These studies were funded by US Public Health Services grants P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 and the Functional Profiling and Computational Biology Core of the University of Washington&#8217;s Center for AIDS Research (P30 AI027757).

<ol>
	<li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival.">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li><li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+viral+emergence.">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38 (2010).</li><li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness:+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo.">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li><li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+(CTL)+response.">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365 (2009).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C:+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics.">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463 (2010).</li><li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes:+implications+for+the+epidemic.">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li><li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+infection/competition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression.">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li><li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes.">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li><li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses.">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li><li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q/E+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine.">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li><li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation.">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li><li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li><li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A,+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors,+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA(Lys,+3)+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency.">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li><li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted/founder+genome.">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li><li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay.">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li><li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and/or+reverse+transcriptase+variants.">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes:+fitness-balanced+escape.">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li><li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41.">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li><li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness.">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li><li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture.">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li><li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers.">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li><li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in.">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+conserved-element+vaccines:+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity.">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li><li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li><li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A.">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li><li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li><li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density.">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints.">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li><li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines.">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li><li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins.">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li><li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlap+extension+PCR+cloning:+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids.">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li><li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro.">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li><li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface.">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065 (2013).</li><li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing.">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li><li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies.">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。本明細書に示された意見は執筆者のものであり、公式または米国国防総省や軍の部門の見解を表すものとして解釈されるべきではありません。

