These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington&#8217;s Center for AIDS Research (P30 AI027757).

<ol>
	<li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival.">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li><li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+viral+emergence.">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38 (2010).</li><li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness:+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo.">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li><li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+(CTL)+response.">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365 (2009).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C:+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics.">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463 (2010).</li><li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes:+implications+for+the+epidemic.">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li><li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+infection/competition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression.">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li><li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes.">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li><li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses.">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li><li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q/E+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine.">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li><li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation.">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li><li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li><li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A,+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors,+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA(Lys,+3)+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency.">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li><li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted/founder+genome.">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li><li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay.">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li><li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and/or+reverse+transcriptase+variants.">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes:+fitness-balanced+escape.">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li><li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41.">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li><li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness.">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture.">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li><li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers.">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in.">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+conserved-element+vaccines:+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity.">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li><li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li><li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A.">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li><li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li><li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density.">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints.">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines.">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins.">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li><li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlap+extension+PCR+cloning:+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids.">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li><li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro.">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li><li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface.">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065 (2013).</li><li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing.">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li><li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies.">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim. Burada ifade edilen görüşler yazarlarına aittir ve resmi ya da ABD Savunma Bakanlığı ya da Ordu Bölümü görüşlerini temsil olarak ele alınmamalıdır.

