この作品は、フォンVOOR Wetenschappelijk Onderzoe​​k（FWO）ブラーンデレンG0466.10、11I0113Nによってサポートされていました。小児循環器、UZルーヴェン、ベルギーのための「エディ·メルクス研究助成」と「Sporta研究グラント」（JC）。分子および血管生物学のためのセンターは、ルーベン大学の「Geconcentreerde Onderzoe​​ksacties」（GOA 13分の2009）とベーリンガーインゲルハイムからの研究助成金によって、Programmafinanciering KUルーベン（PF / 10/014）でサポートされています。

動物実験は、ルーヴェンカトリック大学の倫理委員会によって承認されました。 インビトロ灌流およびin vivo実験 1.準備細菌<ol><li>我々はSを使用しましたこの原稿に記載されているすべての実験のための黄色ブドウ球菌株ニューマン。S.黄色ブドウ球菌 Newmanのを-80℃で10％グリセロールにブレインハートインフュージョン（BHI）中に保存しました。 </li><li> （3 OD 600&gt;）、37℃でO / N凍結細菌を掻き落としおよび5に接種するために滅菌ループを使用mlのトリプシン大豆ブロス（TSB）。 </li><li>遠心分離によって細菌を洗浄し（2600グラム、室温、5分）、5mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中に細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li>エタノール中の5（6） - カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシエステル（カルボキシ - フルオレセイン）の1 mg / mlの溶液を調製します。実験室グレードの水で150μgの/ mlに1 mg / mlのカルボキシフルオレセイン溶液（ 例えば、ミリQ水）で希釈します。光からチューブを守ります-20℃でアルミ箔とストアと。 </li><li> （2,600×gで、室温、5分）細菌を遠心します。 800μlのPBS中に細菌ペレットを再懸濁し、200μlまたは150 / mlのカルボキシ-フルオレセイン溶液を400μl（最終濃度in vivo実験のために50μg/ mlの）（灌流実験のための30μg/ mlの最終濃度）を追加します。アルミホイルで光からチューブを保護し、シェーカー上で室温で30分間インキュベートします。 </li><li>標識後、PBS中に6％のウシ血清アルブミン（BSA）溶液でブロック。 </li><li>光学密度測定を用いて細菌（OD）、OD in vitro実験のための0.65の600を希釈し（とOD インビボ実験のための1.8の600（約3×10 8コロニー形成単位（CFU） 黄色ブドウ球菌用/ mlに相当します） PBS中の黄色ブドウ球菌では約1×10 9 CFU / mlの）に対応します。アルミホイルで光からチューブを保護し、氷の上に残します。 </li></ol> 2. インビトロ灌流実験<ol><li>ガラスカバースリップのコーティング<ol><li>実験室グレードの水でフォン·ヴィレブランド因子（VWF）（Haemate P、ストック濃度2,400μgの/ ml）に希釈し、50μg/ mlの最終濃度まで（蒸留脱イオン）。 </li><li> 160 / mlの最終濃度まで（製造業者によって供給されるSKF液、pHを2.7から2.9）、等張グルコース溶液中のコラーゲンを希釈。 </li><li>パラフィルム上のコーティングの200μLを滴下し、液滴の上にカバースリップを置くことにより、VWFまたはコラーゲンでコートしたカバーガラス（24×50ミリメートル）。液滴は、カバーガラスの表面に沿って拡散します。 </li><li>室温で4時間、加湿容器にカバースリップをインキュベートします。慎重に鈍い針でパラフィルムからカバーグラスを持ち上げます。フローチャンバーの底部にカバースリップをマウントします。 </li></ol></li><li>プラスチックのコーティングは、内皮細胞でスリップ<ol><li>コー​​トプラスチックスリップPBS中の1％ゼラチン溶液1ml（1ウェルPCA細胞培養チャンバー、ザルスタット、ドイツ）を、37℃で30分間インキュベートします。