The authors do not have any acknowledgements.

يجب تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك الحصول على موافقة مسبقة من لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام المحلية. 1. إعداد أدوات تشريح والثقافة وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewash جميع الأدوات اللازمة لاستخدامها في تشريح مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين ثم الأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تصفية وسائل الإعلام BGJb بمحلول مضاد حيوي ومضاد فطري باستخدام 0.22 ميكرون مسام الحجم مرشح مع شفط فراغ في غطاء محرك السيارة. </li></ol> 2. إعداد المعدات الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المرشحات الغشائية البولي من شأنها أن تدعم أجهزة حنكي في مثلثات صغيرة، رذاذ مع الكحول 70٪ والسماح لهم لتجف. إعداد مركز حسنا ثقافة الجهاز صحن (60x15 ملم) عن طريق وضع متساوي الأضلاع الثلاثي على شكل شبكة الأسلاك النظيفة والمعقمة (20 ملم) على لوحة الثقافة الجهاز. ثم ملء البئر مع 1 مل من BGJB سائل الإعلام والثقافة وسائل الإعلام. ملاحظة: يجب أن تكون وسائل الإعلام كافية للوصول إلى مستوى من الشبكة بدون غمر الأذواق. وضع المرشحات الغشائية، الجانب اللامع أسفل، على رأس الشبكة (3-4 الأغشية في الشبكة). اعتمادا على التجربة والعلاج (البروتينات، والأجسام المضادة أو مثبطات) يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام </li></ol> 3. ماوس الأجنة جمع وإعداد للثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على نوع البرية أجنة الفئران، توقيت استخدام 13.5 حاملا CD-1 الماوس سلالة الخلفية الوراثية. تنظيف المنطقة تشريح مع الايثانول 70٪. ملاحظة: سلالات أخرى من الفئران يمكن استخدامها. نحن نفضل CD-1 الفئران بسبب العدد القمامة أكبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران الحوامل في E13.5 شركة ظفار (آخر أيام الجماع) مع 5٪ الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم للتأكد من وفاة باستخدام بروتوكولات المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رذاذ الايثانول 70٪ على سطح البطن بطني لتجنب وجود عصا الشعر في البطن في الصكوك. ثم فتح تجويف البطن من الناحية البطنيةباستخدام مقص حاد صريحا التشغيل وملقط تشريح الصغرى لتحديد الرحم. باستخدام ملقط، ورفع الرحم كامل وفصلها عن الجسم عن طريق قطع في جسم الرحم وعلى نصائح من قرون الرحم مع مقص التشغيل الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الرحم على منشفة ورقية نظيفة على الجليد (وفقا لدليل بروتوكول للرعاية واستخدام حيوانات المختبر). تغطية الرحم مع منشفة ورقية نظيفة أخرى لمنع التلوث. تعقيم الأدوات باستخدام 70٪ رذاذ الايثانول قبل استخدامها مرة أخرى. يمكن نقلها الرحم والأجنة إلى المختبر على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في فتح غطاء تدفق الصفحي، وجعل بعناية فتحة صغيرة في الكيس المحي باستخدام مقص حاد التشغيل كليلة وملقط تشريح الصغرى. جعل زيادة الانفتاح وثم دفع برفق إلى الداخل للظاهر الجنين من الكيس المحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة فورا إلى طبق بيتري مع الباردة الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) ودرجة الحموضة 7.4. لضمان السليم المرحلة السابقةأمين الجنين تحت المجهر تشريح للجسم، وحجم الرأس والأطراف التشكل. لا يتم استخدام الأجنة التي ليست في مرحلة الصحيحة التنمية للتجربة: ملاحظة. </li></ol><img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> الشكل 2. برعم الطرف الصرف. ويتم فحص الصدارة وأطرافه الخلفية للحصول على درجة حزام المسافة البادئة بين الأرقام. في E13.5، كل تكثفات أرقام بارزة، مع حزام والمسافات البادئة البعيدة بين الأرقام تظهر اضح للغاية. الأرقام هند هي وراءها لمدة نصف يوم 12 الصف العلوي: forelimb، الصف السفلي: أطرافه الخلفية. 