Name: in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

Bu eser Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N tarafından desteklenmiştir; Pediatrik Kardiyoloji, UZ Leuven, Belçika &quot;Eddy Merckx Araştırma Bursu&quot; ve &quot;Sporta araştırma Hibe&quot; (JC); Moleküler Biyoloji ve Damar Merkezi Leuven Üniversitesi&#39;nden &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) ve Boehringer-Ingelheim bir araştırma bursu ile, Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014) tarafından desteklenmektedir.

Hayvan deneyleri KU Leuven Etik Komitesi tarafından kabul edildi. İn Vitro perfüzyon ve in vivo deneylerde hazırlanması 1. Bakterilerin <ol><li> Biz S. kullanılan aureus Bu yazıda anlatılan tüm deneyler için suşu Newman. S. aureus Newman -80 ° C&#39;de,% 10 gliserol ile Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) &#39;de depolanmıştır. </li><li> 37 ° C (OD&gt; 3 600) havaalanındaki / N dondurulmuş bakteri kazıyın ve 5 ml Triptik Soy Broth (TSB) Ç aşılamak için steril bir döngü kullanın. </li><li> Santrifüj (2,600 g, RT, 5 dakika) bakterilerin yıkanır ve 5 ml PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) bakteriyel pelletini. </li><li> Etanol, 5 (6) -karboksi-floresin N-hidroksisüksinimidil ester (karboksi-floresin) bir 1 mg / ml çözelti hazırlayın. Laboratuvar sınıfı su içinde, 150 ug / ml, 1 mg / ml karboksi-floresin çözeltisi (örneğin, MilliQ su) ile seyreltilir. Işık tüpleri korumak-20 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza ile. </li><li> (2.600 xg, RT, 5 dk) bakterileri santrifüj. 800 ul PBS içinde bakteriyel pelet yeniden süspanse edin ve 200 ul veya 150 ug / ml karboksi-floresin çözeltisi 400 ul (nihai konsantrasyon in vivo deneyler için 50 ug / ml) (perfüzyon deneyleri için 30 ug / ml nihai konsantrasyon) ilave edin. Alüminyum folyo ile ışıktan tüpleri korumak ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Etiketlemeden sonra, PBS içinde% 6 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ile bir blok. </li><li> Optik dansitometrisi kullanılarak bakteri (OD), bir OD in vitro deneyler için 0.65, 600 seyreltin (ve bir OD in vivo deneyler için 1.8, 600 (yaklaşık 3 x 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) S. aureus / ml&#39;ye karşılık gelir) PBS içinde S. aureus için yaklaşık olarak 1 x 10 9 CFU / mL) karşılık gelir. Alüminyum folyo ile ışıktan koruyunuz tüpler buz üzerinde bırakın. </li></ol> 2. İn Vitro Perfüzyon Deneyleri <ol><li> Cam lameller kaplanması <ol><li> Laboratuvar sınıfı su içinde von Willebrand faktörü (vWF) (Haemate P stok konsantrasyonu 2400 ug / ml) ile seyreltilir, 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar (damıtılmış deiyonize). </li><li> 160 ug / ml bir son konsantrasyona kadar (üretici tarafından sağlanan gibi, SKF çözeltisi, pH 2.7-2.9), izotonik glikoz çözeltisinde kollajen seyreltin. </li><li> Parafilm üzerindeki kaplamanın 200 ul bırakarak ve damlacık üstüne lamel yerleştirin tarafından VWF&#39;nin veya kollajen ile kaplayın cam lamelleri (24 × 50 mm). damlacık lamel yüzeyi boyunca yayılacak. </li><li> Oda sıcaklığında 4 saat boyunca nemlendirilmiş bir kap içinde lamel inkübe edin. Dikkatle künt bir iğne ile parafilm gelen lamelleri kaldırın. Akış odasının alt kısmında lamel monte edin. </li></ol></li><li> Plastik Kaplama Endotel Hücreleri ile Fiş <ol><li> Coat plastik makbuzları(1-çukurlu PCA hücre kültür odası, Sarstedt, Almanya) PBS içinde% 1 jelatin çözeltisi, 1 ml ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. Jelatin kaplı plastik makbuzları Tohum insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC&#39;ler), ve 70-80% konfluansa kadar bunları büyür. Akış odasının alt kısmında plastik kayma monte edin. </li></ol></li><li> Perfüzyon Deney Not: In vitro perfüzyon modeli şematik bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. <ol><li> Farklı fizyolojik akış koşullarını simüle etmek için 2.5 din / cm2 ve 20 din / cm2 arasında bir laminer kesme stresinde mikro paralel plaka akış odasının in vitro bakteriyel yapışma çalışmaları gerçekleştirin. </li><li> Akış odası (in-house tasarım) bir metal çerçeve ve pleksiglas yapılmış bir perfüzyon odasına (poli (metil) (PMMA)) oluşur. Yüksek doğruluk infüzyon pompası (PHD 2000 İnfüzyon, Harvard Aparatı, ABD) bağlayarak, biz akış ra üretebilir0.0001 ul / dk ve 220,82 ml / dk tes. </li><li> Akış odasının üst kısmına boru bağlayın ve tüp orta enjekte. Yavaşça taban kısmının üst akış bölmesinin üst kısmı yerleştirin ve akış odası monte edin. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olun. Odacık sızıntı olmadığından emin olmak için ve fazla kaplama çözümü kaldırmak için haznesinden orta 1 ml enjekte edilir. Hava kabarcıkları kaçının. </li><li> Bir mikroskop tepsiye 37 ° C&#39;de bir termo-kontrollü ısıtma yastığı fare yerleştirin. Bu, bir terminal işlemi olduğu için, sıkı asceptic işlemleri için bir ihtiyaç vardır. Şahdamarından yakın bir kesi yapmak, nazikçe servikal kas sağ tarafını kaldırın ve çevre dokudan juguler ven izole. </li><li> Infüzyon pompası ve floresan mikroskop ayarlayın. İnfüzyon pompası ayarları şırınga çapı ve istenilen debi (Bölüm 2.4 bakınız) bağlıdır. Şu andan itibaren, karanlık bir odada çalışıyoruz. </li><li> VWF Kaplama: <ol><li> Flüoresan etiketli bakteriler ile bir şırınga doldurun ve giriş borusu bağlayın. Hava kabarcıkları kaçının. 10 dakika infüzyon Pompayı çalıştırın. İnfüzyon süresi kullanılan kesme hızı ve kaplamanın, bakteri ve ortama bağlıdır ve yapışma sürekli durumunu temsil etmelidir. </li><li> 10 dakika sonra, giriş tüpü PBS ile bir şırınga bağlanması ve infüzyon pompası başlayarak bağlanmamış bakterileri uzak yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra farklı yerlerde en az 15 fotoğraf veya film çekin. Bakteriler odaklanmak, küçük ve potansiyel güçtür. In vitro olarak akış Deneyden önce, uygun bir odak düzlemi, bir lamel flüoresan etiketli bakteriler bir damlasının yerleştirilmesiyle ve akış odası içinde lamel yerleştirerek elde edilebilir. Ardından, uygun odak düzlemi aramak ve ayarları kaydedin. NOT: in vitro akış deney sırasında, yıkama aşamasında fotoğraf çekimi (başladıktan sonra ± 5 dakika) sağlayan sadeceyapışık bakteriler için sinyal yakalanır. </li></ol></li><li> Kollajen Kaplama: <ol><li> Sadece perfüzyon başlamadan önce floresan etiketli bakteri 60 ug / ml VWF ekleyin. 60 ug / ml ile takviye edilmiş VWF floresan etiketli bakteriler ya da flüoresan etiketli bakteriler ile bir şırınga doldurun ve giriş borusu bağlayın. Hava kabarcıkları kaçının. Tekrarlayın 2.3.5.2 2.3.5.3 adımları </li></ol></li><li> Endotel Hücreleri: <ol><li> Ca + 2 -ionophore A23187 bir 0.1 mM çözeltisi ile perfüzyon ile endotel hücrelerini aktive bir perfüzyon yoluyla, 10 dakika boyunca bakteriyel perfüzyon aynı kesme oranında DMEM (stok çözelti, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülmüştür, 10 mM) 0.1 mM. Tekrarlayın 2.3.5.3 Kalorifer kadar 2.3.5.2 adımları. </li></ol></li></ol></li><li> Aşağıdaki gibi kayma hızı ve kayma gerilmesi hesaplayın. Kayma hızı = 6Q / wh 2 Q: a ml / dak oranı, akış: cm genişlik, H: cm yükseklik Kesme gerilmesi (τ) = kayma sıçanEski viskozite (μ) Nerede μ: Ortam: 0.01 din x sn / cm2, tam kan: 0,04 din x sn / cm2 </li><li> Görüntü analizi <ol><li> Siyah beyaz kamera ile ters bir floresan mikroskop kullanılarak canlı görüntüleri elde etmek ve görüntüleme yazılımı kullanarak geliştirmek. 