Este trabalho foi financiado pelo Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Research Grant&quot; eo &quot;Sporta pesquisa Grant&quot; para Cardiologia Pediátrica, UZ Leuven, Bélgica (JC); o Center for Molecular e Biologia Vascular é suportado pelo KU Leuven Programmafinanciering (PF / 10/014), pela &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13), da Universidade de Leuven e uma bolsa de investigação da Boehringer Ingelheim-.

As experiências com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da KU Leuven. 1. Bactérias Preparando in vitro perfusões e in vivo <ol><li> Nós usamos S. aureus estirpe Newman para todas as experiências descritas neste manuscrito. S. aureus Newman foi armazenado em Brain Heart Infusion (BHI) com 10% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Usar uma ansa estéril para raspar as bactérias congeladas fora e inocular em 5 ml de Tryptic Soy Broth (TSB) O / N a 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Lavam-se as bactérias por centrifugação (2600 g, RT, 5 minutos) e ressuspender o sedimento de bactérias em 5 ml de PBS (tampão fosfato salino). </li><li> Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de 5 (6) éster de N-hidroxi-succinimidilo carboxi-fluoresceína (carboxi-fluoresceina) em etanol. Dilui-se a / solução 1 mg ml carboxi-f luoresceina a 150 mg / ml em água grau de laboratório (por exemplo, água MilliQ). Proteja os tubos de luzcom folha de alumínio e armazenar a -20 ° C. </li><li> Centrifugar as bactérias (2600 xg, temperatura ambiente, 5 min). Ressuspender o sedimento bacteriano em 800 ul de PBS e adicionar 200 uL (concentração final de 30 ug / ml para experiências de perfusão) ou 400 ul (concentração final 50 ug / ml para experiências in vivo) da mL / solução de carboxi-fluoresceína 150 ug. Proteger os tubos de luz com folha de alumínio e incuba-se durante 30 min à temperatura ambiente num agitador. </li><li> Após a marcação, o bloco com uma solução de 6% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS. </li><li> Dilui-se as bactérias por densitometria óptica (OD), um OD 600 de 0,65 para experiências in vitro (que corresponde a aproximadamente 3 x 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml para S. aureus) e uma DO 600 de 1,8 para experiências in vivo ( correspondendo a cerca de 1 x 10 9 UFC / ml para S. aureus) em PBS. Proteja os tubos de luz com papel alumínio e deixe no gelo. </li></ol> 2. Experiments In Vitro Perfusão <ol><li> O revestimento de lamelas de vidro <ol><li> Dilui-se o factor von Willebrand (VWF) (Haemate P, a concentração de estoque de 2.400 ug / ml) em grau de laboratório água (desionizada destilada) a uma concentração final de 50 ug / ml. </li><li> Dilui-se o colagénio em solução isotónica de glucose (solução a SKF, pH 2,7-2,9, tal como é fornecido pelo fabricante) para uma concentração final de 160 ug / ml. </li><li> Revestimento lamelas de vidro (24 x 50 mm) com VWF ou colagénio, largando 200 ul do revestimento em parafilme e colocar a lamela por cima da gotícula. A gotícula irá espalhar ao longo da superfície da lamela. </li><li> Incubar a lamela em um recipiente de humidif içado, durante 4 horas à temperatura ambiente. Levante cuidadosamente as lamelas do parafilm com uma agulha sem corte. Colocar a tampa na parte inferior da câmara de escoamento. </li></ol></li><li> Revestimento de plástico desliza com células endoteliais <ol><li> Deslizamentos Brasão de plástico(1-bem câmara de cultura de células APC, Sarstedt, Alemanha) com 1 ml de uma solução de gelatina a 1% em PBS e incubar durante 30 min a 37 ° C. Semear as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) sobre as folhas de plástico revestidos com gelatina e crescê-las a 70-80% de confluência. Montar o deslizamento de plástico na parte inferior da câmara de escoamento. </li></ol></li><li> Perfusão Experiment NOTA: Uma vista geral esquemática do sistema de perfusão em vitro é representado na Figura 1. <ol><li> Realiza-se em estudos in vitro a aderência de bactérias numa câmara de fluxo de placa de micro-paralela a uma tensão de cisalhamento laminar entre 2,5 dine / cm2 e 20 dine / cm 2 para simular diferentes condições de fluxo fisiológicas. </li><li> O (in-house design) câmara de fluxo consiste numa estrutura de metal e uma câmara de perfusão feito de plexiglas (poli (metil) metacrilato (PMMA)). Ao ligá-lo a uma bomba de infusão de alta precisão (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, EUA), podemos gerar ra fluxotes entre 0,0001 mL / min e 220,82 mL / min. </li><li> Ligue o tubo para a parte superior da câmara de fluxo e injectar meio no tubo. Suavemente colocar a parte superior da câmara de fluxo na parte superior da parte de fundo e montar a câmara de escoamento. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar. Injectar 1 mL de meio através da câmara para se certificar de que a câmara não tem fugas e para remover o excesso de solução de revestimento. Evitar bolhas de ar. </li><li> Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento controlado por termo a 37 ° C num tabuleiro de microscópio. Como este é um processo terminal, não há necessidade de procedimentos asceptic rigorosos. Realizar uma incisão perto da veia jugular, remover suavemente o lado direito do músculo do colo do útero e isolar a veia jugular a partir do tecido circundante. </li><li> Configure a bomba de infusão e microscópio de fluorescência. Configurações de bomba de infusão depende do diâmetro de uma seringa e a vazão desejada (ver secção 2.4). A partir de agora, trabalhar em um quarto escuro. </li><li> Revestimento de VWF: <ol><li> Encha uma seringa com bactérias fluorescente etiquetado e conectá-lo ao tubo de entrada. Evitar bolhas de ar. Iniciar a bomba de infusão durante 10 min. O tempo de infusão depende da velocidade de corte e do revestimento, as bactérias e meio utilizado e deve representar o estado estacionário de adesão. </li><li> Após 10 minutos, lavar as bactérias não ligadas por ligação de uma seringa com PBS para o tubo de entrada e a partir da bomba de infusão. </li><li> Tome pelo menos 15 imagens ou filmes em diferentes locais após o processo de lavagem. As bactérias são pequenos e potencialmente difícil de focar. Antes do experimento de fluxo in vitro, o plano focal apropriada pode ser obtida por colocação de uma gota de bactérias marcadas com fluorescência numa lamela e colocando a lamela na câmara de escoamento. Em seguida, procure o plano focal apropriado e salvar as configurações. Nota: Durante a experiência de fluxo in vitro, as imagens foram capturadas durante o passo de lavagem (± 5 minutos após o início) garante que apenas osinal para as bactérias aderentes é capturado. </li></ol></li><li> O colagénio de revestimento: <ol><li> Adicionar 60 ug / ml de VWF para as bactérias marcadas com fluorescência imediatamente antes do início da perfusão. Encha uma seringa com bactérias fluorescente etiquetado ou bactérias fluorescente etiquetado suplementadas com 60 ug / ml VWF e conectá-lo ao tubo de entrada. Evitar bolhas de ar. Repita os passos 2.3.5.2 para 2.3.5.3 </li></ol></li><li> As células endoteliais: <ol><li> Activa as células endoteliais por perfusão com uma solução 0,1 mM de Ca2 + A23187 -ionophore (solução de reserva 10 mM dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO)) em DMEM com a mesma taxa de cisalhamento como a perfusão bacteriana durante 10 minutos por perfusão com um 0,1 mm. Repita os passos 2.3.5.2 a 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calcule a taxa de deformação e tensão de cisalhamento como se segue. Taxa de corte = 6Q / wh 2 Onde: Q: taxa em ml / min, fluxo w: largura em cm, h: altura em cm A tensão de cisalhamento (τ) = rato cisalhamentoex viscosidade (μ) Onde μ: média: 0,01 dines x sec / cm 2, o sangue total: 0,04 dinas x sec / cm 2 </li><li> Análise de imagem <ol><li> Obter imagens ao vivo usando um microscópio de fluorescência invertido com uma câmera preto e branco e desenvolver usando software de imagem. Use o tempo de exposição de 1,5 s. Tome vários instantâneos (pelo menos 15) distribuídas aleatoriamente sobre a superfície revestida da câmara de fluxo e salvá-los no formato de arquivo apropriado. </li><li> Realizar análise de imagem com ImageJ. Subtrair o plano para remover fundos contínuos suaves de imagem (Processo - Fundo substrato) e definir o limite para definir valores de limite inferior e superior, a segmentação de imagens em escala de cinza em características de interesse. Medir a área limitada ao limiar. </li><li> Comparar a adesão bacteriana, expressa como a área de fluorescência, por exemplo, utilizando software de análise estatística. Comparar os grupos utilizando ANOVA one-way ou two-atado teste t de Student. Assinalar todos os valores como média ± erro padrão da média (SEM). Considere-se um valor de p &lt;0,05 significativo (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. In Vivo Modelo de perfusão mesentérica <ol><li> Preparação / cirurgia do mouse <ol><li> Jejuar o mouse na noite antes do experimento, a fim de limitar o movimento do intestino. </li><li> Dê um com 6-8 semanas de idade ratinho (C57BL / 6) analgesia pré-operatória de uma injecção subcutânea de buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal (PC)) 20-30 minutos antes da cirurgia. </li><li> Anestesiar o rato por injecção intra-peritoneal de cetamina (125 mg / kg de peso corporal) e xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). Verifique por pedal reflexo. Aplicar veterinário pomada para evitar o ressecamento. </li><li> Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento controlado por termo a 37 ° C num tabuleiro de microscópio. Uma vez que este é um procedimento de terminais, não há necessidade de estrita asceptic procedimentos. Realizar uma incisão perto da veia jugular, remover suavemente o lado direito do músculo do colo do útero e isolar a veia jugular a partir do tecido circundante. </li><li> Inserir um cateter 2 French intravenosa na veia jugular direita para a infusão de bactérias marcadas com fluorescência ou outras soluções. Abra a cavidade peritoneal através de uma incisão na linha média abdominal e usar cotonetes para espalhar o mesentério e visualizar a arteriolar mesentérica e circulação venular. </li><li> Posicione o mouse no lado direito em uma placa transparente e segurar a cânula com fita adesiva. Use um pacote quente para evitar a hipotermia. Para prevenir a desidratação do tecido, gota 500 ul de NaCl a 0,9% sobre os intestinos. </li></ol></li><li> A microscopia de fluorescência de adesão bacteriana à circulação mesentérica <ol><li> Trabalhar em um quarto escuro. Use cotonetes para imobilizar os navios e visualizá-los sob um microscópio invertido. </li><li> Topicamente aplicar 5 ul de uma solução 10 mM de Of o Ca2 + A23187 -ionophore dissolvido em DMSO. Após 10 s, injectar 100 ul bactérias marcadas (veja o passo 1) através do cateter jugular. Tome imagens de lapso de tempo. Após o experimento for concluída, a eutanásia o mouse de acordo com as directrizes aprovadas institucionais. </li></ol></li><li> Análise de Imagem <ol><li> Obter imagens ao vivo usando um microscópio de fluorescência invertido, capturado usando uma câmera preto e branco e desenvolvido usando qualquer software de imagem. Aplicar o tempo de exposição automática e optimização de contraste específico para o equipamento utilizado. </li><li> Adquirir imagens de lapso de tempo usando a ferramenta &#39;Aquisição&#39; na barra de ferramentas (Aquisições multidimensionais - Time) utilizando 40 ciclos de 1.000 imagens / seg. Salve as imagens em um formato de arquivo de imagem apropriado. </li><li> Processar imagens usando software de análise ImageJ para medir a área de sinal fluorescente por imagem. Definir o limite para definir valores de limite inferior e superior, segmentando imagens de escala de cinza para features de interesse. Identificar a região de interesse (vaso sanguíneo) e medir a área limitada para o limiar e a região de interesse. Compare a adesão bacteriana, expressa em área fluorescente usando qualquer software de estatística ou gráficos. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. 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A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A tensão de cisalhamento é um fator crucial para a adesão bacteriana início à parede do vaso e para a geração subseqüente de endovascular ou vegetações endocárdicas e infecções metastáticas 4,5. Descrevemos complementar in vitro e em modelos in vivo para estudar a patogénese de infecções endovasculares sob tensão de corte fisiológicas. Estes modelos nos permitiram identificar proteína de ligação do fator de von Willebrand (vWbp) como o principal S. proteína aureus para interagir sob fluxo com uma parede vascular lesada expondo VWF 4. Infecções endovasculares, e endocardite infecciosa em particular, são motivo de preocupação não só devido à falência de órgãos induzida pela sepse e morte, mas também por causa de metastáticos (&#39;&#39;) complicações locais e distantes. Para causar endocardite infecciosa e infecções metastáticas, as bactérias têm a aderir à parede do vaso e, portanto, resistir à tensão