risultati coerenti come la replicazione virale può variare in diverse cellule del donatore 35. Sebbene meno desiderabile, PBMC raccolti da donatori multipli possono essere utilizzati come una sostituzione a condizione che la stessa piscina è utilizzata in tutti gli esperimenti. Un&#39;altra alternativa è l&#39;uso di linee cellulari. Il protocollo presentato qui è stato utilizzato con successo con la linea di cellule T CEMx174 23,36. Tuttavia, è importante che il numero di cellule seminate sono ri-ottimizzati per raggiungere la crescita delle cellule coerente. Cinetica di crescita virale devono essere ripristinati, in quanto può variare in diverse linee cellulari, per determinare i punti di tempo appropriati campionamento nei passaggi concorrenza crescita. Due metodi differenti per determinare il rapporto virale per calcolare fitness sono inclusi nel ProtoColo. Il primo utilizza RT-qPCR per misurare virale numero di copie di cDNA in ogni punto di campionamento. Viral idoneità replica stata quindi calcolata dal rapporto virale, basata sul numero di copia cDNA. In alternativa, il rapporto virale può essere determinato in base al rapporto tra l&#39;altezza di picco cromatogramma nei siti tag VifAB. I due metodi hanno fornito risultati comparabili (Figura 4). Il metodo altezza del picco cromatogramma può essere applicato ad altri ceppi HIV-1 senza un tag sequenza ingegnerizzato. Per RT-qPCR, l&#39;uso di primer o sonde per distinguere varianti virali deve prima essere attentamente valutato (vedi 20). Tuttavia, RT-qPCR conferendo una maggiore sensibilità per campioni con una piccola quantità di RNA virale, come quelli del primo punto temporale all&#39;interno della fase di crescita esponenziale. La misura diretta della cDNA virale permette anche la rilevazione di problemi tecnici che possono sorgere dalle operazioni di estrazione di RNA e sintesi del DNA. Utilizzo di cloni molecolari con sequence tags fornisce una soluzione conveniente to metodi RT-qPCR, come sono necessari solo due coppie di primer e sonde per studiare più virus. Questa strategia evita anche il problema della variazione di picco altezza in sequenza cromatogrammi causa di basi adiacenti 37, come sequenziamento viene eseguito nello stesso sito attraverso tutti i virus in studio. I prodotti di PCR prodotti per RT-qPCR e sequenziamento Sanger può anche essere utilizzato con altri metodi per determinare il rapporto virale, come massa sequenziamento del singolo clone 12,13, HTA 4,7,17,19 o saggio oligonucleotide legatura (OLA) 38 .

Viral idoneità replica è definita come la capacità di un virus per produrre progenie infettiva in un dato ambiente 1 ed è un fattore importante che contribuisce a determinare la prevalenza di una variante del virus a livello della popolazione nel tempo 2. Come studi in vivo di fitness non sono realizzabili con virus umani patogeni, come l&#39;HIV-1, vari in vitro e ex vivo replica dosaggi di fitness sono stati sviluppati per studiare gli effetti sul benessere derivanti dalla resistenza ai farmaci e le mutazioni di fuga del sistema immunitario, epistasi e l&#39;evoluzione delle popolazioni virali 3-6. Tra i diversi dosaggi di fitness, analisi della concorrenza crescita sono riconosciuti a produrre misure più sensibili e validi di differenze di fitness, come due o più varianti virali competono per la stessa popolazione di cellule sotto precisamente le stesse condizioni ambientali, come avviene in vivo 1,7,8. Prima di avviare esperimenti di competizione di crescita, molti variables necessario determinare, compreso l&#39;uso di diverse molteplicità di infezione (MOI), rapporto input virale, e tempi di campionamento per l&#39;analisi. Abbiamo studiato gli effetti di questi parametri sulla cinetica di crescita virale e sul risultato di esperimenti di competizione, e abbiamo individuato i fattori chiave necessari per le misure di resistenza del virus HIV-1 di fitness in coltura cellulare 9. In aggiunta alle variabili saggio, ci sono una varietà di metodi per la quantificazione varianti virali in esperimenti di competizione crescita. Bulk 10,11 o sequenziamento clonale 12,13 è stata utilizzata per determinare il rapporto dei virus concorrenti basati sulle frequenze nucleotidiche del sito (s) di interesse. Idoneità relativa è derivato da cambiamenti in questo rapporto nel tempo. Questo metodo è conveniente come servizi di sequenziamento del DNA sono ampiamente disponibili. Il metodo (PASS) allele-specifica sequenziamento parallelo permette il sequenziamento in più siti e l&#39;individuazione di ricombinanti 14 </sup&gt;, Ma richiede anche reagenti appositamente sviluppati e sistemi di rilevazione. Essenzialmente, questi metodi sono stati sviluppati per studiare ceppi virali con un piccolo numero di differenze nucleotidiche in una regione di interesse. Altri metodi usano un piccolo gene reporter 15 o sinonimi mutazioni 4,16-18 come tag per distinguere i virus concorrenti di sequenziamento, le analisi di monitoraggio eteroduplex (HTA) 4,7,17,19 o invertire in tempo reale reazione di trascrizione-quantitativo a catena della polimerasi (RT-qPCR) 15,16,18,20, ognuno dei quali può essere reso applicabile a studiare ceppi competere indipendentemente similarità di sequenza. Un passo ulteriore è necessario per introdurre modifiche in genomi virali e il saggio RT-qPCR richiede anche reagenti e strumentazioni specifiche. Abbiamo scoperto che il sequenziamento di massa rese Sanger risultati comparabili 9. A seguito di concorso crescita, virale idoneità replica viene presentata come il fitness parente, o un rapporto di idoneità tra two varianti virali. L&#39;idoneità relativa di un virus può essere definita come la percentuale