組換えHIV-1分子クローンと成長競合アッセイの構築：提示プロトコルは、2つの主要な部分から構成されました。二重感染した細胞培養物中で2つのウイルスを区別するためには、競合分子クローンをRT-qPCRのプライマー - プローブアッセイにより、またはサンガー配列決定によって検出することができる配列タグを含むことが重要です。このプロトコルは、HIV-1 NL4-3 VIFの同じ領域を占有し、同じアミノ酸配列をコードするが、6同義突然変異によって異なるVifAとVIFBタグを利用します。これらの変異は影響を与えないことが示されました ウイルス複製のフィットネス20。このプロトコルで使用されるPCRベースのクローニング法は、制限部位に基づくクローニングに比べ、クローニング部位を選択する際に、より柔軟性を提供します。しかし、PCRクローニングの効率は挿入サイズが増加するにつれて減少します。インサートサイズの電流制限は〜5キロバイト34です。 PCRベースのクローニングおよび部位特異mutagenesi用S、高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、追加の変異の可能性を低減するために重要です。生成物の十分な量を得るために必要なPCRサイクルの最小数を使用することも推奨されます。我々の経験では、我々はここで説明するPCRベースのクローニングおよび部位特異的突然変異誘発の工程の後、余分な突然変異を検出しませんでした。それにもかかわらず、PCR産物は、任意の望ましくない変異を確認するために配列決定されるべきです。理想的には、全体のHIVコード領域を再配列決定されるべきです。 少なくとも三つのサンプリング時点は指数増殖期9内で検討されるべきです。ウイルスの増殖速度は、第1の成長競争のための適切な培養期間とサンプリング時間点を決定するために、毎日のサンプリングを使用して確立されなければなりません。ウイルスの増殖速度に影響を与える要因の一つは、感染（MOI）の多重度です。それはより多くのROを得るために示されたように、このプロトコルは、単一菌感染と成長の競争の両方のために0.005の合計MOIを使用しています下のMOI 9よりバスト結果。それにもかかわらず、下側のMOIは、必要に応じてより長い指数増殖期を得るために使用されるが、結果の一貫性を犠牲にすることができます。このプロトコルは、ウイルスの適応度の差が予め概して未知であると仮定すると、50：50の初期感染率を示唆しています。ウイルス複製の動態に有意差を示唆する予備的なデータがある場合しかし、等しくない入力比の使用が適切です。これらのケースでは、70：30の感染率が少なくフィットウイルスが過剰9に配置されている大規模なフィットネス差の検出を可能にすることをお勧めします。 、ウイルスの増殖動態、及びHIV-1サブタイプBを用いた競合アッセイを最適化した成長を行うためのTCID 50を測定するためのプロトコルは、PBMCを単一のドナーからNL4-3 COTB-P24、及びPBMCをHIV-する一貫性の感受性を示しましたin vitroで 1感染。培養期間このプロトコルで提示サンプリング時点は、ヒトPBMCにおいてHIV-1 M群ウイルスを研究するために適切であると思われます。単一のソースからのPBMCを使用することは非常にウイルスの複製は、異なるドナー細胞35に変化させることができるように一貫性のある結果を得ることをお勧めします。あまり望ましくないが、置換が同じプールをすべての実験全体で使用されていることを条件として、複数のドナーからプールされたPBMCを使用することができます。別の方法としては、細胞株の使用です。ここで紹介するプロトコルは、T細胞株CEMx174 23,36で正常に使用しました。しかし、播種した細胞の数は、一貫した細胞増殖を達成するために再最適化することが重要です。それは成長の競争段階で適切なサンプリング時点を決定するために、異なる細胞株において変化する可能性があるようにウイルスの増殖速度はまた、再確立されなければなりません。 適応度を計算するためのウイルスの比を決定するために、2つの異なる方法がprotocに含まれていますOL。最初は、各サンプリング時点でのウイルスcDNAのコピー数を測定するためにRT-定量PCRを使用しています。ウイルス複製適性は、その後のcDNAコピー数に基づいて、ウイルスの比から計算しました。あるいは、ウイルスの割合はVifABタグ部位でのクロマトグラムのピーク高さの比に基づいて決定することができます。二つの方法は、比較結果（ 図4）を得ました。クロマトグラムのピーク高方法が設計された配列タグなしで他のHIV-1株に適用することができます。 RT-qPCRを、ウイルスの変異体を区別するためのプライマーまたはプローブを使用することは最初に慎重に評価されなければならないために（20を参照）。しかしながら、RT-qPCRのは、指数増殖期中に最初の時点からのものなどのウイルスRNAの少量のサンプルについて良好な感度を提供します。ウイルスcDNAの直接測定は、また、RNA抽出およびcDNA合成から生じ得る技術的問題を検出することができます。配列タグとの分子クローンを使用すると、費用対効果の高いソリューションを提供するTRT-qPCRの方法Oのようなプライマーおよびプローブの2つだけのペアが複数のウイルスを研究するために必要とされます。この戦略はまた、シーケンスで、ピークの高さのばらつきの問題を回避するシーケンシングが研究中のすべてのウイルスで同じサイトで行われているように、起因隣接塩基37にクロマトグラム。 RT-qPCRのおよびサンガー配列決定のために生成されたPCR産物は、他の方法での使用は、個々のクローン12,13のバルク配列決定、HTA 4,7,17,19、またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA）38のようなウイルスの比率を決定することができ。

ウイルス複製適性は、与えられた環境で1感染性の子孫を生成するウイルスの能力として定義され、2時間かけて集団レベルでのウイルス変異の有病率を決定する重要な要因です。 in vivoでのように、トレーニングの研究では、in vitroでの様々なそのようなHIV-1などの病原性ヒトウイルス、と現実的ではないですし、ex vivoでの複製フィットネスアッセイは、薬剤耐性および免疫回避突然変異から生じるフィットネス、上位性と進化への影響を研究するために開発されてきましたウイルス集団3-6の。異なるフィットネスアッセイの中で、成長競合アッセイは、in vivo 1,7,8 で起こるように、2つ以上のウイルス変異体は、正確に同じ環境条件下で同じ細胞集団のために競うように、フィットネス差のより感度の高い、有効な対策をもたらすと認識されています。成長競合実験を開始する前に、いくつかのvariabレ感染の異なる多重度（MOI）を用い、ウイルスの入力比、および分析のためのサンプリングのタイミングを含む、決定する必要があります。我々は、ウイルスの増殖速度のと競合実験の結果に、これらのパラメータの影響を研究している、および細胞培養9中のHIV-1のフィットネスの強固な測定のために必要な重要な要素を同定しました。 変数をアッセイに加えて、成長の競合実験においてウイルス変異体を定量するための様々な方法があります。バルク10,11またはクローンの配列決定12,13は、目的の部位（複数可）でのヌクレオチドの頻度に基づいて、競合するウイルスの割合を決定するために使用されてきました。相対的なフィットネスは、時間をかけて、この比率の変化に由来します。 DNAシークエンシングサービスが広く利用可能であるように、この方法が便利です。並列対立遺伝子特異的配列決定（PASS）メソッドは、複数の部位で配列決定および組換え体14の検出を可能に</sup&gt;が、それはまた、特別に開発試薬および検出システムを必要とします。本質的に、これらの方法は、関心領域内のヌクレオチドの差異の数が少ないウイルス株を研究するために開発されました。他の方法は、4,7,17,19ヘテロトラッキングアッセイ（HTA）、配列決定によって競合ウイルスを区別するためにタグとして4,16-18小さなレポーター遺伝子15または同義突然変異を使用するか、または転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を逆転します関係なく、配列類似性の競合株を研究するために適用することができるこれらの全て（RT-qPCRの）15,16,18,20、。追加のステップは、ウイルスゲノムにタグを導入するために必要であり、RT-のqPCRアッセイはまた、特異的な試薬や機器を必要とします。我々は、バルクサンガー配列決定の利回り同等の結果9。 成長競争に続いて、ウイルス複製のフィットネスは、相対フィットネス、またはTとフィットネス比として提示されていますウイルスの変異体をめざし。ウイルスの相対的な適応は、接種物中または2つの競合するウイルス間の正味の成長率の差としての最初の割合によって正規化ウイルス変異体の最終的な割合として定義することができます。我々は、後者の方法は、唯一の指数増殖期内の縦のデータポイントを使用して、最も強力な結果9,20を生じたことを発見しました。 in vitroでのフィットネスアッセイは、生物学的クローン6-8とHIV-1の感染性分子クローンを研究するために主に使用されています。