de corte do fluxo de sangue. Maisestudos sobre factores de virulência bactérias foram realizados em condições estáticas. No entanto, essas interações estabelecidas podem não resistir a forças de cisalhamento e estudos em condições de escoamento pode revelar novos fatores, previamente desconhecidos em interação bactéria-hospedeiro. Utilizando a câmara de fluxo micro-Paralelamente, e outros mostraram a importância de VWF para adesão vascular. Sob tensão de cisalhamento, VWF desenvolve-se progressivamente a partir de sua estrutura globular de descanso, e expõe o domínio A1 que interage com as plaquetas através de seu receptor GPIb 6. Câmaras de fluxo têm sido amplamente utilizados para estudar a função plaquetária 7. Notavelmente, também S. aureus adesão sob fluxo requer VWF, e em particular o domínio A1 que está exposto em cima de cisalhamento. Identificamos vWbp para mediar a ligação VWF. vWbp é uma coagulase que contribui para S. aureus fisiopatologia pela ativação da protrombina do hospedeiro. Staphylothrombin, os resulting complexo de um coagulase bacteriana e protrombina, converte fibrinogênio em fibrina insolúvel 8,9. Os nossos estudos demonstraram que vWbp não se limita a activar a protrombina, mas provoca a formação de agregados-bactérias para a fibrina das plaquetas, o que melhora a adesão aos vasos sanguíneos sob fluxo 4,10,11. O modelo de câmara de fluxo in vitro permite estudar os diferentes intervenientes na adesão bacteriana aos componentes celulares ou matriz. Factores de virulência da bactéria pode ser estudada usando mutantes ou bactérias inofensivas que expressam proteínas de superfície específicas. Em alternativa, os inibidores farmacológicos ou anticorpos de bloqueio podem ser adicionados ao meio na câmara de escoamento. O papel dos factores do hospedeiro, tais como diferentes constituintes da matriz extracelular podem ser estudados utilizando lamelas com diferentes revestimentos. As lamelas pode também ser coberta com células endoteliais, dos quais o estado de activação podem ser modulados pela adição de estimuladores específicos. Apata a partir da parede vascular, a contribuição das células do sangue do hospedeiro e proteínas do plasma pode ser estudado através da adição destes factores para o meio que se escoa. Assim, diferentes condições de complexidade crescente podem ser estudadas em condições padronizadas de fluxo laminar para desvendar as interacções que permitem que as bactérias de aderirem à parede vascular in vivo. Interacções identificados no modelo in vitro são posteriormente estudado num modelo animal para testar a sua relevância num organismo complexo. Outros modelos in vivo para estudar interacções dinâmicas sob fluxo foram descritas, tais como a dobra cutânea câmara de hamster dorsal 12 e o modelo cremaster 13. Em comparação, o modelo de perfusão mesentérica descrito aqui oferece várias vantagens devido à sua facilidade de utilização, a possibilidade de variar acolher fundo genético dos ratos e para avaliar as intervenções farmacológicas. Em conclusão, os modelos descritosoferecer a possibilidade de estudar proteínas de superfície não só de S. aureus, mas de muitos outros microorganismos em diferentes contextos de acolhimento, para entender melhor a patogênese das infecções vasculares.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

A fim de causar infecções endovasculares e endocardite infecciosa, bactérias necessitam de ser capaz de aderir à parede do vaso ao mesmo tempo que exposta à tensão de corte do fluxo de sangue. Para identificar os fatores bacterianos e do hospedeiro que contribuem para a adesão vascular de microorganismos, modelos apropriados que estudam essas interações em condições de cisalhamento fisiológicas são necessários. Aqui, nós descrevemos um modelo in vitro de fluxo na câmara que permite investigar a adesão bacteriana às diferentes componentes da matriz extracelular ou a células endoteliais, e um modelo de microscopia intravital que foi desenvolvido para visualizar diretamente a aderência inicial das bactérias para a circulação in vivo splanchnic . Estes métodos podem ser utilizados para identificar os factores bacterianas hospedeiras e necessárias para a adesão de bactérias sob fluxo. Nós ilustrar a relevância da tensão de cisalhamento e o papel do fator von Willebrand para a adesão de Staphylococcus aureus utilizando tanto in vitro e in vivo no modelo.

