עבודה זו נתמכה על ידי חטיבות voor Wetenschappelijk Onderzoek (כשיש שתיים) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;אדי מרקס מענק מחקר&quot; ו&quot; ספורטה המחקר גרנט &quot;לקרדיולוגיה ילדים, UZ לובן, בלגיה (JC); המרכז לביולוגיה מולקולרית כלי דם נתמך על ידי Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), על ידי &quot;Onderzoeksacties Geconcentreerde&quot; (GOA 2009/13) מאוניברסיטת לובן ומענק מחקר מBoehringer Ingelheim-.

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של לובן KU. 1. חיידקים הכנה לזילופי מבחנה ובניסויים בVivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשנו ס aureus מתח ניומן לכל הניסויים שתוארו בכתב היד הזה. ס aureus ניומן היה מאוחסן במוח לב עירוי (BHI) עם גליצרול 10% ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לולאת סטרילי כדי לגרד את החיידקים קפואים ומלחסן בO 5 מיליליטר tryptic סויה מרק (TSB) / N ב 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה (2,600 גרם, RT, 5 דקות) וresuspend גלולה חיידקים ב5 מיליליטר PBS (פוספט שנאגרו מלוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 מ&quot;ג / מיליליטר 5 (6) אסתר -carboxy-והעמסת N-hydroxysuccinimidyl (carboxy-והעמסת) באתנול. לדלל את 1 מ&quot;ג הפתרון / מיליליטר carboxy-והעמסת 150 מיקרוגרם / מיליליטר במי כיתה מעבדה (למשל, המים MilliQ). להגן על הצינורות מן האורבנייר האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה החיידקים (2600 XG, RT, 5 דקות). Resuspend גלולה חיידקים ב800 μl PBS ולהוסיף 200 μl (ריכוז סופי של 30 מיקרוגרם / מיליליטר לניסויי זלוף) או 400 μl (ריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר לניסויי in vivo) של / מיליליטר פתרון carboxy-והעמסת 150 מיקרוגרם. להגן על הצינורות מן האור עם רדיד אלומיניום דגירה במשך 30 דקות ב RT על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תיוג, בלוק עם 6% פתרון שור אלבומין בסרום (BSA) ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל חיידקים באמצעות צפיפות אופטית (OD), OD 600 של 0.65 לניסויים במבחנה (המקביל ל 3 x 10 8 יחידות כ מושבה להרכיב (CFU) / מיליליטר לS. aureus) וOD 600 של 1.8 לin vivo ניסויים ( מתאים לכ 1 x 10 9 CFU / ml עבור ס aureus) ב- PBS. להגן על הצינורות מן האור עם רדיד אלומיניום ולהשאיר על קרח. </li></ol> 2. ניסויים במבחנה זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של Coverslips הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל גורם פון Willebrand (VWF) (Haemate P, 2,400 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז המלאי) במי כיתה מעבדה (Deionized מזוקק) לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל קולגן בתמיסה איזוטונית גלוקוז (פתרון SKF, pH 2.7-2.9, כפי שסופקו על ידי היצרן) לריכוז סופי של 160 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית מעיל (24 × 50 מ&quot;מ) עם VWF או קולגן על ידי הטלת 200 μl של הציפוי על parafilm ולמקם את coverslip על גבי אגל. אגל יתפשט על פני השטח של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslip במכל humidified במשך 4 שעות ב RT. רם בזהירות את coverslips מparafilm עם מחט קהה. הר coverslip בחלק התחתון של