ゼラチンコーティングされたプラスチック製のスリップ上シードヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）および70〜80％の密集度にそれらを成長させます。フローチャンバーの底部にあるプラスチック製のスリップをマウントします。 </li></ol></li><li>かん流実験 注： インビトロ灌流モデルの概略図を図1に示されています。 <ol><li>異なる生理学的流れの条件をシミュレートするために2.5ダイン/ cm 2で20ダイン/ cm 2の間に層状剪断応力でマイクロ平行プレートフローチャンバーインビトロ細菌付着試験を行います。 </li><li>フローチャンバー（社内の設計）は、金属フレーム及びプレキシガラスで作られた灌流チャンバー（ポリ（メチル）メタクリレート（PMMA））からなります。高精度の注入ポンプ（PHD 2000輸液、ハーバード装置、USA）に接続することによって、我々は、RAの流れを生成することができ0.0001マイクロリットル/分、220.82ミリリットル/分のTES。 </li><li>フローチャンバーの上部にチューブを接続し、チューブに培地を注入します。静かに底部の上にフローチャンバの上部に配置し、フローチャンバーを組み立てます。気泡がないように注意してください。室内に漏れていないことを確認すると、過剰な塗布液を除去するために、チャンバを通って培地1mlを注入します。気泡を避けます。 </li><li>顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるため、厳密な無菌の手順は必要ありません。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 </li><li>輸液ポンプや蛍光顕微鏡を設定します。輸液ポンプの設定は、シリンジの直径と所望の流量（2.4節を参照）に依存しています。これからは、暗い部屋で働いています。 </li><li> VWFコーティング： <ol><li>蛍光標識された細菌と注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。 10分間の注入ポンプを起動します。注入時間は、使用されるせん断速度およびコーティング、細菌やメディアに依存し、密着性の安定した状態を表している必要があります。 </li><li> 10分後、導入管にPBSで注射器を接続し、輸液ポンプを起動して、非結合細菌を洗い流します。 </li><li>洗浄工程の後に異なる場所で少なくとも15画像​​や動画を取ります。細菌は小さく、集中することが潜在的に困難です。 インビトロ流動実験の前に、適切な焦点面をカバースリップ上で蛍光標識された細菌の滴を配置し、フローチャンバー内にカバースリップを配置することによって取得することができます。次に、適切な焦点面を検索し、設定を保存します。 注：in vitroでの流動実験中に、洗浄工程（開始後±5分）の間に画像を捕捉することだけを保証します付着細菌のための信号が捕捉されます。 </li></ol></li><li>コラーゲンコーティング： <ol><li>ただ灌流を開始する前に、蛍光標識された細菌に60 / mlののVWFを追加します。 60 / mlのVWFを補充した蛍光標識細菌または蛍光標識された細菌を注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。繰り返しの手順は2.3.5.3に2.3.5.2 </li></ol></li><li>内皮細胞： <ol><li>のCa 2+ -ionophore A23187の0.1 mM溶液で灌流による内皮細胞を活性化して灌流によって10分間細菌灌流と同じせん断速度でDMEM中（ストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10mMの） 0.1 mMの。繰り返して、2.3.5.3に2.3.5.2を繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li>次のようにせん断速度とせん断応力を計算します。 せん断速度= 6Q / WH 2 ：Q：流量W ml /分での速度、：センチ幅、H：cm単位の高さ せん断応力（τ）=せん断ラット元粘度（μ） どこμ：ミディアム：0.01ダインのx秒/ cm 2であり、全血：0.04ダインのx秒/ cm 2の </li><li>画像解析<ol><li>白黒カメラと倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、画像化ソフトウェアを使用して開発します。 