1.5 sn pozlama süresini kullanın. Rastgele akış odasının kaplanmış yüzeye yayılmış çoklu fotoğraf (en az 15) alın ve uygun dosya biçiminde kaydedebilirsiniz. </li><li> ImageJ ile görüntü analizi yapın. Ve ilgi özelliklerine içine gri tonlu görüntüleri segmentlere, alt ve üst eşik değerlerini ayarlamak için eşiğini tanımlamak - Görüntünün (substract Arkaplan Süreci) pürüzsüz, sürekli arka kaldırmak için arka plan çıkarın. Eşik sınırlı alanı ölçün. </li><li> Bakteriyel yapışma karşılaştırın, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak, örneğin flüoresan alanı olarak ifade edilir. Tek yönlü ANOVA veya t kullanan gruplar karşılaştırwo kuyruklu Student t testi. Ortalama (SEM) ortalama ± standart hata olarak tüm değerleri bildirin. Önemli &lt;0.05 p değeri düşünün (* p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; *** p &lt;0.001). </li></ol></li></ol> Vivo Mezenterik Perfüzyon Modeli 3. <ol><li> Farenin Hazırlama / cerrahi <ol><li> Bağırsak hareketi sınırlamak amacıyla deney gece önce fare Hızlı. </li><li> Buprenorfın bir deri altı enjeksiyon cerrahi öncesi (0.1 mg / kg vücut ağırlığı (BW)) 20-30 dk ile 6-8 haftalık fare (C57Bl / 6) ameliyat öncesi analjezi ver. </li><li> Intra-peritoneal ketamin enjeksiyonu (125 mg / kg BW) ve xylazine (12.5 mg / kg BW) tarafından fare anestezisi. Pedal refleks edin. Kuruluğunu önlemek için veteriner merhem sürün. </li><li> Bir mikroskop tepsiye 37 ° C&#39;de bir termo-kontrollü ısıtma yastığı fare yerleştirin. Bu, bir terminal işlemi olduğu için, sıkı ascepti için bir ihtiyaç vardırc prosedürleri. Şahdamarından yakın bir kesi yapmak, nazikçe servikal kas sağ tarafını kaldırın ve çevre dokudan juguler ven izole. </li><li> Floresan etiketli bakteriler ya da diğer çözeltiler infüzyonu için sağ boyun damarına bir 2 Fransız kateter yerleştirin. Orta hat insizyon aracılığıyla periton boşluğuna açın ve Mezenterium yaymak için pamuklu çubuklarla kullanabilir ve mezenterik arteryolar ve venüler dolaşımını görselleştirmek için. </li><li> Şeffaf bir plaka üzerinde sağ tarafta fare yerleştirin ve bantla kanül sabitleyin. Hipotermi önlemek için sıcak bir takımı kullanınız. Doku kaybını önlemek için, bağırsakların 500 ul% 0.9 NaCl bırakın. </li></ol></li><li> Mezenterik dolaşıma bakteriyel yapışma floresan mikroskopi <ol><li> Karanlık bir odada çalışın. Damarları hareketsiz ve ters bir mikroskop altında görselleştirmek için pamuklu çubuklarla kullanın. </li><li> Topikal bir 10 mM&#39;lik bir çözeltisi, O 5 ul geçerlidirf Ca 2 + -ionophore A23187 DMSO içinde çözülmüştür. 10 saniye sonra, juguler kateter yoluyla bakteri etiketli 100 ul (adım 1) enjekte edilir. Time-lapse fotoğraf çekmek. Deney bittikten sonra, kurumsal onaylı kurallarına göre fare euthanize. </li></ol></li><li> Görüntü Analizi <ol><li> Siyah beyaz kamera kullanarak herhangi bir görüntüleme yazılımı kullanılarak geliştirilen yakalanan bir ters floresan mikroskop kullanarak canlı görüntüleri edinin. Otomatik pozlama süresini ve kullanılan ekipman özel kontrast optimizasyonu uygulayın. </li><li> 1000 images / sn 40 döngü kullanarak - araç çubuğunda &#39;Toplama&#39; aracını (Zaman çok boyutlu Devralmalar) kullanarak time-lapse görüntüleri edinin. Uygun bir görüntü dosyası formatında görüntü kaydetmek. </li><li> Görüntü başına floresan sinyal alanı ölçmek için ImageJ analiz yazılımı