後者は、遺伝子操作に適している、多くの場合、特定の突然変異または関心3-5,21,22の特定の配列から、トレーニングの効果を研究するために使用されます。次のプロトコルは、ウイルスの増殖速度を、配列タグを含むHIV-1ベクターを使用して、新しいフルレングスの感染性HIV-1分子クローンを構築する目的の変異を導入、ウイルスストックを作製し、確立した時点からワークフローを記述します、相対的なフィットネスを成長競合アッセイを実施して計算する（ 図1）。 当社の最適化された手順を使用して、我々は3組換えHIV-1変異体を作成し、それらの複製のフィットネスを決定しました。組換え分子クローンは、第1の合成COTB（センターオブと、pNL4-3のHIV-1 のgag-P24遺伝子領域、HIV-1実験室株NL4-3の全長感染性ゲノムを含むプラスミドを置換することによって構築されましたプロトタイプ株を作成するために、ツリー、サブタイプB） のgag-P24配列 23。単一アミノ酸変化（T186M、T242N、およびI256V）は、次の3つの変異体のクローンを作成するために導入されました。各変異体は、特定の遺伝的背景の各突然変異の適応度への影響を観察するために、プロトタイプのウイルスに対して競合させました。原型ウイルスよりもわずかに有意に低いから複製fsitnessのレベルを変化させることを実証し3の変異体。 T242N突然変異は、以前適度なfitneを有することが報告されましたSSは、本研究で示した結果と同様の24-26、コスト。他の2つの変異の適応コストは以前に報告されていませんでした。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:484px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:196px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Construction of recombinant clones</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid</td>
			<td style="width:484px;">N/A</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">High-fidelity buffer</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>F-549S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems&#174; GeneAmp&#174; PCR System 9700</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA loading dye</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">R0631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1kb Plus DNA ladder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">DpnI enzyme</td>
			<td style="width:484px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">TOP10 chemically competent Escherichia coli</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Luria Broth base powder</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:484px;">Research Products International</td>
			<td style="width:137px;">C46000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HEK 293T-17</td>
			<td style="width:484px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">CRL-11268</td>
			<td>http://www.atcc.org/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">0.22um filter top tube</td>
			<td style="width:484px;">VWR International</td>
			<td>89220-716&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#8242;s Modified Dulbecco&#8242;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phytohemagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:484px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Human Interleukin-2</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>11147528001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:484px;">JR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">43640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:484px;">Corning Cellgro</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">73520-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 well plate</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">62407-338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td style="width:137px;">T-3015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well round-bottomed plate</td>
			<td style="width:484px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:137px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:484px;">Mt. Baker Bio</td>
			<td style="width:137px;">MBD-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">1.5 mL tubes w/ O-ring</td>
			<td style="width:484px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:137px;">89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:484px;">ISC Bioexpress</td>
			<td>C-3317-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">glycerol</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Tween 20</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:484px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td>
			<td style="width:484px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:137px;">4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">474-1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td style="width:484px;">KPL</td>
			<td style="width:137px;">52-00-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300-500</td>
			<td>Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 minutes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">HIV p24 standard</td>