1.5秒の露光時間を使用してください。ランダムフローチャンバーのコーティングされた表面上に広げ、適切なファイル形式で保存（少なくとも15）複数のスナップショットを取ります。 </li><li> ImageJので画像解析を実行します。と関心のある特徴にグレースケール画像をセグメント化、下側および上側のしきい値を設定するしきい値を定義 - 画像（Substractバックグラウンド·プロセス）からのスムーズな連続バックグラウンドを除去するためのバックグラウンドを減算します。閾値に制限された領域を測定します。 </li><li>細菌の付着を比較し、統計分析ソフトウェアを用いて、例えば 、蛍光領域として表さ。一方向ANOVAまたはTを使用してグループを比較しますWO-両側スチューデントt検定を。平均値の平均値±標準誤差（SEM）としてすべての値を報告します。重要な&lt;0.05のp値を考えてみましょう（* P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001）。 </li></ol></li></ol> インビボ腸間膜灌流モデル3. <ol><li>マウスの作製/手術<ol><li>便通を制限するために、実験前の夜、マウスを絶食。 </li><li>ブプレノルフィンの皮下注射手術前に（0.1 mg / kg体重（BW））20〜30分まで6〜8週齢のマウス（C57BL / 6）手術前鎮痛を与えます。 </li><li>ケタミンの腹腔内注射（125 / kg体重）およびキシラジン（12.5 / kg体重）で、マウスを麻酔。ペダル反射により確認してください。乾燥を防ぐために、獣医軟膏を適用します。 </li><li>顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるので、厳密asceptiを必要としませんCプロシージャ。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 </li><li>蛍光標識された細菌または他の溶液の注入のための右頸静脈に2フランス語静脈カテーテルを挿入します。腹部正中切開により腹腔を開き、腸間膜を広げるために綿棒を使用し、腸間膜動脈と細静脈循環を可視化します。 </li><li>透明板の右側にマウスを置き、テープでカニューレを固定します。低体温症を防ぐためにホットパックを使用してください。組織の脱水を防ぐために、腸に500μlの0.9％のNaClをドロップします。 </li></ol></li><li>腸間膜循環への細菌付着の蛍光顕微鏡<ol><li>暗い部屋で働いています。船を固定し、倒立顕微鏡下でそれらを視覚化するために綿棒を使用してください。 </li><li>局所的に10 mM溶液oの5μLを適用FのCa 2+ -ionophore A23187は、DMSOに溶解しました。 10秒後、頸静脈カテーテルを介して（ステップ1を参照）100μlの標識された細菌を注入します。タイムラプス画像を撮影します。実験が終了した後、機関承認ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。 </li></ol></li><li>画像解析<ol><li>倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、白黒カメラを用いて捕捉され、任意の画像処理ソフトウェアを使用して開発しました。自動露光時間と使用する機器に固有のコントラストの最適化を適用します。 </li><li>千枚/秒の40サイクルを使用して - ツールバー（時間多次元買収）の「取得」ツールを使用してタイムラプス画像を取得します。適切な画像ファイル形式で画像を保存します。 </li><li>画像あたりの蛍光シグナルの面積を測定するためにImageJの解析ソフトウェアを用いて処理画像。 Fにグレースケール画像をセグメント、下側及び上側のしきい値を設定するしきい値を定義します興味の特長。金利（血管）の領域を特定し、しきい値と関心領域に制限された領域を測定します。細菌の付着を比較し、いずれかの統計やグラフ作成ソフトウェアを使用して蛍光領域として表現。 </li></ol></li></ol>