finale di una variante virale viene normalizzato mediante la sua proporzione iniziale in inoculo o come la differenza netta tasso di crescita tra i due virus concorrenti. Abbiamo scoperto che il secondo metodo, utilizzando punti di dati longitudinali solo all&#39;interno della fase di crescita esponenziale, ha prodotto i risultati più robusti 9,20. In vitro fitness sono utilizzati principalmente per studiare cloni biologici 6-8 e cloni molecolari infettivi di HIV-1. Quest&#39;ultimo, essendo suscettibili di manipolazione genetica, sono spesso impiegati per studiare l&#39;effetto sulla forma fisica di particolari mutazioni o sequenze specifiche di interesse 3-5,21,22. I seguenti protocolli descrivono un flusso di lavoro dal punto di costruire nuovo full-length HIV-1 cloni molecolari infettivi usando HIV-1 vettori contenenti un tag sequenza, introducendo mutazioni di interesse, rendendo stock virali e stabilendo cinetica di crescita virale, Di eseguire il test concorso crescita e calcolando fitness relativa (Figura 1). Utilizzando i nostri procedure ottimizzate, abbiamo creato tre ricombinanti HIV-1 mutanti e determinato la loro idoneità replica. Il clone molecolare ricombinante è stato costruito sostituendo il gag-p24 regione HIV-1 gene di pNL4-3, un plasmide contenente un integrale genoma infettiva del virus HIV-1 ceppo NL4-3 laboratorio, con un COTB sintetico (Centro-Of Albero, sottotipo B) sequenza gag-p24 23 per creare il ceppo prototipo. Modifiche amminoacidi singoli (T186M, T242N e I256V) sono stati poi introdotti per creare tre cloni mutanti. Ogni mutante era gareggiato contro il virus prototipo per osservare l&#39;impatto idoneità di ogni mutazione nel data background genetico. I tre mutanti dimostrato una diversi livelli di replicazione fsitness da lieve a significativamente inferiore al virus prototipo. La mutazione T242N è stato precedentemente segnalato per avere è d moderatass costano 24-26, simile al risultato mostrato in questo studio. Il costo idoneità delle altre due mutazioni non era stato riportato in precedenza.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:484px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:196px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Construction of recombinant clones</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid</td>
			<td style="width:484px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-fidelity buffer</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems&#174; GeneAmp&#174; PCR System 9700</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA loading dye</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">DpnI enzyme</td>
			<td style="width:484px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TOP10 chemically competent Escherichia coli</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Luria Broth base powder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:484px;">Research Products International</td>
			<td style="width:137px;">C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEK 293T-17</td>
			<td style="width:484px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">CRL-11268</td>
			<td>http://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.22um filter top tube</td>
			<td style="width:484px;">VWR International</td>
			<td>89220-716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#8242;s Modified Dulbecco&#8242;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phytohemagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Human Interleukin-2</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>11147528001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:484px;">JR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">43640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:484px;">Corning Cellgro</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">62407-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td style="width:137px;">T-3015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well round-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:137px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:484px;">Mt. Baker Bio</td>
			<td style="width:137px;">MBD-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 mL tubes w/ O-ring</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td>C-3317-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">glycerol</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tween 20</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td>
			<td style="width:484px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:137px;">4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">52-00-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HIV p24 standard</td>
			<td style="width:484px;">AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:484px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA isolation cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxtractor</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">SuperscriptIII</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">First-strand buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Rnase inhibitor</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RnaseH</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18021-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Real-time qPCR machine</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan&#174; Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Forward, reverse primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Probe</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">optical 96 well reaction plate</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">I19N3Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR+sequencing</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Taq DNA polymerase (Biolase)</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NH4 buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgCl2</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sequencing primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxcel</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA sequencing service provider</td>