kullanılarak işlem ve görüntüler. F içine gri tonlu görüntüleri segmentlere, alt ve üst eşik değerlerini ayarlamak için eşik tanımlayınilgi eatures. Faiz (kan damarı) bölgesini tespit ve eşik ve ilgi bölgeye sınırlı alanı ölçün. Bakteriyel yapışma karşılaştırın, herhangi bir istatistik veya grafik yazılımı kullanarak floresan alan olarak ifade edilmiştir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid/endothelial+cell+interaction+under+shear+stress.">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li><li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Willebrand+factor-binding+protein+(vWbp)+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase.">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li><li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation.">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation.">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections.">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li><li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kesme gerilmesi damar duvarına erken bakteriyel yapışma ve endovasküler veya endokardiyal vejetasyon ve metastatik enfeksiyonların 4,5 müteakip nesil için çok önemli bir faktördür. Fizyolojik makaslama gerilimi altında endovasküler enfeksiyonların hastalık oluşumunun incelenmesinde, in vitro ve in vivo modellerde tamamlayıcı tarif. Bu modeller bize büyük S. olarak von Willebrand faktör bağlayıcı protein (vWbp) tanımlamak için izin aureus protein VWF 4 açığa yaralı bir damar duvar ile akış altında etkileşim. Endovasküler enfeksiyonları ve özellikle enfektif endokardit, aynı zamanda, çünkü yerel ve uzak (&#39;metastatik&#39;), komplikasyon, çünkü sadece sepsis kaynaklı organ yetmezliği ve ölüm endişe vardır. Enfektif endokardit ve metastatik enfeksiyonlara neden için, bakteri damar duvarına yapışır ve böylece kan akan kayma gerilmesi karşı zorunda. Çoğubakteriler üzerinde çalışmalar faktörleri statik koşullarda yapılmıştır virülansa. Ancak, bu kurulan etkileşimleri bakteri-konak etkileşimi yeni, daha önceden tanınmayan faktörleri ortaya çıkarabilir akış şartlarında kesme kuvvetlerini ve çalışmalar dayanacak olmayabilir. Mikro paralel bir akış odasından kullanarak, ve diğerleri, vasküler yapışma VWF önem taşıdığını göstermiştir. Makaslama stres altında giderek Unfolds dinlenme küresel yapıdan VWF ve onun GPIb reseptörü 6 vasıtasıyla trombositler ile etkileşime A1 alanını ortaya çıkarır. Akış odaları yoğun trombosit fonksiyonu 7 incelemek için kullanılmıştır. Dikkate değer, ayrıca S. akış altında aureus yapışma kesme sırasında maruz A1 etki VWF gerektirir, ve özellikle. Biz vWbp VWF bağlayıcı arabuluculuk belirledi. vWbp S. katkıda bulunan bir koagülaz olduğunu Ev sahibinin protrombini aktive ederek aureus patofizyoloji. Staphylothrombin, resbakteriyel Koagulaz ve protrombin kompleksi ulting, çözünmeyen fibrin 8,9 içine fibrinojen dönüştürür. Çalışmalarımız vWbp sadece protrombini aktive etmediğini göstermiştir, ancak akış 4,10,11 altında kan damarlarının yapışmasını geliştirmek bakteri fibrin-trombosit agrega, oluşumunu tetikler var. in vitro akış odası modeli hücresel veya matris bileşenleri bakteriyel yapışma farklı oyuncuları çalışma sağlar. Bakteriyel virülans faktörleri spesifik yüzey proteinleri ifade mutantlar veya zararsız bakteriler kullanılarak incelenebilir. Seçenek olarak ise, farmakolojik inhibitörleri ya da bloke edici antikorlar, akış odasının ortama ilave edilebilir. gibi hücre dışı matrisin farklı bileşenler olarak ana faktörlerin rolü farklı kaplamalar ile lamelleri kullanılarak