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A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

せん断応力は、血管壁への早期細菌付着および血管内または心臓内植生および転移性の感染症4,5の次の世代のための重要な要因です。我々は、生理的せん断応力下の血管内感染の病因を研究するためのin vitroおよびin vivoモデルで相補します。これらのモデルは、私たちは、主要なSとフォンビルブランド因子結合タンパク質（vWbp）を識別することができました球菌タンパク質はVWF 4を露出させ 、損傷した血管壁と流れの下で対話します。 血管内感染症、特に感染性心内膜炎は、だけでなく、ため、ローカルおよび遠隔（ &#39;転移&#39;）合併症の、ためだけでなく、敗血症誘発性の臓器不全と死の懸念されます。感染性心内膜炎および転移性の感染症を引き起こす細菌は、血管壁に付着し、したがって、血流の剪断応力に抵抗しなければなりません。最も細菌の研究が要因が静的な条件で行われてきた病原性。しかし、これらの確立された相互作用は、細菌宿主の相互作用に新たな、以前に認識されていない要因を明らかにすることができる流動条件下で剪断力と研究に耐えられない可能性があります。 マイクロパラレルフローチャンバーを用いて、他のものは血管接着用VWFの重要​​性を示しています。せん断応力下では、VWFは、次第にその静止球状構造から展開、およびそののGPIb受容体6を介して血小板と相互作用するA1ドメインを公開します。フローチャンバーは、広く血小板機能7を研究するために使用されています。 驚くべきことに、またS.流下球菌の付着は、剪断時に露出されるA1ドメインをVWFを必要とし、特に。我々は結合VWFを媒介するvWbpを同定しました。 vWbpは、Sに貢献コアグラーゼですホストのプロトロンビンを活性化することにより、 黄色ブドウ球菌の病態生理。 Staphylothrombin、RES細菌コアグラーゼとプロトロンビンとの複合体をulting、不溶性フィブリン8,9をフィブリンに変換します。我々の研究はvWbpがプロトロンビンを活性化するが、流れ4,10,11の下の血管への接着性を向上させる細菌フィブリン-血小板凝集物の形成をトリガするだけでなくことを示しました。 in vitroでのフローチャンバーモデルは、細胞またはマトリックスの構成要素に細菌付着で別の選手を研究することができます。細菌の毒性因子は、特定の表面タンパク質を発現する変異体または無害な細菌を用いて研究することができます。代替的に、薬理学的阻害剤または遮断抗体は、フローチャンバ内の培地に添加することができます。そのような細胞外マトリックスの種々の成分のような宿主因子の役割は、異なるコーティングでカバーガラスを使用して研究することができます。カバースリップは、また、活性化状態は、特定の刺激物質を添加することによって調節することができるそれらの内皮細胞で覆うことができます。アパ血管壁からのRTは、宿主の血液細胞および血漿タンパク質の寄与は流動媒体にこれらの要素を追加することによって調べることができます。したがって、複雑化の異なる条件は、細菌がin vivoで血管壁に付着することを可能にする相互作用を解明するために、層流の標準化された条件の下で研究することができます。 in vitroモデルで同定された相互作用は、その後、複雑な生物で、その妥当性をテストするために、動物モデルで研究されています。流れの下で動的な相互作用を研究するために、他のin vivoモデルは、ハムスターの背側皮下脂肪チャンバー12と精巣挙モデル13として、記載されています。対照的に、ここで説明する腸間膜灌流モデルは、可能性はマウスの遺伝的背景をホスト変えるためにおよび薬理学的介入を評価するために、その使いやすさのいくつかの利点を提供しています。 結論として、説明したモデルS.だけでなく表面タンパク質を研究する可能性を提供黄色ブドウ球菌が、別のホストの背景には多くの他の微生物の、より良い血管感染症の病因を理解します。

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table><tbody><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>fluorescent labeling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm collagen</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>collagen</td></tr><tr><td>1-well PCA cell culture chambers</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>plastic slips</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorphine</td></tr><tr><td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>ketamin</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xylazine</td></tr><tr><td>2 french intravenous catheter green</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+-ionophore solution A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml syringe&amp;nbsp; with needle</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300015</td><td>intra-peritoneal injection</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>Thickness No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusion</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>High-accuracy Harvard infusion pump</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Inverted fluorescence microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Graphpad Software</td><td>Analysis software</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&amp;nbsp;</td><td>Black and white camera</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