תא הזרימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של פלסטיק מחליקה עם תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלושי פלסטיק מעיל(1-גם תא תרבית תאי PCA, Sarstedt, גרמניה) עם 1 מיליליטר של פתרון ג&#39;לטין 1% ב- PBS והדגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. תאי זרע אנושיים וריד טבור אנדותל (HUVECs) בתלושי הפלסטיק מצופה ג&#39;לטין ולגדל אותם לconfluency 70-80%. הר להחליק הפלסטיק בחלק התחתון של תא הזרימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסוי זלוף הערה: סקירה סכמטי של במבחנה המודל זלוף מיוצגת באיור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע במבחנה הידבקות חיידקים בזרם צלחת תא מיקרו מקביל במאמץ גזירת מינרית בין 2.5 דיין / 2 סנטימטר ו -20 דיין / 2 סנטימטר כדי לדמות תנאי זרימה פיסיולוגיים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (העיצוב בבית) תא זרימה מורכב מסגרת מתכת וחדר זלוף עשוי מפרספקס (פולי (מתיל) methacrylate (PMMA)). על ידי חיבורו למשאבת דיוק גבוה עירוי (PHD 2000 עירוי, הרווארד Apparatus, ארה&quot;ב), אנחנו יכולים ליצור תזרים raTES בין 0.0001 μl / דקה ו220.82 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הצינור לחלקו העליון של תא הזרימה ולהזריק בינוני בצינור. מניח בעדינות את החלק העליון של תא הזרימה על גבי החלק התחתון ולהרכיב את תא הזרימה. להיות זהיר, כדי למנוע בועות אוויר. הזרק 1 מיליליטר של מדיום דרך החדר כדי לוודא שהתא לא דולף ולהסיר פתרון ציפוי עודף. למנוע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על כרית חימום מבוקר תרמו על 37 מעלות צלזיוס במגש מיקרוסקופ. מכיוון שמדובר בהליך מסוף, אין צורך בהליכי asceptic קפדן. עושה חתך ליד וריד הצוואר, להסיר בעדינות בצד ימין של שריר צוואר הרחם ולבודד את וריד הצוואר מהרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משאבת העירוי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגדרות משאבת עירוי תלויות בקוטר המזרק ואת קצב הזרימה הרצוי (ראה סעיף 2.4). מעתה והלאה, לעבוד בחדר חשוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VWF ציפוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק עם חיידקים שכותרתו fluorescently ולחבר אותו לצינור הכניסה. למנוע בועות אוויר. התחל משאבת העירוי למשך 10 דקות. זמן העירוי תלוי בשיעור הגזירה וציפוי, חיידקים ובינוניים המשמש וצריך לייצג את המצב היציב של הידבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לשטוף את החיידקים מאוגד על ידי חיבור מזרק עם PBS לצינור הכניסה ומתחיל את משאבת העירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח לפחות 15 תמונות או סרטים במקומות שונים לאחר תהליך השטיפה. חיידקים הם קטנים וקשים שעלולים להתמקד ב. לפני במבחנה ניסוי הזרימה, מישור המוקד המתאים יכול להאסף על ידי הצבת ירידה של חיידקים שכותרתו fluorescently על coverslip והצבת coverslip בתא הזרימה. לאחר מכן, לחפש את מישור המוקד המתאים ולשמור את ההגדרות. הערה: במהלך הניסוי במבחנה הזרימה, לכידת התמונות במהלך שלב הכביסה (± 5 דקות אחרי ההתחלה) מבטיחה כי רקאות לחיידקים חסיד הוא נתפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולגן ציפוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף VWF / מיליליטר 60 מיקרוגרם