incelenebilir. lamelleri da aktivasyon durumu spesifik stimülatörlerinin eklenerek modüle edilebilir olan endotel hücreleri ile kaplı olabilir. Apavasküler duvar RT konakçı kan hücreleri ve plazma proteinlerinin katkısı akan ortam için bu faktörleri eklenerek incelenebilir. Böylece, artan karmaşıklık farklı koşullar bakteri in vivo damar duvarına yapışma sağlayan etkileşimleri çözülmeye laminer akış standart koşullar altında incelenebilir. In vitro modelde tanımlanan etkileşimi, daha sonra, bir organizma içindeki önemini test etmek için bir hayvan modelinde incelenmiştir. Akış altında dinamik etkileşimler üzerinde çalışmak için in vivo modeller tür diğer hamsteri dorsal deri altı bölme 12 ve cremaster modeli 13 olarak tarif edilmiştir. Buna karşılık, burada açıklanan mezenterik perfüzyon modeli, olasılık farelerin genetik arka plan ev sahipliği değişir ve farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesi nedeniyle kullanım kolaylığı ve çeşitli avantajlar sunuyor. Sonuç olarak, modeller tarifS. sadece yüzey proteinleri çalışma imkanı sunuyoruz aureus, ancak farklı konakçı geçmişleri diğer birçok mikroorganizma, daha iyi damar enfeksiyonlarının patogenezi anlamak için.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table><tbody><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>fluorescent labeling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm collagen</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>collagen</td></tr><tr><td>1-well PCA cell culture chambers</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>plastic slips</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorphine</td></tr><tr><td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>ketamin</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xylazine</td></tr><tr><td>2 french intravenous catheter green</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionophore solution A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&amp;nbsp; with needle</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300015</td><td>intra-peritoneal injection</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>Thickness No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusion</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>High-accuracy Harvard infusion pump</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Inverted fluorescence microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Graphpad Software</td><td>Analysis software</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&amp;nbsp;</td><td>Black and white camera</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

Endovasküler enfeksiyonları ve infektif endokardit neden olmak için, bakteriler, kan akışı kesme stresine maruz kalma sırasında damar duvarına yapışma mümkün olması gerekmektedir. Mikroorganizmaların damar yapışmasına katkıda bakteriyel ve konakçı faktörleri belirlemek için, fizyolojik kayma koşulları altında bu etkileşimleri çalışmak uygun modeller ihtiyaç vardır. Burada, biz ekstraselüler matriksin farklı bileşenleri bakteriyel yapışma araştırmak ya da endotel hücrelerine sağlayan bir in vitro akış odası modeli tarif ve geliştirilmiş bir intravital mikroskopi modeli doğrudan in vivo splanknik dolaşıma bakterilerin ilk yapışma görselleştirmek için . Bu yöntemler akışı altında bakteri yapışma için gerekli bakteriyel ve ana faktörleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz kayma gerilmesi alaka ve staphy yapışması için von Willebrand faktör rolünü göstermektedirlococcus aureus, hem in vitro hem de in vivo modelinde kullanılmıştır.