血管内感染症および感染性心内膜炎を引き起こすために、細菌は、血液の流れのせん断応力にさらされながら、血管壁に付着することができる必要があります。 微生物の血管接着に寄与する細菌と宿主因子を同定するために、生理学的剪断条件下で、これらの相互作用を研究する適切なモデルが必要とされています。ここでは、細胞外マトリックスの異なるコンポーネントに細菌の付着を調査するか、内皮細胞を可能にするインビトロフローチャンバーモデル、およびin vivoで直接内臓循環への細菌の初期接着を可視化するために開発された生体顕微鏡のモデルを記述します。これらの方法は、流れの下の細菌の付着のために必要な細菌と宿主因子を同定するために使用することができます。我々は、せん断応力の妥当性とStaphyの接着のためのフォンビルブランド因子の役割を示していますlococcus球菌の両方のin vitroおよびin vivoモデルで使用して。

VWFへの黄色ブドウ球菌の接着、内皮下マトリックスおよび内皮細胞は、せん断応力に依存する現象であります S.との間の相互作用におけるせん断応力の役割を強調するために、 黄色ブドウ球菌およびVWF、我々 は、in vitro灌流モデルを図1に示されているの概略図（異なるせん断速度でVWFの上にコーティングされたカバースリップを灌流を行った。 黄色ブドウ球菌の付着VWFに250秒からせん断速度を増加させる-1 2,000に伴って増加しました秒-1（ 図2）、高剪断力は、VWFへの細菌の付着を阻害するが、強化しないことを示します。 コラーゲンへの内皮下マトリックスの主成分を細菌付着に対するVWFの寄与を調べるために、我々は、蛍光標識されたS.を潅流VWFの存在下または非存在下でのコラーゲンの上に黄色ブドウ球菌 。 VWF、S.の付着がない場合Aコラーゲンへのureusはせん断速度の増加に伴って減少しました。しかし、VWFは、Sの密着性媒体中に存在したとき黄色ブドウ球菌は、剪断速度を（ 図3）の増加とともに増加しました。 in vitroでのフローモデルはまた、私たちは流れの下で内皮細胞への細菌の付着を調べることができます。我々は、蛍光標識されたSでのHUVECを灌流せん断速度で500〜2000秒球菌 -1。示される場合には、HUVECをVWFの放出を引き起こすためにはCa 2+ -ionophoreで活性化しました。内皮細胞の活性化およびその後のVWFのリリース、Sの増加接着リニア延伸VWF分子に沿って細菌の結合を示唆し、せん断力（ 図4B）の方向に整列した細菌のクラスタを蛍光標識の典型的な「紐状」パターンを形成球菌 （ 図4A）。 生体内での最初の内臓静脈内細菌の付着はVWFによって媒介されます S.ので、 生体内で活性化され、血管壁への細菌の付着を調査するために（ - - / VWF）球菌は VWFに付着することができ、我々は（VWF + / +）とVWF欠損マウス野生型マウスを使用していました。内臓血管のリアルタイムビデオ顕微鏡は、蛍光標識されたS.循環のインビボでの可視化を可能にしました球菌（in vivoでの灌流モデルの概略図を図5に示されています）。 のCa 2+ -ionophoreによる内皮の薬理学的活性化の後、我々は、WTマウスの血管壁への個々の細菌や細菌の凝集体の迅速な局所的蓄積を観察した（補足ビデオ1及び2）。ほとんどの細菌の付着は、VWF -deficieの活性化血管壁に見られませんでした。NTマウス（補足ビデオ3）WTマウスにおける接着と比較した（ 図6）。 VWFの非存在は、Sの能力を低下させます活性化した血管壁に付着する黄色ブドウ球菌 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> 図1. インビトロ流モデルの略図。 インビトロ流モデルは、内皮下マトリックスへの細菌の付着などの異なるせん断依存機構の研究を可能にするだけでなく、形成を血栓多機能モデルです。マイクロパラレルフローチャンバーは、タンパク質および内皮細胞の異なるコーティングを有するカバースリップ（プラスチックまたはガラス）上に配置されます。異なる細菌（オレンジ、グレードット）の付着を分析することができ、血漿タンパク質、血小板、全血の存在の影響を評価することができます。血小板のための蛍光マーカー（青楕円）またはfibrinogEN（青ストリング）は、細菌と宿主因子を区別するために別の阻害剤（黒色楕円）と組み合わせて使用​​することができます。 Sの細菌付着の代表的な画像VWFの存在（下）中のコラーゲンコーティングまたは非存在下（上）に黄色ブドウ球菌が （スケールバーは100μmである）が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Sの図2.接着増加せん断速度とVWFの増加に黄色ブドウ球菌。S.蛍光標識でコーティングされたVWF（50μg/ mlの）上のマイクロパラレルフローチャンバー灌流250〜2,000秒-1培地中で（秒-1）（N&gt; 5）のせん断速度で球菌ニューマン。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 * P &lt;0.05、** p &lt;0.01。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> S.