			<td style="width:484px;">AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:484px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA isolation cDNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxtractor</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">dNTP</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-39026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">SuperscriptIII</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">First-strand buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18080-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Rnase inhibitor</td>
			<td style="width:484px;">Roche</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">RnaseH</td>
			<td style="width:484px;">Invitrogen</td>
			<td>18021-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">qPCR</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Real-time qPCR machine</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan&#174; Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Forward, reverse primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Probe</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">optical 96 well reaction plate</td>
			<td style="width:484px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">I19N3Q216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR+sequencing</td>
			<td style="width:484px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Taq DNA polymerase (Biolase)</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NH4 buffer&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgCl2</td>
			<td style="width:484px;">Bioline</td>
			<td style="width:137px;">Bio-21043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Sequencing primer</td>
			<td style="width:484px;">IDT</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">QIAxcel</td>
			<td style="width:484px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA sequencing service provider</td>
			<td>http://www.htseq.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GRC web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ChromatQuan web tool</td>
			<td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pairwise growth competition assay for determining the replication fitness of human immunodeficiency viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

HIV-1のGag-P24における単一アミノ酸変化の適応度への影響を研究するために、我々はHIV-1 COTB-P24遺伝子23,32,33を含むpNL4-3プラスミドに変異を導入するために、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用していました。ウイルスストックは、293T細胞のトランスフェクションによって生成され、48時間後に回収しました。我々は、リード-ミュンヒ法31により各ウイルスストックの50％組織培養感染量（TCID 50）を推定しました。プロトタイプと変異体ウイルスのTCID 50は 10 4から10 5 IU / mlで（ 図3A）の範囲でした。 組換えウイルスの増殖動態は、0.005のMOIで、単一のドナーからのPBMCに設立されました。 RT-qPCRを、6日間毎日ウイルスcDNAコピー数を測定しました。ウイルスRNAのコピー数の増加の減少勾配によって示されるように、すべての変異体およびプロトタイプウイルスは&lt;（、、2日目と4日目の間に指数関数的にウイルスの増殖を遅く次のように成長しました強い&gt;図3B）。 0日目（接種物に相当）と2日目の間のcDNAコピー数の減少は、細胞へのウイルスの吸収と1日目の洗浄（ステップ5.1.6）によって結合していないビリオンの除去によるものです。指数増殖期では、すべての3つの変異体は、原型ウイルス（ 図3C）よりも遅い成長速度（g）を有していました。 すべての3つの変異体は、0.005の合計MOIで成長競合アッセイで原型ウイルス競いました。二重感染した培養物中のウイルスの増殖速度は、単一菌感染の場合と同様でした。ウイルスの指数増殖期は、2日目と4の間で、ウイルス増殖は、5日目（ 図4A）の周りにプラトーに達しました。 ウイルスの増殖速度の差は経時ウイルス比率の変化に由来しました。ウイルス比はcDNAコピーの参照の数とRT-qPCRのを使用して、変異体ウイルスであり、比較ピーク高さにより計算しましたシーケンス内の2つのウイルス（ 図4B）を区別するヌクレオチド部位でクロマトグラム。ピーク高さおよびウイルスRNAのコピー数の方法を用いて決定成長速度の違いは、同様の結果（ 図4C）を得ました。すべての3つの変異体は、最も低いフィットネス（ 図4C）を有する変異I256Vとプロトタイプのウイルスよりも低い複製のフィットネスを持っていました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> 図1：本論文でのプロトコルのフロー図ウイルスストックのウイルス調製プロトコルの懸念のHIV-1組換えクローンの構築および生成。フィットネスアッセイプロトコルは、ウイルスの増殖速度を確立し、相対的なウイルスの適応度を決定するためのものです。破線は、プロトコルのための代替フローを表します。例えば、突然変異は、HIV-1 NL4-3に直接導入することができ組み換えクローンを作成することなく、分子クローン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> 図2：オーバーラップ伸長PCR（A）を使用して、HIV-1 NL4-3 COTBギャグ-P24組換え分子クローンの構築キメラプライマーを設計します。 5 &#39;プライマーの半分はNL4-3ベクター配列を含み、3&#39;半分は、挿入配列の末端を含みます。 （B）キメラプライマーは、挿入断片、COTBのGag-P24を増幅するために使用されます。 （C）挿入断片は、新しい組換えプラスミドを生成するために第2のPCRのためのプライマーとして使用されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> 図3：PBMCにおけるウイルス増殖特性（A）ログ10 TCID 50 </sUB&gt;ウイルスストックの。 （B）MOI = 0.005で開始monoinfectionsにおけるウイルス増殖動態。パネル（B）に由来する指数増殖期（日2-4）を含む6日間の（C）は、ウイルスの増殖速度、。表示される値は、一つの実験からの3つの複製の平均を表します。エラーバーは95％信頼区間を表します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> 図4：ウイルスの増殖および相対フィットネスの決定（A）二重感染したPBMC培養におけるウイルスの増殖。 T242Nプロトタイプウイルスの（B）比は、RT-qPCRをシークエンシングまたはピーク高さ法を用いて決定しました。 （C）二重感染した培養物中の変異体およびプロトタイプウイルス間ネットウイルス増殖率の差（D）、（A）に示すようにd値は、fを計算しました（B）に示したウイルスの割合データをROM。表示される値は、一つの実験からの3つの複製の平均を表します。エラーバーは95％信頼区間を表します。

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Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K ビュー.  University of Washington. Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.