rekombinant HIV-1 molekül klonlar ve büyüme rekabet deneyleri yapımı: sunulan protokoller iki ana bölümden oluşuyordu. Bir ikili olarak enfekte edilmiş hücre kültürü içinde iki virüs ayırt etmek amacıyla, rekabet eden moleküler klonlar, bir RT-qPCR primeri-prob deneyi ile veya Sanger dizileme ile tespit edilebilir dizi etiketleri, ihtiva etmesi önemlidir. Bu protokol, HIV-1 NL4-3 Vif aynı bölgesini işgal eder ve aynı amino asit dizisini kodlayan, ancak altı ayn mutasyonla Vifa ve VifB etiketler, kullanır. Bu mutasyonlar etkilemediği gösterilmiştir edildi Viral replikasyon spor 20. Bu protokolde kullanılan PCR bazlı klonlama yöntemi kısıtlama sitesi tabanlı klonlama ile karşılaştırıldığında, klonlama siteleri seçiminde daha fazla esneklik sağlar. Bununla birlikte, PCR klonlama etkinliği uç boyutu arttıkça azalmaktadır. insert büyüklüğü akım limiti ~ 5 kb 34 olduğunu. PCR bazlı klonlama ve bölgeye yönelik mutagenesi içins, yüksek sadakat DNA polimeraz kullanılması ekstra mutasyonların olasılığını azaltmak için çok önemlidir. Ürünlerin yeterli miktarda elde etmek üzere gerekli olan PCR döngüsü az sayıda kullanılması da tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, burada tarif edilen PCR bazlı klonlama ve site-directed mutagenesis adımlardan sonra, herhangi bir ilave mutasyonlar tespit etmedi. Yine PCR ürünleri istenmeyen mutasyonlar kontrol etmek için sıralı olmalıdır. İdeal olarak, tüm HIV kodlama bölgesi yeniden dizilmesi gerekir. En az üç numune alma zaman noktaları üstel büyüme fazında 9 içinde muayene edilmelidir. Viral büyüme kinetiği ilk büyüme yarışma için uygun kültür dönemi ve örnekleme zamanı noktalarını belirlemek için günlük örnekleme yöntemiyle kurulmalıdır. Viral büyüme kinetiği etkileyen bir faktör enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı) çokluğu olduğunu. Daha ro elde etmek üzere gösterildiği gibi bu protokol, monoinfection ve büyüme rekabet her ikisi için 0.005 bir toplam MOI kullanırAlt Mois 9 daha büstü sonuçlar. Bununla birlikte, alt Mois gerekirse daha uzun bir üstel büyüme fazı elde etmek için kullanılan, ancak sonuç kıvamında pahasına yapılabilir. Bu protokol virüslerinin spor farkları önceden genellikle bilinmemektedir olduğunu varsayarak, 50:50 başlangıç ​​enfeksiyon oranını göstermektedir. Viral replikasyon kinetiği önemli farklılıklar gösteren ilk veriler olduğunda Ancak, eşitsiz girdi oranlarının kullanılması uygundur. Bu gibi durumlarda, 70:30 bir enfeksiyon oranı daha az uygun bir virüs fazlalığı 9 yerleştirilir büyük bir spor farkın tespiti için ayrılması tavsiye edilir. viral büyüme kinetikleri, ve HIV-1 alt tip B kullanılarak rekabet tahlilleri optimize edilmiştir büyüme gerçekleştirmek için TCID50 belirlenmesi için protokol, PBMC, tek bir donörden NL4-3 COTB-p24 ve PBMC&#39;ler, HIV tutarlı duyarlılık göstermiştir in vitro olarak 1 enfeksiyonu. Kültür dönemive bu protokolde yer alan numune zaman noktaları, insan PBMC içinde, HIV-1 M grubu virüsleri incelemek için uygun olması muhtemeldir. Tek bir kaynaktan elde edilmiş PBMC&#39;ler kullanılarak yüksek viral replikasyon farklı bir donörden hücreleri 35 değişebilir tutarlı sonuçlar elde etmek için önerilmektedir. Bir ikame, aynı havuzu bütün deneylerde boyunca kullanıldığı sürece daha az tercih edilmesine rağmen, birden fazla vericilerden alınma toplanmış PBMC kullanılabilir. Diğer bir alternatif hücre çizgilerinin kullanımı. Burada sunulan protokol T-hücresi hattı CEMx174 23,36 ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bununla birlikte, tohumlanmıştır hücre sayısı yeniden optimize uyumlu hücre büyümesini başarmak için olması önemlidir. Büyüme rekabet adımlarla uygun örnekleme zamanı noktalarını belirlemek için, farklı hücre hatları değişir muhtemelen viral büyüme kinetikleri de, yeniden kurulmalıdır. Uygunluğu hesaplamak için viral oranını belirlemek için iki farklı yöntem protoc dahildirol. ilk önce, her bir numune toplama noktasında viral cDNA kopyası sayısı ölçmek için RT-qPCR kullanır. Viral replikasyon spor sonra cDNA kopyası sayısına bağlı viral oranı hesaplanmıştır. Alternatif olarak, virüs oranı VifAB etiketi bölgelerinde kromatogram tepe yüksekliğine oranı esas alınarak tespit edilebilir. iki yöntem benzer sonuçlar (Şekil 4) elde edildi. kromatogram doruk yüksekliği yöntemi tasarlanmış sekans etiketi olmadan diğer HIV-1 suşlarının uygulanabilir. RT-qPCR viral varyantları ayırt etmek primerler veya probların kullanımı ilk dikkatle değerlendirilmesi gerekmektedir İçin (20 bakınız). Bununla birlikte, RT-qPCR gibi üstel büyüme fazı içinde birinci zaman noktasında elde edilenler gibi viral RNA&#39;nın, az bir miktarda olan örnekler için daha iyi bir hassasiyet sağlar. Viral cDNA&#39;nın doğrudan ölçümü RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi ile ilgili ortaya çıkabilecek teknik sorunlar saptanmasını sağlar. Dizi etiketleri ile moleküler klonlar kullanma maliyetli bir çözüm sunar tRT-qPCR yöntemleri o gibi primerlerin ve probların iki çifti birden fazla virüs incelemek için ihtiyaç vardır. Bu strateji aynı zamanda sıralama çalışmada tüm virüsler arasında aynı sitede yapıldığı gibi sırayla tepe yüksekliği varyasyon problemi, komşu üsleri 37 nedeniyle kromatogra- önler. RT-qPCR Sanger sekanslanması için üretilen PCR ürünleri aynı zamanda başka yöntemler ile kullanımı, tek tek klonlann 12,13 toplu dizilemesi STD 4,7,17,19 veya oligonükleotid ligasyon tahlili (OLA) 38 gibi viral oranını belirlemek için olabilir .