לחיידקים שכותרתו fluorescently רק לפני שמתחיל זלוף. ממלאי מזרק עם חיידקים שכותרתו fluorescently או חיידקים שכותרתו fluorescently בתוספת 60 מיקרוגרם VWF / מיליליטר ולחבר אותו לצינור הכניסה. למנוע בועות אוויר. חזור על שלבים 2.3.5.2 ל2.3.5.3 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי האנדותל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תאי האנדותל על ידי זלוף עם פתרון 0.1 מ&quot;מ של Ca 2 + -ionophore A23187 (פתרון מניות 10 מ&quot;מ מומס בsulfoxide דימתיל (DMSO)) בDMEM באותו שיעור הגזירה כזלוף החיידקים במשך 10 דקות על ידי זלוף עם 0.1 מ&quot;מ. חזור על שלבים 2.3.5.2 ל2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב שיעור גזירה ולחץ גזירה כדלקמן. שיעור גזירה = 6Q / ש&quot;ש 2 איפה: ש: קצב זרימה במ&quot;ל / דקה, w: רוחב בס&quot;מ, שעות: גובה בס&quot;מ מאמץ גזירה (τ) = חולדה גזירהצמיגות לשעבר (μ) איפה μ: בינוני: 0.01 שניות dynes / 2 סנטימטר, כל דם x: 0.04 שניות dynes x / 2 סנטימטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות חיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמה בשחור לבן ולפתח באמצעות תוכנת הדמיה. השתמש בזמן חשיפה של 1.5 שניות. לצלם תמונות מרובות (לפחות 15) להפיץ באופן אקראי על פני המשטח המצופה של תא הזרימה ולשמור אותם בפורמט של הקובץ המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח תמונה עם ImageJ. הפחת את הרקע כדי להסיר רקע רציף וחלק מהתמונה (תהליך - רקע Substract) ולהגדיר את הסף להגדרת ערכי סף תחתון ועליונים, פילוח תמונות גוניות אפורות לתכונות של עניין. למדוד את השטח מוגבל לסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקלו את הידבקות חיידקים, מתבטא בשטח ניאון, למשל, באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית. השווה את הקבוצות באמצעות ANOVA חד-כיווני או לאמבחן T- של הסטודנטים זנב וו. דווח על כל הערכים כשגיאת ± סטנדרטי הממוצעת של הממוצע (SEM). שקול ערך p- של &lt;0.05 משמעותיים (* p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; *** p &lt;0.001). </li></ol></li></ol> 3. בVivo mesenteric זלוף דגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה / ניתוח של העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצום עכבר הלילה שלפני הניסוי כדי להגביל את תנועת מעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן עכבר 6-8 בן שבוע (C57Bl / 6) שיכוך כאבים טרום ניתוחיים על ידי הזרקה תת עורית של עצירות (0.1 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף (BW)) דקות 20-30 לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של קטמין (125 מ&quot;ג / קילוגרם BW) וxylazine (12.5 מ&quot;ג / קילוגרם BW). בדוק על ידי רפלקס דוושה. החל משחה וטרינר כדי למנוע יובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על כרית חימום מבוקר תרמו על 37 מעלות צלזיוס במגש מיקרוסקופ. מכיוון שמדובר בהליך מסוף, אין צורך בascepti קפדןנהלי ג. עושה חתך ליד וריד הצוואר, להסיר בעדינות בצד ימין של שריר צוואר הרחם ולבודד את וריד הצוואר מהרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר תוך ורידי צרפתי 2 לוריד הצוואר הימני לעירוי של חיידקים שכותרתו fluorescently או פתרונות אחרים. פתח את חלל הצפק דרך חתך בבטן קו