S. aureus adesão ao VWF, matriz subendotelial e células endoteliais é um fenômeno dependente tensão de cisalhamento Para enfatizar o papel da tensão de cisalhamento na interação entre S. aureus e VWF, foi realizada ao longo de VWF perfusões lamelas revestidas com diferentes taxas de corte (uma vista geral esquemática do modelo de perfusão in vitro é apresentado na Figura 1. A adesão de S. aureus para o vWF aumentou com o aumento das taxas de cisalhamento de 250 s-1 para 2000 s-1 (Figura 2), indicando que as forças de cisalhamento elevadas, mas não inibem a reforçar a adesão de bactérias a VWF. A fim de investigar a contribuição de VWF a aderência bacteriana ao colagénio, o principal componente da matriz subendotelial, que perfundido marcado fluorescentemente S. aureus ao longo do colagénio na presença ou ausência de VWF. Na ausência do vWF, adesão de S. umaUreus ao colágeno diminuiu com o aumento das taxas de cisalhamento. No entanto, quando VWF estava presente no meio, a adesão de S. aureus aumentou com o aumento da velocidade de cisalhamento (Figura 3). O modelo de fluxo in vitro também nos permite verificar a adesão das bactérias às células endoteliais sob fluxo. Nós perfundidos com HUVECs marcado fluorescentemente S. aureus a taxas de corte de 500 a 2000 s-1. Onde indicado, células HUVEC foram activadas com um Ca 2+ -ionophore, para provocar a libertação de VWF. Ativação de células endoteliais ea liberação subseqüente VWF, aumento da adesão de S. aureus (Figura 4A), que se formou padrões típicos de &quot;cadeia&quot; como-marcado por fluorescência de agregados bacterianos alinhadas na direcção da força de corte (Figura 4B), sugerindo a ligação das bactérias ao longo de uma molécula de VWF esticado linear. Inicial in vivoa aderência de bactérias nas veias splanchnic é mediada por VWF Desde S. aureus é capaz de aderir a VWF, utilizou-se ratinhos de tipo selvagem (vWF + / +) e ratinhos deficientes em VWF (vWF - / -) para investigar a aderência de bactérias à parede do vaso activadas in vivo. Videomicroscopia em tempo real de veias esplâncnicas permitiu a visualização in vivo de circular marcado fluorescentemente S. aureus (vista geral esquemática do sistema de perfusão in vivo é representado na Figura 5). Depois da activação farmacológica do endotélio por Ca 2+ -ionophore, observou-se uma rápida acumulação local de bactérias individuais e agregados das bactérias à parede do vaso de ratinhos WT (suplementar vídeos 1 e 2). Quase nenhuma aderência de bactérias foi observada na parede do vaso de vWF activado -deficient ratinhos (suplementar Vídeo 3) em comparação com a adesão em ratinhos WT (Figura 6). A ausência de VWF diminui a capacidade de S. aureus para aderir à parede do vaso activado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figura 1. Uma representação esquemática do modelo de fluxo in vitro. O modelo de fluxo em um modelo in vitro é multifuncional, que permite o estudo de diferentes mecanismos dependentes de cisalhamento, tal como a adesão bacteriana à matriz subendotelial, mas também a formação de trombos. A câmara de fluxo micro-paralelo é colocada sobre uma lamela (plástico ou vidro) com diferentes revestimentos de proteínas e células endoteliais. A adesão de bactérias diferentes (laranja e pontos cinzentos) podem ser analisados, e o impacto da presença de proteínas do plasma, plaquetas e sangue total pode ser avaliada. Marcadores fluorescentes para plaquetas (azul) ou ovais fibrinogbr (cordas azul) pode ser utilizado em combinação com inibidores de diferentes formas ovais (pretas) para distinguir factores bacterianos e hospedeiros. Imagens representativas de adesão bacteriana de S. aureus para revestimento de colágeno na presença (parte inferior) ou ausência (superior) do VWF são mostradas (barra de escala é de 100 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figura 2. Adesão de S. aureus para VWF aumenta com o aumento da velocidade de