Viral replikasyon spor belirli bir ortamda 1 enfeksiyon döl üretmek için bir virüs kapasitesi olarak tanımlanır ve zaman üzerinde 2 nüfus düzeyinde bir virüs çeşidi yaygınlığını belirlemede önemli bir faktör olduğunu. In vivo spor çalışmaları, HIV-1 olarak patojenik insan virüsler, çeşitli in vitro ve birlikte mümkün değildir ex vivo çoğaltma spor deneyleri ilaç direnci ve bağışıklık kaçış mutasyonları, epistazi ve evrim kaynaklanan fitness etkilerini incelemek için geliştirilmiştir viral popülasyonları 3-6. Farklı spor deneyleri arasında, büyüme rekabet tahlilleri in vivo 1,7,8 oluşur olarak iki veya daha fazla viral varyantları, tam olarak aynı çevre koşullarında aynı hücre popülasyonu için rekabet olarak, spor farklılıkları daha duyarlı ve geçerli önlemleri elde etmek için kabul edilmektedir. Büyüme rekabet deneyleri başlayarak birkaç variab önceles enfeksiyonunun farklı çokluklar (İçişleri Bakanlığı), viral giriş oranı, ve analiz için numune alma zamanlaması kullanımı dahil, tespit edilmesi gerekmektedir. Biz viral büyüme kinetiği üzerine ve rekabet deneyleri sonucu bu parametrelerin etkilerini inceledik ve hücre kültürü 9 HIV-1 fitness sağlam ölçümleri için gerekli anahtar faktörleri tespit ettik. Deney değişkenleri ek olarak, büyüme rekabet deneyleri viral varyantları ölçülmesi için çeşitli yöntemler vardır. 10,11 Toplu veya klonal sıralama 12,13 faiz sitesinde (ler) nükleotid frekansları dayalı rekabet virüslerin oranını belirlemek için kullanılır olmuştur. Bağıl spor zaman bu oran değişiklik elde edilir. DNA dizileme hizmetleri yaygın olarak bulunmaktadır Bu yöntem uygundur. Paralel alel-spesifik dizilim (PASS) yöntemi birden fazla sitelerde sıralama ve rekombinantların 14 saptanmasına olanak </sup&gt;, Ama aynı zamanda özel olarak geliştirilmiş reaktifler ve saptama sistemlerini gerektirmektedir. Esas olarak, bu yöntemler, söz konusu bir bölge nükleotid farklılıklar az sayıda virüs suşu için geliştirilmiştir. Diğer yöntemler, küçük bir raportör gen sıralama ile yarışan virüsleri, heterodubleks izleme tahlilleri (HTA) 4,7,17,19 ayırt veya transkripsiyon kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ters etiketleri gibi 15 veya eşanlamlı mutasyonları 4,16-18 kullanmak bağımsız olarak sekans benzerliği suşları rekabet çalışma için geçerli yapılabilir her biri (RT-qPCR) 15,16,18,20. Ek bir adım viral genomları içine etiketleri tanıtmak için gerekli ve RT-qPCR tahlil ayrıca belirli maddeler ve enstrümantasyon gerektirir. Biz bulduk toplu Sanger dizileme verimleri karşılaştırılabilir sonuçlar 9. Büyüme yarışma sonrasında, viral replikasyon spor göreli uygunluk veya t arasında fitness oranı olarak sunulmuşturvira varyantlar WO. bir virüs göreli spor aşı maddesi, ilk oran ya da iki rakip virüsler arasında net büyüme oranı farkı olarak normalleştirilmiş bir viral varyantın nihai oran olarak tanımlanabilmektedir. Biz ikinci yöntemi, sadece üstel büyüme fazında içinde uzunlamasına veri noktalarını kullanarak, en sağlam sonuçlar 9,20 ürettiğini gördük. Vitro fitness deneyleri, biyolojik klonlar 6-8 ve HIV-1 bulaşıcı moleküler klonlar incelemek için öncelikle kullanılır. İkincisi, genetik manipülasyon için uygun olan, genellikle belirli bir mutasyon veya ilgi duyulan 3-5,21,22 spesifik dizilerinden uygunluk üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokoller viral büyüme kinetikleri, bir dizi etiketi içeren HIV-1 vektörleri kullanarak yeni tam uzunlukta bulaşıcı HIV-1 molekül klonlar inşa ilgi mutasyonlar tanıtarak, viral stokları yapma ve kurma açısından bir iş akışını açıklarGöreli uygunluğu büyüme rekabet tahlili yapılması ve hesaplanması için (Şekil 1). Optimize prosedürler kullanılarak, üç rekombinant HIV-1 mutantlar yarattı ve çoğaltma zindeliği belirledi. yeniden birleştirici molekül klonun ilk sentetik COTB (Merkez-of ile pNL4-3, HİV-1 laboratuar sarmalı NL4-3 tam uzunlukta enfeksiyon genomunu ihtiva eden bir plazmid HIV-1 Gag-p24 gen bölgesine değiştirilmesiyle yapılmıştır Ağaç, alt tip B) gag-p24 dizisi 23 prototip gerginlik yaratır. Tek amino değişiklikleri (T186M, T242N ve I256V) daha sonra üç mutant klonlar oluşturmak tanıtıldı. Her mutant verilen genetik arka planda her mutasyonun fitness etkisini gözlemlemek için prototip virüsüne karşı yarıştı edildi. Üç mutantlar prototip virüsü daha hafif anlamlı derecede düşük çoğaltma fsitness çeşitli düzeylerde göstermişlerdir. T242N mutasyonu, daha önce bir orta fitne olduğu bildirilmiştirss Bu çalışmada gösterilen sonuca benzer 24-26, maliyet. Diğer iki mutasyonun spor maliyeti, daha önce bildirilmemiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:484px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:196px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Construction of recombinant clones</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid</td>