האמצע ולהשתמש צמר גפן כדי להפיץ את mesenterium ולדמיין arteriolar mesenteric ומחזור venular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בצד ימין על צלחת שקופה ולאבטח את הצינורית עם קלטת. השתמש חבילה חמה כדי למנוע היפותרמיה. כדי למנוע התייבשות של הרקמות, שחרר 500 μl 0.9% NaCl במעיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הידבקות חיידקים למחזור mesenteric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד בחדר חשוך. השתמש צמר גפן כדי לשתק את כלי השיט ולדמיין אותם תחת מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מריחה להחיל 5 μl של o פתרון 10 מ&quot;מו A23187 -ionophore Ca 2 + מומס DMSO. לאחר 10 שניות, להזריק 100 μl כותרת חיידקים (ראה שלב 1) דרך קטטר וריד הצוואר. קח זמן לשגות תמונות. לאחר הניסוי סיים, להרדים את העכבר על פי הנחיות שאושרו מוסדיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות חיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, שנתפס באמצעות מצלמה בשחור לבן ופותח באמצעות כל תוכנת הדמיה. החל זמן חשיפה אוטומטי ואופטימיזציה ניגוד מסוימת לציוד המשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש זמן לשגות תמונות באמצעות הכלי &#39;הרכישה&#39; בסרגל הכלים (רכישות רב ממדי - זמן) באמצעות 40 מחזורים של 1,000 תמונות / sec. שמור את התמונות בפורמט קובץ תמונה מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות תהליך באמצעות תוכנת ניתוח ImageJ למדוד את השטח של אות ניאון לכל תמונה. הגדר את הסף להגדרת ערכי סף תחתון ועליונים, פילוח תמונות גוניות אפורות לתוך Features של עניין. זהה את האזור של עניין (כלי דם) ולמדוד את השטח מוגבל לסף והאזור של עניין. שקלו את הידבקות חיידקים, מתבטא בשטח ניאון באמצעות כל תוכנה סטטיסטית או גרפים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid/endothelial+cell+interaction+under+shear+stress.">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li><li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Willebrand+factor-binding+protein+(vWbp)+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase.">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li><li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation.">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation.">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections.">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li><li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מאמץ גזירה הוא גורם מכריע להידבקות חיידקים מוקדם לקיר הכלי ועבור הדור הבא של endovascular או vegetations endocardial וזיהומים גרורתי 4,5. תארנו משלים במבחנה ובמודלי vivo ללמוד את הפתוגנזה של זיהומי endovascular תחת מאמץ גזירה פיסיולוגי. מודלים אלה אפשרו לנו לזהות חלבון פון Willebrand מחייב גורם (vWbp) כס המרכזי חלבון aureus לאינטראקציה תחת זרימה עם קיר כלי דם פגוע חושף VWF 4. זיהומי Endovascular, ואנדוקרדיטיס זיהומית בפרט, הם דאגה לא רק בגלל כשל איברים מושרה אלח דם ומוות, אלא גם בגלל סיבוכים מקומיים ומרוחקים (&quot;גרורתי&quot;). לגרום לאנדוקרדיטיס זיהומית וזיהומים גרורתי, חיידקים יש לדבוק בקיר הכלי ובכך לעמוד בלחץ הגזירה של זורם דם. רובמחקרים על חיידקי