cisalhamento. perfusão micro-câmara de fluxo paralelo através revestido de VWF (50 ug / ml) com marcado fluorescentemente S. aureus Newman a taxas de corte de 250 a 2000 s -1 (seg-1) em meio (n&gt; 5). Todos os resultados são expressos como média ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figura 3. Adesão de S. aureus ao subendotélio é cisalhamento e VWF dependente. perfusão câmara de fluxo Micro-paralelo sobre colágeno revestido (160 ug / ml) com fluorescente etiquetado S. aureus Newman a taxas de corte de 250 a 2000 s -1 em média (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) estava presente no meio onde indicado. Todos os resultados são expressos como média ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figura 4. A adesão de S. aureus às células endoteliais activadas é perfusão câmara de fluxo de cisalhamento dependente. Micro-paralela sobre as células endoteliais. (A) As células endoteliais da veia umbilical humana foram activadas com o Ca2 + Uma -ionophore23187 (0,1 mM) seguido de uma perfusão de 10 minutos marcado por fluorescência S. aureus Newman a taxas de corte de 500 a 2000 s -1 em média (n&gt; 5). Todos os resultados são expressos como média ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Imagem de micro-câmara de fluxo paralelo perfusão sobre HUVECs activadas com S. aureus a uma taxa de cisalhamento de 1,000 sec -2. S. aureus forma cordas de comprimento ± 200 microns, o que sugere adesão a multímeros VWF (barra de escala é de 100 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figura 5. Uma visão esquemática do modelo de perfusão mesentérica in vivo. Um cateter na veia jugular direita (linha amarela) é inserido para a administração de fluorbactérias escently marcados (pontos laranja), anestésicos ou outros componentes adicionais tais como inibidores farmacêuticas e anticorpos. A cavidade peritoneal é aberto e o mesentério é espalhado para visualizar os vasos sanguíneos (venosas e arteriais) sob um microscópio de fluorescência. Depois da activação farmacológica do endotélio por uma -ionophore Ca2 +, o que induz a libertação de VWF, as bactérias podem ser injectados através do cateter da veia jugular. Microscopia vídeo intravascular em tempo real permite a visualização in vivo de circulação de bactérias fluorescente etiquetado e conseqüente formação de bactérias em plaquetas trombos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figura 6. A adesão inicial de S. aureusao endotélio activado in vivo é mediada por VWF In vivo modelo de perfusão venosa mesentérica com C57Bl / 6- VWF + / + e C57Bl / 6- VWF -. / - ratos. A adesão das marcado fluorescentemente S. aureus para a parede do vaso activados localmente é significativamente mais baixa em vWF - / - ratos. Todos os resultados são expressos como média ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Vídeo Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Vídeo 1: aderência em tempo real de S. aureus à parede do vaso ativado em VWF + / + camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> Vídeo 2: em tempo real a formação de agregados e embolização de S. aureus em VWF + / + camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> <img alt="Figura 3 Vídeo" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Vídeo 3: adesão em tempo real de S. aureus à parede do vaso ativado em VWF - In vivo modelo de camundongos perfusão mesentérica com VWF + / + e VWF - - /. / - ratos. Cinco ul de uma Ca 2+ -ionophore (10 mM) foi aplied à região do leito vascular visualizada. Uma suspensão de carboxi-fluoresceína-rotulados S. aureus foi injectada através do cateter da jugular. A circulação mesentérica foi visualizada sob um microscópio invertido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.6K visualizações.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Vídeo: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

Resumo

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