			<td style="width:484px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-fidelity buffer</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems&#174; GeneAmp&#174; PCR System 9700</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA loading dye</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">DpnI enzyme</td>
			<td style="width:484px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TOP10 chemically competent Escherichia coli</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Luria Broth base powder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:484px;">Research Products International</td>
			<td style="width:137px;">C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEK 293T-17</td>
			<td style="width:484px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">CRL-11268</td>
			<td>http://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.22um filter top tube</td>
			<td style="width:484px;">VWR International</td>
			<td>89220-716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#8242;s Modified Dulbecco&#8242;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phytohemagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Human Interleukin-2</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>11147528001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:484px;">JR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">43640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:484px;">Corning Cellgro</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">62407-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td style="width:137px;">T-3015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well round-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:137px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:484px;">Mt. Baker Bio</td>
			<td style="width:137px;">MBD-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 mL tubes w/ O-ring</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td>C-3317-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">glycerol</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tween 20</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td>
			<td style="width:484px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:137px;">4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">52-00-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HIV p24 standard</td>
			<td style="width:484px;">AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:484px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA isolation cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxtractor</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">SuperscriptIII</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">First-strand buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Rnase inhibitor</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RnaseH</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18021-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Real-time qPCR machine</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan&#174; Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Forward, reverse primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Probe</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">optical 96 well reaction plate</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">I19N3Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR+sequencing</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Taq DNA polymerase (Biolase)</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NH4 buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgCl2</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sequencing primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxcel</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA sequencing service provider</td>
			<td>http://www.htseq.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GRC web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ChromatQuan web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pairwise growth competition assay for determining the replication fitness of human immunodeficiency viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