גורמי אלימות בוצעו בתנאים סטטיים. עם זאת, אינטראקציות המבוססות אלה עלולים שלא לעמוד בכוחות ומחקרי גזירה תחת תנאי זרימה יכולה לחשוף גורמים חדשים, בלתי מוכרים בעבר ביחסי גומלין חיידקים-מארח. שימוש בתא זרימת מיקרו-המקביל, אנחנו ואחרים הראינו את החשיבות של VWF להידבקות של כלי דם. תחת מאמץ גזירה, VWF הדרגה נפרשות מהמבנה הכדורי מנוחתו, וחושף את תחום A1 שאינטראקציה עם טסיות דם באמצעות קולט GPIB 6. תאי זרימה נעשו שימוש נרחב ללמוד לתפקד טסיות דם 7. למרבה הפלא, גם ס הידבקות aureus תחת זרימה דורשת VWF, ובפרט תחום A1 שנחשף על גזירה. זיהינו vWbp לתווך VWF מחייב. vWbp הוא coagulase שתורם לס aureus הפתופיזיולוגיה ידי הפעלת פרותרומבין של המארח. Staphylothrombin, מילulting המורכב של coagulase ופרותרומבין חיידקים, ממיר את פיברינוגן לפיברין 8,9 מסיס. המחקרים שלנו הראו כי vWbp לא רק להפעיל פרותרומבין, אבל מפעיל את ההיווצרות של אגרגטים חיידקי הפיברין-טסיות, אשר משפרים את ההידבקות לכלי דם תחת זרימת 4,10,11. במבחנה מודל תא הזרימה מאפשר ללמוד את השחקנים השונים בהידבקות חיידקים למרכיבים תאיים או מטריצה. ניתן ללמוד גורמים ארסי חיידקים באמצעות מוטציות או חיידקים מזיקים לבטא חלבוני משטח ספציפיים. לחלופין, ניתן להוסיף מעכבים תרופתיים או נוגדני חסימה למדיום בתא הזרימה. תפקידם של גורמי מארח כגון מרכיבים שונים של מטריקס ניתן ללמוד באמצעות coverslips עם ציפויים שונים. Coverslips גם יכול להיות מכוסה בתאי האנדותל, שמצב ההפעלה יכול להיות מווסת על ידי הוספה לגירוי ספציפי. APART מקיר כלי הדם, התרומה של תאי דם מארח וחלבוני פלזמה ניתן ללמוד על ידי הוספת הגורמים הללו למדיום זורם. לפיכך, תנאים שונים של מורכבות גוברים ניתן ללמוד בתנאים סטנדרטיים של זרימה למינרית לפענח את האינטראקציות המאפשרות לחיידקים להיצמד לקיר כלי in vivo. אינטראקציות שזוהו במודל במבחנה הם למדו לאחר מכן במודל חיה כדי לבדוק את הרלוונטיות שלהם באורגניזם מורכב. אחר במודלי vivo ללמוד אינטראקציות דינמיות תחת זרימה תוארו, כגון תא גב אוגר skinfold 12 ומודל Cremaster 13. לשם השוואה, מודל זלוף mesenteric המתואר כאן מציע מספר יתרונות בגלל קלות שימוש, האפשרות ללהשתנות לארח רקע גנטי של העכברים ולהעריך התערבויות תרופתיות. לסיכום, תאר דגמיםמציע את האפשרות ללמוד חלבונים לא רק של ס משטח aureus, אלא של רבים מיקרואורגניזמים אחרים ברקע מארח שונה, כדי להבין טוב יותר את הפתוגנזה של זיהומי כלי דם.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

על מנת לגרום לזיהומי endovascular ואנדוקרדיטיס זיהומית, חיידקים צריכים להיות מסוגל לדבוק בקיר הכלי בעוד שנחשף ללחץ הגזירה של זורם דם. כדי לזהות את גורמי חיידקים ומארח שתורמים להידבקות של כלי דם של מיקרואורגניזמים, מודלים מתאימים שללמוד אינטראקציות אלה בתנאים פיסיולוגיים גזירה יש צורך. כאן, אנו מתארים במבחנה מודל תא זרימה המאפשר לחקור הידבקות חיידקים לרכיבים שונים של מטריקס או לתאי אנדותל, ומודל מיקרוסקופיה intravital שפותח כדי לחזות ישירות ההידבקות הראשונית של חיידקים למחזור splanchnic in vivo . שיטות אלה יכולים לשמש כדי לזהות את גורמי חיידקים ומארח נדרשים להידבקות של חיידקים תחת זרימה. אנו ממחישים את הרלוונטיות של מאמץ גזירה ואת התפקיד של גורם פון Willebrand להידבקות של Staphylococcus aureus באמצעות שתי במבחנה ובמודל vivo.