4. الحنك تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين في وقت واحد في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني تحت المجهر تشريح. باستخدام مقص تشريح الصغيرة وملاقط تفصل الرأس عن الجسم من الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد بعناية الجمجمة الماوس فوق مستوى العين مع ملقط (تجنبعملية الفك العلوي) جعل اثنين من الشقوق على جانبي خط الشفاه. ثم إزالة الفك السفلي واللسان. عزل المنطقة عملية الفكين عن طريق إجراء خفض في مستوى العين وإزالة الدماغ والعينين والأنف والأنسجة الحاجز المجاور. </li></ol><img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> الرقم الأنسجة 3. الحنك التي تم جمعها من 13.5 الأجنة، عندما الرفوف الحنك قد رفعت لكن لم تصدر للإتصال به. وضعت على الرفوف حنكي في الثقافة الجهاز على فلتر في واجهة وسائل الإعلام الهواء لمدة 72 ساعة في نموذج ثابت. (A) مستوى تشريح E13.5 على الجنين. (B) بلو ستارز وتفصل بين المناطق لعقد الأنسجة مع ملقط أثناء تشريح. (C) عرض الرفوف حنكي تشريح وضعت على غشاء فلتر شبه منحرف. (D) عرض جانب من الطبق الثقافة بعد تنسيب من أذواق تشريح وبالإضافة إلى ذلك من وسائل الإعلام الثقافة. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجانب الشفوي حنكي صعودا وإزالة الحاجز الأنفي والأنسجة المحيطة بها، والحفاظ على الحنك الأساسي المرفق لمساعدتها على توجيه من الأمامي إلى الخلفي. استخدام ملعقة ملعقة ونقل بعناية فائقة الرفوف الحنكية (الجانب الأنف إلى أسفل) للمرشحات مستعدة على الشبكات في أطباق الثقافة. ملاحظة: ضبط حجم وسائل الاعلام للسماح اجهة الوسائط الجوية المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر ستيريو، تشريح الحنك الابتدائي واستخدام ملاقط لوضع الرفوف حنكي قريبة من بعضها البعض. سوف الرفوف حنكي لا تلتحم إذا لم يتم وضعها في الاتصال. قطع غشاء الثلاثي حيث يقع الجزء الأمامي من الحنك. وشكل شبه منحرف تساعد في إضفاء الطابع المحلي على الجزء الأمامي من الحنك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الرفوف حنكي بشكل فردي أو مع اثنين أو ثلاثة في نفس الطبق الثقافة الجهاز باستخدام BGJb سائل الإعلام والثقافة. </li></ol> 5. رفوف التثقيف ماوس الحنكي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان TISSUوفاق عند 37 درجة مئوية في خليط الغاز مرطب (5٪ CO 2 و 95٪ الهواء) لمدة 72 ساعة، وتغيير المتوسط ​​كل 24 ساعة. </li></ol> 6. الحنك المعالجة للتحليل النسيجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأذواق بعد 72 ساعة في الثقافة مع 4٪ الفورمالديهايد / الفوسفات مخزنة المالحة O / N عند 4 درجات &#160; C. ثم بلطف مع ماصة نقل غسل الأنسجة في الطبق الثقافة مع برنامج تلفزيوني. التفاف الأذواق في قطعة من مناديل مختبر ومكان في تضمين أشرطة. ملاحظة: التفاف الأذواق في مناديل مختبر منع خسارتهم خلال عملية الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الأنسجة التالية 70٪، 80٪ وحتى 100٪ يغسل الإيثانول لمدة 1 ساعة، يليه إجراء البارافين العادي التضمين. لدمج، ضع الجزء الأمامي من سقف الحلق التي تواجه الدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المسلسل 6 ميكرون المقاطع في اتجاه الاكليلية من الأمامي إلى الخلفي. وهناك قسم كامل الحنك تسفر 350-450 sectiإضافات. وصمة عار على المقاطع مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E). 10 نقاط كل قسم 20 تشرين باستخدام سبق وصفها متوسط ​​فيوجن نتيجة (MFS) على نطاق و(الجدول 1). 8 </li></ol>

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests.