HIV-1 Gag-p24 olarak tek bir amino asit değişikliklerinin spor etkisini incelemek için, HIV-1 COTB-p24 geni 23,32,33 ihtiva eden bir pNL4-3 plazmide mutasyonların katılması için oligonükleotid yönlendirilmiş mutagenez kullanılmıştır. Viral stoklar 293T hücrelerinin transfeksiyonu ile üretilir ve 48 saat sonra hasat edilmiştir. Biz Reed-Muench yöntemi 31, her bir virüs stokunun% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu (TCID50) tahmin edilmiştir. Prototip TCID50 ve mutant virüsler, 10 4 10 5 IU / ml (Şekil 3A) arasında değişmektedir. Rekombinant virüslerin büyüme kinetikleri 0.005 MOl&#39;de tek bir donörden alınan PBMC içinde kurulmuştur. RT-qPCR altı gün boyunca günlük olarak, viral cDNA kopyası sayısını ölçmek için kullanılmıştır. Bütün mutant ve prototip virüsleri &lt;Viral RNA kopya sayısı artış azalan bir eğimi (belirtildiği gibi viral büyüme yavaşladı 2. ve 4. günde, aşağıdakiler arasında katlanarak büyüyenstrong&gt; Şekil 3B). cDNA azalma (inokulum karşılık gelir) gün 0 ve 2 arasında sayı hücreleri virüs emilmesi ve gün 1 yıkama (aşama 5.1.6) bağlanmamış virionlann çıkarılması nedeniyle kopyalama. Üslü büyüme fazında, üç mutant prototip virüsü (Şekil 3C), daha yavaş bir büyüme oranını (g) vardı. Her üç mutantlar 0.005 toplam İçişleri Bakanlığı büyüme rekabet deneylerinde prototip virüsüne karşı yarıştı bulundu. Ikili olarak enfekte kültürlerden viral büyüme kinetikleri monoinfection benzer olduğu; Viral üstel büyüme fazı gün 2 ve 4 arasında, ve virüs büyümesi günde 5 (Şekil 4A) etrafında bir düzlüğe ulaşmıştır. Viral büyüme oranı farklılıkları, zaman içinde, viral oranı değişikliği elde edilmiştir. Viral oran cDNA kopyası başvuru sayısı ve RT-qPCR kullanarak mutant virüslere ve karşılaştırarak zirve yükseklikleri ile hesaplanmıştırsırayla iki virüs (Şekil 4B) ayırt edici nükleotit siteleri kromatogra-. doruk yüksekliğini ve viral RNA kopya sayısı yöntemleri kullanılarak saptanmıştır büyüme oranı farklılıkları, benzer sonuçlar (Şekil 4C) vermiştir. Her üç mutantlar düşük uygunluğu (Şekil 4C) sahip mutant I256V ile prototip virüs daha düşük çoğaltma uygunluk vardı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Şekil 1: Bu yazıda sunulan protokollerin akış diyagramı, viral stokların Virüs hazırlanması protokolleri endişe HIV-1 rekombinant klonların yapımı ve üretimi.. Fitness Tahliller protokoller viral büyüme kinetiği kurulması ve nispi viral uygunluğunu belirlemek için vardır. Kesik çizgiler protokoller için alternatif akımlarını gösterir. Örneğin, bir mutasyonun HIV-1 NL4-3 doğrudan sokulabilirbir rekombinant klonu oluşturmadan molekül klonu. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Şekil 2:. Örtüşme uzatma PCR (A) kullanılarak HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 yeniden birleştirici molekül klonlarının kurulması kimerik primerler dizayn. 5 &#39;primer yarıları NL4-3 vektör dizisi içeren ve 3&#39; yarım uç dizisinin uçlarını içerir. (B), kimerik primerler uç fragmanını COTB Gag-p24 amplifiye edilmesi için kullanılır. (C) uç parçaları yeni bir rekombinant plazmidi üretmek için ikinci bir PCR için primerler olarak kullanılmıştır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Şekil 3:. PBMC&#39;lerde viral büyüme özellikleri (A) Log 10 TCID 50 </sub&gt; viral stokların. (B) MOl&#39;de = 0.005 başlamış monoinfections viral büyüme kinetiği. Panel (B) elde edilen üslü büyüme fazında (gün 2-4) de dahil olmak üzere, altı gün boyunca (° C) Viral büyüme oranları. Gösterilen değerler, bir deneyden üç kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları,% 95&#39;lik güven aralıklarını gösterir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Şekil 4: Viral büyüme ve bağıl spor tayinleri (A) dually enfekte PBMC kültürlerinde viral büyüme.. T242N ve prototip virüs (B) Oranlar RT-qPCR veya sıralama tepe yüksekliği metodu kullanılarak belirlenmiştir. (A) &#39;da gösterildiği gibi, (C) mutant ve ikili olarak enfekte kültürlere prototip virüsler arasında net, viral büyüme oranı farklılıkları (d),. d değerleri f hesaplandı(B) &#39;de gösterildiği viral oranı verilerini rom. Gösterilen değerler, bir deneyden üç kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları,% 95&#39;lik güven aralıklarını gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses at JoVE.com

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K Görüntüleme.  University of Washington. Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.