VWF S. aureus yapışma, subendotelyal matriks ve endotel hücreleri bir kayma gerilmesi bağımlı bir olgudur S. arasındaki etkileşimde kayma gerilmesi rolünü vurgulamak için aureus ve vWF, farklı kayma hızlarında ile kaplanmış kapak sliplerine (in vitro perfüzyon modeli şematik bir genel S. aureus 1. Yapışma 250 sn arasında artan kesme oranlarında arttığı vWF Şekil verilmiştir -1 2.000 VWF fazla perfüzyonunu gerçekleştirilen sn-1 (Şekil 2), yüksek kesme kuvvetleri önleyen fakat VWF bakterilerin yapışmasını güçlendirmek yok olduğuna işaret etmektedir. Kollajen bakteriyel yapışma VWF katkısını araştırmak amacıyla, subendotelyal matrisinin başlıca bileşeni olan biz floresan etiketli S. perfüze VWF varlığında veya yokluğunda kolajen üzerindeki aureus. VWF, S. yapışma yokluğunda birkolajen ureus kesme oranları arttıkça azalmıştır. Bununla birlikte, VWF ortam içinde mevcut olduklarında olduğunu, S. yapışması aureus kayma oranları (Şekil 3) birlikte artmaktadır. In vitro akış modeli aynı zamanda akış altında endotel hücrelerine bakterilerin yapışmasını incelemek için bize izin verir. Biz HUVECler ile floresan S. etiketli perfüze kayma hızlarında 500 ila 2,000 sn aureus -1. Burada, belirtilen HUVECler VWF salınmasına neden olmak için, bir Ca2 + -ionophore ile aktive edildi. Endotel hücre aktivasyonu ve ardından VWF salma, S. artan yapışması Tipik &quot;dizge&quot; gibi desenler oluşturulmuş aureus (Şekil 4A), floresan doğrusal gerilmiş VWF molekülü boyunca bakteri bağlanmasını gösteren kesme kuvveti (Şekil 4B) yönünde hizalanmış bakteriyel kümeler, etiketli. Başlangıç ​​in vivosplanknik damarlarındaki bakteriyel yapışma VWF aracılık eder S. yana in vivo olarak aktif damar duvarına bakteriyel yapışmayı araştırılması - (- / vWF) aureus VWF bağlı mümkün olduğu için, (vWF + / +) ve vWF-eksikli farenin vahşi tipli fare kullanılır. Splanknik venlerin Gerçek zamanlı videomikroskopi floresan S. etiketli dolaşımdaki in vivo görselleştirme izin aureus (in vivo perfüzyon modeli şematik genel görünüşü Şekil 5&#39;de temsil edilmiştir) hazırlandı. Ca + 2 -ionophore tarafından endotelyumun farmakolojik aktivasyonu sonra WT farelerinde damar duvarına tek tek bakteri ve bakterinin agrega hızlı yerel birikimi gözlendi (ek video 1 ve 2). Bakteriler hemen hemen hiç bir yapışma vWF -deficie aktive damar duvarı izlendint fareleri (ek video 3) WT farelerde yapışma ile karşılaştırıldığında (Şekil 6). VWF yokluğu S. yeteneği azalır aureus aktif damar duvarına yapışma. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Şekil 1 in vitro olarak akış modelinin şematik bir temsili., In vitro akışı modeli, subendotelyal matrise bakteriyel yapışma gibi farklı kesme bağımlı mekanizmaların çalışmasını sağlayan bir çok fonksiyonlu bir model, ama aynı zamanda oluşumu trombus. Mikro paralel bir akış odasından proteinleri ve endotel hücrelerinin, farklı kaplamalar ile bir lamel (plastik veya cam) üzerine yerleştirilir. Farklı bakterilerin (turuncu ve siyah nokta) yapışması analiz edilebilir ve plazma proteinleri, trombositler ve tam kan varlığında etkisi değerlendirilebilir. Trombositlerin (mavi oval) ya da fibrinog için fluoresan işaretleyicilertr (mavi şeritler), bakteriyel ve ana faktörleri ayırt farklı önleyicileri (siyah ovaller) ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. S. bakteriyel yapışma Temsilcisi görüntüleri VWF&#39;nin varlığı (altta) kollajen kaplama ya da yokluğu (üst) aureus (ölçek çubuğu 100 mikron olan) gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> S. Şekil 2. Yapışma makaslama oranlarının artırılması ile VWF artar aureus. kaplanmış VWF üzerinde Mikro-paralel akış odası perfüzyon (/ ml 50 ug) ile floresan S. etiketli orta 250 sn -1 (sn -1) 2,000 makaslama oranları (n&gt; 5) de aureus Newman. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> S. Şekil 3. Yapıştırma subendotelyuma aureus kayma ve VWF bağlıdır. ile floresan etiketli S. Kaplı kollajen (160 ug / ml) üzerindeki mikro-paralel bir akış odasından perfüzyon orta 250 sn 2,000 -1 makaslama oranları (n&gt; 5) de aureus Newman. Aksi belirtilmediği VWF (60 ug / ml), ortam içinde mevcuttu. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. ** P &lt;0.01. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> S. Şekil 4. yapışması aktive endotel hücrelerine aureus endotel hücreleri üzerinde kayma bağımlı. Mikro paralel akış odası perfüzyon olduğunu. (A) insan göbek damar endothelial hücreleri Ca + 2 -ionophore A ile aktive edildiFloresan etiketli S. 10 dakika perfüzyon takiben 23.187 (0.1 mM) orta 500 sn 2,000 -1 makaslama oranları (n&gt; 5) de aureus Newman. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. * P &lt;0.05. S ile aktive edilmiş HUVEC üzerinde mikro paralel bir akış odasından perfüzyon (B) Görüntü 1000 saniyelik bir kesme hızında -2. S. de aureus aureus VWF multimerleri yapışma (ölçek çubuğu 100 mikron olan) düşündüren, ± 200 mikron uzunluğunda dizeleri oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Şekil 5. in vivo mezenterik perfüzyon modelinin şematik bir bakış. Sağ juguler ven kateteri (sarı hat) flor uygulaması için eklenirescently etiketli bakteriler (turuncu nokta) ilave anestetikler ya da farmasötik inhibitörleri ve antikorlar gibi diğer bileşenler. periton boşluğu açıldı ve Mezenterium flöresanlı bir mikroskop altında kan damarları (venöz ve arteriyel) görselleştirmek için yayılır. VWF salınmasını uyaran bir Ca2 + -ionophore tarafından endotelyumun farmakolojik hale getirilmesinden sonra, bakteriler jugular damar kateteri yoluyla enjekte edilebilir. Gerçek zamanlı intravasküler bir video mikroskobu floresan etiketli bakteri dolaşan in vivo görselleştirme ve bakteri-trombosit trombüs çıkan oluşum. Tanır <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Şekil 6. S. ilk yapışma aureus- / - farelerin., in vivo ortamda aktive edilmiş endotele C57BL / 6, vWF + / + ve C57BL / 6-VWF VWF in vivo venöz mezenterik perfüzyon modeli tarafından aracılık etmek. Yapışma floresan etiketli S. / - - fareler yerel aktif damar duvarına aureus vWf anlamlı derecede düşük olduğunu. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. *** P &lt;0.001, n&gt; 7. <img alt="Video Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: S. Gerçek zamanlı yapışma aureus vWf + / + farelerde aktive damar duvarına. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Video 2: Gerçek zamanlı toplu oluşumu ve S. embolizasyon aureus vWf + / + farelerde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3, video" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: S. Gerçek zamanlı yapışma - / - farelerde - / -. vWF + / + ve VWF farelerde in vivo mezenterik perfüzyon modelinde aureus vWF aktif damar duvarına. Bir Ca2 + -ionophore (10 mM) Beş ul başvurunun oldugörüntülenmiştir vasküler yatağın bölgeye ed. Karboksi-floresin etiketli S. içindeki bir aureus, juguler kateter aracılığıyla enjekte edilmiştir. mezenterik dolaşım ters bir mikroskop altında görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.6K Görüntüleme.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Video: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

SynVivo Sentetik Mikrovasküler Ağları kullanma Kesme Yapışma Haritası Üretimi

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Biyomühendislik

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...