بروتوكول في هذه المقالة يوفر طريقة لتشريح الرفوف حنكي من الأجنة في اليوم الجنينية 13.5. وكانت الرفوف الحنك من أجنة الفئران مثقف في وسائل الإعلام ثقافة خالية من مصل في جو من 95٪ O 2 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. نجاح حنكي تشريح اعتمادا كبيرا على عوامل متعددة في كل خطوة ...

انشقاقات فموي وجهي هي الاكثر السائدة العيوب الخلقية القحفي. أيضا، مع الأخذ في الاعتبار جميع العيوب القحفي ممكنة، وهذه هي ثاني الشذوذ الولادة الأكثر شيوعا في الأطفال حديثي الولادة 2. تحدث الأذواق المشقوقة في حوالي 1 في كل 700 ولادة في الولايات المتحدة (US) من كل عام، وقوع الحنك يساوي 475 الأطفال الذين ولدوا مع الأذواق المشقوقة شهريا أو 15 طفلا شقوقا في يوم 3. ما يقرب من 1٪ من الأطفال الذين ولدوا في جميع أنحاء العالم كل عام المعرض شكلا من أشكال dysmorphology القحفي. شقوق في سقف الحلق والشفة تحتاج إلى إجراء مكلفة جدا ومعقدة مع تداعيات مدى الحياة للمرضى الذين لديهم هذا الشذوذ. التكلفة التقديرية لكل مريض مع شق طريق الفم هو حوالي 100،000 $ 4. علاج للمريض مع الشفة المشقوقة والحنك يتطلب فريقا من الأطباء الجراحين بما في ذلك القحفي، otolaryngologists، والهندسة الوراثية، التخدير،النطق واللغة الأطباء وخبراء التغذية، تقويم الأسنان، prosthodontists وعلماء النفس والأعصاب، وأطباء العيون. في palatogenesis، ينشأ الحنك الثانوي الامتداد المقترنة، التي تنمو في البداية عموديا والخضوع لحنكي الرف الارتفاع فوق ظهر اللسان. بعد الارتفاع، ورفوف حنكي يقترن تنمو نحو خط الوسط (في E14.5 -E15 في الفئران والأسبوع 9 في البشر). ظهارة حافة وسطي (MEE) الذي يغطي طرف الجرف تلتزم تشكيل التماس خط الوسط الظهارية. ويعقب ذلك الظهارية للانتقال الوسيطة و / أو موت الخلايا المبرمج للسماح الوسيطة التقاء. التصاق معارضة MEE هو الحدث الأساسي الذي يسبب الحنك التغيير. ومع ذلك، حققت فقط عدد قليل من الدراسات التصاق الأولي من الرفوف حنكي 5. أشكال الحنك الصلبة التي تمايز خلايا اللحمة المتوسطة في بناء العظم. تطوير شاذة من الحنك يمكن أن تنتج المفتاحر الأذواق مع أو دون تدخل من الشفة. وقد استخدمت تقنيات زراعة الأعضاء الحنك على نطاق واسع لكثير من المختبرات على مدى السنوات ال 30 الماضية 6،7. في هذا البروتوكول وصفنا في تفاصيل طريقة لتشريح حنكي والثقافة الجهاز ثابتة. الاستفادة من ثقافة بلا حراك الجهاز هو أنه يتيح الرفوف الحنك لتلتحم. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح في المختبر لدينا لكثير من الانصهار ويشير التجارب 8،9. إلا أن نطاق هذه التقنية واسع ويمكن استخدامها كلما مطلوب نظام الثقافة الجهاز ثابتة، بما في ذلك تقييم الاستجابات لعوامل كيميائية خارجي، وآثار عوامل النمو التنظيمية في مسارات مختلفة، وبروتينات معينة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> الشكل 1. ماوس Palatogenesis. مراحل تطور الحنك الفئران. (BF) الضوئي ايلىالميكروسكوب ctron (SEM) من الحنك الثانوي في فترات النمو التمثيلية. السهام الحمراء: وتظهر بالجزء الأول من التصاق حنكي والانصهار. الأسهم الصفراء: أشر إلى الفضاء بين أذواق الابتدائية والثانوية التي سوف تختفي بعد الانصهار (نقلا عن كوفمان 11 بإذن من بلوس وان).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