			<td>http://www.htseq.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GRC web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ChromatQuan web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pairwise growth competition assay for determining the replication fitness of human immunodeficiency viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Per studiare l&#39;impatto idoneità dei cambiamenti di aminoacidi singoli in HIV-1 Gag-p24, abbiamo usato oligonucleotide mutagenesi diretta a introdurre mutazioni in un plasmide pNL4-3 contenente il virus HIV-1 COTB-p24 gene 23,32,33. Scorte virali sono stati generati da trasfezione di cellule 293T e raccolte dopo 48 ore. Abbiamo stimato la dose del 50% coltura tissutale infettiva (TCID 50) di ciascun titolo virale con il metodo Reed-Muench 31. Il TCID50 del prototipo e virus mutanti variavano da 10 aprile - 10 MAGGIO UI / ml (Figura 3A). La cinetica di crescita del virus ricombinanti sono stati stabiliti in PBMC da un singolo donatore ad una MOI di 0,005. RT-qPCR è stato utilizzato per misurare il numero di copie virali cDNA al giorno per sei giorni. Tutti i virus mutanti e prototipi crescevano esponenzialmente tra il giorno 2 e il giorno 4, a seguito della quale la crescita virale rallentato, come indicato da una diminuita pendenza della crescita virale numero di copie di RNA (&lt;strong&gt; Figura 3B). La diminuzione cDNA numero di copie tra giorno 0 (corrispondente al inoculo) e il giorno 2 è dovuta all&#39;assorbimento di virus di cellule e la rimozione di virioni non legati dal giorno 1 di lavaggio (passo 5.1.6). Nella fase di crescita esponenziale, tutti tre mutanti avevano un tasso di crescita più lenta (g) che il virus prototipo (Figura 3C). Tutti e tre i mutanti sono stati gareggiato contro il virus prototipo nei test concorrenza crescita a un totale di 0.005 MOI. Cinetica di crescita virale in culture doppiamente infette erano simili a quelle di monoinfezione; la fase di crescita esponenziale virale era tra i giorni 2 e 4, e la crescita virale ha raggiunto un plateau intorno al giorno 5 (Figura 4A). Le differenze di crescita virale sono stati derivati ​​dalla variazione del rapporto virale nel tempo. Il rapporto virale è stato calcolato sulla base di cDNA numero di copie di riferimento e dei virus mutanti mediante RT-qPCR, e confrontando altezzein sequenza cromatogrammi in siti nucleotide distinguendo i due virus (Figura 4B). Le differenze di tasso di crescita determinati utilizzando la copia di RNA virale metodi numerici picco di altezza e hanno dato risultati simili (Figura 4C). Tutti e tre i mutanti avevano idoneità replica inferiore rispetto ai virus prototipo con il I256V mutante avere l&#39;idoneità più basso (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramma di flusso dei protocolli presentati in questo documento il virus protocolli Preparazione preoccupazione costruzione di HIV-1 cloni ricombinanti e la generazione di titoli virali.. I protocolli Assays fitness sono per stabilire cinetica di crescita virale e la determinazione fitness virale relativa. Le linee tratteggiate rappresentano flussi alternativi per i protocolli. Ad esempio, una mutazione può essere introdotto direttamente nella HIV-1 NL4-3clone molecolare senza generare un clone ricombinante. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Figura 2:. Costruzione di HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 cloni molecolari ricombinanti con estensione sovrapposizione PCR (A) Progettare i primer chimerici. Il 5 &#39;metà dei primer contengono la sequenza vettoriale NL4-3 e il 3&#39; metà contengono le estremità della sequenza dell&#39;inserto. (B) primer chimerici sono usati per amplificare il frammento dell&#39;inserto, COTB Gag-p24. (C) I frammenti inserti sono utilizzati come primers per una seconda PCR per generare un nuovo plasmide ricombinante. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Figura 3:. Caratteristiche di crescita virale in PBMC (A) Accedi 10 TCID 50 </sub&gt; delle scorte virali. (B) cinetica di crescita virale in monoinfections iniziato con un MOI = 0,005. (C) i tassi di crescita virale in sei giorni, compreso la fase esponenziale di crescita (2-4 giorni) derivato da pannello (B). I valori riportati rappresentano la media di tre repliche da un esperimento. Le barre di errore rappresentano 95% intervalli di confidenza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Figura 4: crescita virale e relativa idoneità determinazioni (A) la crescita virale in colture PBMC doppiamente infette.. (B) Rapporti di T242N e prototipo virus determinati con RT-qPCR o il metodo di sequenziamento picco altezza. (C) differenze nette virali tasso di crescita (d) tra il mutante ei virus prototipo in culture doppiamente infette, come illustrato in (A). d valori sono stati calcolati fROM i dati riportati in rapporto virale (B). I valori riportati rappresentano la media di tre repliche da un esperimento. Le barre di errore rappresentano 95% intervalli di confidenza.

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Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Views.  University of Washington. Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.