הידבקות aureus S. לVWF, מטריצת subendothelial ותאי האנדותל היא תופעה תלויה מאמץ גזירה כדי להדגיש את תפקידו של מאמץ גזירה באינטראקציה בין ס aureus וVWF, ביצעו זילופים על VWF coverslips המצופה בשיעורי גזירה שונים (סקירה סכמטי של במבחנה המודל זלוף ניתן באיור 1. הדבקה של S. aureus לVWF גדלה עם הגדלת שיעורי גזירה מ 250 שניות -1 2,000 שניות -1 (איור 2), מצביעים על כך שכוחות גזירה גבוהה לא לעכב אבל לחזק את ההידבקות של חיידקים לVWF. על מנת לחקור את התרומה של VWF להידבקות חיידקים לקולגן, המרכיב העיקרי של מטריצת subendothelial, אנחנו perfused שכותרתו fluorescently ס aureus על קולגן בנוכחות או עדר של VWF. בהעדר VWF, ההידבקות של סureus לקולגן ירד עם עליית שיעורי גזירה. עם זאת, כאשר VWF היה נוכח במדיום, ההידבקות של ס aureus גדל עם עלייה בשיעורי גזירה (איור 3). במבחנה זרימת המודל גם מאפשר לנו לבחון את ההידבקות של חיידקים לתאי אנדותל בזרימה. אנו perfused HUVECs עם כותרתו fluorescently ס aureus בשיעורי גזירה מ -500 עד 2,000 שניות -1. בהם מצויינים, HUVECs הופעלו עם Ca 2 + -ionophore, לגרום לשחרורו של VWF. הפעלת האנדותל תא ושחרור VWF לאחר מכן, הידבקות מוגברת של ס aureus (איור 4 א), שנוצר דפוסים &quot;כמו מחרוזת-&quot; טיפוסיים שהכותרת שלו fluorescently אשכולות חיידקים מיושרים בכיוון של כוח הגזירה (איור 4), המצביע על הכריכה של חיידקים לאורך מולקולת VWF-נמתח ליניארי. ראשוני in vivoהידבקות חיידקים בעורקי splanchnic מתווכת על ידי VWF מאז ש &#39; aureus הוא מסוגל לדבוק VWF, השתמשנו עכברי wildtype (Vwf + / +) וVWF לקוי עכברים (Vwf - / -) לחקור הידבקות חיידקים לדופן כלי הדם מופעל in vivo. videomicroscopy של ורידי splanchnic בזמן אמת אפשר להדמיה vivo של מחזורי שכותרתו fluorescently ס aureus (סקירה סכמטי של מודל in vivo זלוף מיוצג באיור 5). לאחר הפעלה תרופתית של האנדותל על ידי Ca 2 + -ionophore, צפינו הצטברות מקומית מהירה של חיידקים ומצרפים של חיידקים בודדים לקיר הכלי של עכברי WT (וידאו משלימה 1 ו -2). כמעט אין הידבקות של חיידקים נצפתה על קיר הכלי מופעל של -deficie Vwfעכברי NT (משלימה וידאו 3) בהשוואה להידבקות בעכברי WT (איור 6). היעדר VWF מקטין את יכולתו של ס &#39; aureus לדבוק בקיר הכלי הופעל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> איור 1. ייצוג סכמטי של במבחנה זרימת המודל. במבחנה זרימת המודל הוא מודל רב תכליתי, המאפשר חקר מנגנונים תלויים גזירה שונות כגון הידבקות חיידקים למטריצת subendothelial אלא גם פקיק היווצרות. תא זרימת המייקר מקביל מושם על coverslip (פלסטיק או זכוכית) עם ציפויים שונים של חלבונים ותאי האנדותל. ההידבקות של חיידקים שונים (כתום ונקודות אפורות) ניתן לנתח, ואת ההשפעה של הנוכחות של חלבוני פלזמה, טסיות דם וכל דם ניתן להעריך. סמני ניאון לטסיות דם (אליפסות כחולות) או fibrinogen (מחרוזות כחולות) יכול לשמש בשילוב עם מעכבים שונים (אליפסות שחורות) להבחין גורמי חיידקים ומארח. נציג תמונות של הידבקות חיידקים של ס aureus לציפוי קולגן בנוכחות (התחתונה) או היעדר (למעלה) של VWF מוצג (סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> איור 2. הדבקה של ס aureus לעליות VWF עם הגדלת שיעורי גזירה. תא זרימת זלוף מיקרו-במקביל על VWF המצופה (50 מיקרוגרם / מיליליטר) עם כותרתו fluorescently ס aureus ניומן בשיעורי גזירה של 250 עד 2,000 שניות -1 (סעיף -1) במדיום (n&gt; 5). כל התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± SEM. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> איור 3. הדבקה של ס aureus לsubendothelium הוא גזירה וVWF תלוי. תא זרימת זלוף מיקרו-במקביל על קולגן המצופה (160 מיקרוגרם / מיליליטר) עם כותרתו fluorescently ס aureus ניומן בשיעורי גזירה של 250 עד 2,000 שניות -1 במדיום (n&gt; 5). VWF (60 מיקרוגרם / מיליליטר) היה נוכח במדיום בהם מצויינים. כל התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± SEM. ** P &lt;0.01. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> איור 4. הדבקה של ס aureus לתאי האנדותל הוא מופעלים תא זרימת זלוף מיקרו-במקביל גזירה תלויה. על תאי האנדותל. (א) בתאי אנדותל וריד טבור אדם הופעלו עם Ca 2 + -ionophore23,187 (0.1 מ&quot;מ) ואחריו זלוף 10 דקות שכותרת שלו fluorescently ס aureus ניומן בשיעורי גזירה של 500 עד 2,000 שניות -1 במדיום (n&gt; 5). כל התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± SEM. * P &lt;0.05. תמונה (ב) לזלוף תא זרימת מייקר מקביל על HUVECs מופעל עם ס &#39; aureus בשיעור גזירה של 1,000 שניות -2. ס aureus יוצר מחרוזות באורך 200 מיקרון ±, המצביע על הידבקות לmultimers VWF (סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> איור 5. סקירה סכמטי של מודל זלוף mesenteric in vivo. קטטר וריד הצוואר ימני (קו צהוב) מוכנס לניהול פלואורידחיידקי שכותרת escently (נקודות כתומות), הרדמה נוספת או רכיבים אחרים כגון מעכבים ונוגדני תרופות. חלל הצפק נפתח וmesenterium משתרע לדמיין את כלי דם (ורידים ועורקים) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר הפעלה תרופתית של האנדותל ידי -ionophore Ca 2 +, אשר גורם לשחרור של VWF, ניתן להזריק חיידקים דרך קטטר וריד הצוואר. מיקרוסקופ וידאו תוך-בזמן אמת מאפשר ההדמיה in vivo של מחזורי חיידקים שכותרתו fluorescently והיווצרות חיידקי thrombi-טסיות וכתוצאה מכך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> איור 6. ההידבקות הראשונית של ס aureus<html> להאנדותל מופעל in vivo מתווך על ידי VWF בvivo ורידי מודל זלוף mesenteric עם C57Bl / 6 Vwf + / + וC57Bl / 6 Vwf -. / - עכברים. הידבקות כותרת של fluorescently ס aureus לקיר הכלי מופעל באופן מקומי הוא נמוך באופן משמעותי בVwf - / - עכברים. כל התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± SEM. *** P &lt;0.001, n&gt; 7. <img alt="איור 1 וידאו" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> וידאו 1: הידבקותו של ס &#39;בזמן אמת aureus לקיר כלי מופעל בVwf + / + עכברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="וידאו איור 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV2.jpg" /> וידאו 2: היווצרות המצרפי בזמן אמת ואמבוליזציה של ס aureus בVwf + / + עכברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <img alt="איור 3 וידאו" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> וידאו 3: הידבקותו של ס &#39;בזמן אמת aureus לקיר הופעל כלי בVwf - / -. עכברים בvivo מודל זלוף mesenteric עם Vwf + / + וVwf - / - עכברים. חמש μl של -ionophore Ca 2 + (10 מ&quot;מ) היה appliאד לאזור של מיטת כלי הדם דמיינה. השעיה של ס &#39;שכותרתו קרבוקסי-והעמסת aureus הוזרק דרך קטטר וריד הצוואר. מחזור mesenteric היה דמיין תחת מיקרוסקופ הפוכה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.6K Views.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Video: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...