الشفة المشقوقة والحنك هي من بين الأكثر شيوعا من جميع العيوب الخلقية. أشكال الحنك الثانوية من الرفوف الوسيطة مغطاة ظهارة أن تلتزم تشكل خط التماس خط الوسط الظهارية (MES). النظريات تشير إلى أن الخلايا MES اتباع الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، موت الخلايا المبرمج والهجرة، مما يجعل الحنك تنصهر 1. تفكك كامل للMES هو المرحلة الأساسية النهائية للحنكي التقاء مع توضيح خلايا اللحمة المتوسطة. ونحن نقدم طريقة لثقافة الجهاز الحنك. الدول المتقدمة في بروتوكول المختبر يسمح للدراسة العمليات البيولوجية والجزيئية خلال الانصهار. تطبيقات هذه التقنية متعددة، بما في ذلك تقييم الردود على العوامل الكيميائية خارجي، وآثار العوامل التنظيمية والنمو وبروتينات معينة. الثقافة الجهاز الحنك لديها عدد من المزايا بما في ذلك التلاعب في مراحل مختلفة من التنمية لم يكن ذلك ممكنا باستخدام الدراسات المجراة.

<html> ويمكن تطبيق هذه التقنية لأنواع مختلفة من experiments.The الدراسة التالية تم تصميمها لاختبار تأثير ماسخ من النيكوتين في المختبر على حنكي الانصهار. واستخدمت سلالتين من الفئران لهذه التجربة، وعولج CD1 والأنسجة C57.Palatal مع 0.06 و 6 ملي تركيزات من hemisulfate النيكوتين. ولوحظ أن أن...

Watch this Scientific Journal Video about Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture at JoVE.com

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

هي الدافع دراسات التنمية الحنك قبل حدوث الشق الحلقي وهو عيب خلقي الذي يفرض عبئا صحية هائلة، ويمكن أن يترك تشوهات دائمة. علينا أن نظهر هنا تقنية لرفوف الثقافة حنكي التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات المختلفة المشاركة في التنمية حنكي والانصهار.

طريقة دراسة حلقي فيوجن باستخدام ثابت الجهاز الثقافة

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

method-of-studying-palatal-fusion-using-static-organ-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K Views.  Texas A&M University Baylor College of Dentistry.  هي الدافع دراسات التنمية الحنك قبل حدوث الشق الحلقي وهو عيب خلقي الذي يفرض عبئا صحية هائلة، ويمكن أن يترك تشوهات دائمة. علينا أن نظهر هنا تقنية لرفوف الثقافة حنكي التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات المختلفة المشاركة في التنمية حنك...

Video: Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

دراسة إشارات Wnt خلال الزخرفة من إجراء الخطوط الجوية

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

طريقة ثابتة ذاتية التوجيه لتوليد الأعضاء الدماغية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion is the merger of two or more cells to form a single cell. Here we provide a protocol for cell fusion of two different cell types. Fused hybrid cells are enriched by flow cytometry-based sorting, followed by fluorescence microscopy of hybrid cell structure and function. Fluorescently tagged proteins generated by genome editing are imaged inside fused cells, allowing cellular structures to be identified based on fluorescence emission and referenced back to the cell type of origin. This robust and general method can be applied to different cell types or organelles of interest, to understand cellular structure and function across a range of fundamental biological questions.

The purpose of this protocol is to fuse two different cell types to create hybrid cells. Fluorescence microscopy analysis of fused cells is used to track the cell of origin of cellular organelles. This assay can be used to explore how cellular structure and function respond to perturbation by cell fusion.

خلايا خليه الانصهار من الجينوم تحرير خطوط الخلايا لاضطراب الهيكل الخلوي والوظيفة

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...