図3接着内皮下層への黄色ブドウ球菌は 、せん断およびVWF依存している。と、蛍光標識したS.コーティングされたコラーゲン（160 / mlの）上のマイクロパラレルフローチャンバー灌流培地中の250秒〜2000 -1のせん断速度（nは&gt; 5）で球菌ニューマン。示されている場合VWF（60μgの/ ml）を培地中に存在しました。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 ** P &lt;0.01。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Sの図4.接着活性化内皮細胞へ球菌は、内皮細胞上の依存せん断。マイクロパラレルフローチャンバー灌流あります 。 （A）ヒト臍帯静脈内皮細胞のCa 2+を-ionophore Aで活性化しましたS.蛍光標識の10分間の灌流に続いて23187（0.1ミリモル）培地中の500秒〜2000 -1のせん断速度（nは&gt; 5）で球菌ニューマン。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 * p &lt;0.05。 S.と活性化されたHUVECを超えるマイクロパラレルフローチャンバー灌流の（B）イメージ千秒-2。S.のせん断速度で、 黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌は、VWF多量体との密着性を（スケールバーは100μmである）を示唆し、±200ミクロンの長さの文字列を形成している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> 図5 の生体内腸間膜灌流モデルの概略図。右頸静脈カテーテルは、（黄色の線）フッ素を投与するために挿入され、escently標識された細菌（オレンジドット）、追加の麻酔薬またはそのような医薬阻害剤および抗体などの他のコンポーネント。腹腔を開き、腸間膜は、蛍光顕微鏡下での血管（静脈および動脈）を可視化するために広がっています。 VWFの放出を誘導したCa 2+ -ionophoreによる内皮細胞の薬理学的活性化の後、細菌は、頸静脈カテーテルを介して注入することができます。リアルタイム血管内ビデオ顕微鏡は、蛍光標識された細菌や細菌血小板血栓の形成得られた循環の in vivo可視化を可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> 図6. Sの初期接着球菌in vivoでの活性化内皮にはVWFが介在する C57BL / 6 VWF + / +およびC57BL / 6 VWFとのインビボ静脈腸間膜灌流モデル- / -マウス。蛍光標識されたSの接着局所的に活性化された血管壁に球菌VWFに有意に低い- / -マウス。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 *** P &lt;0.001、n&gt;は7。 <img alt="ビデオ図1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> ビデオ1：Sのリアルタイム接着VWF + / +マウスにおいて、活性化された血管壁に黄色ブドウ球菌 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> ビデオ2：Sのリアルタイム凝集体形成および塞栓VWF + / +マウスにおける黄色ブドウ球菌 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ビデオ図3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> ビデオ3：Sのリアルタイム接着 - / -マウス- / - 。VWF + / +およびVWFを有するマウス においてインビボ腸間膜灌流モデル球菌VWF中の活性化血管壁へ 。のCa 2+ -ionophore（10ミリモル）の5μlをアプリでした可視化血管床の領域とエド。カルボキシ-フルオレセイン標識Sのサスペンション黄色ブドウ球菌は、頸静脈カテーテルを介して注入しました。腸間膜循環が倒立顕微鏡下で可視化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.6K ビュー.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

ビデオ: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

SynVivo合成微小血管網を利用した剪断接着マップの生成

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

生物工学

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価する<em&gt;エクスビボ</em&gt; Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

発生生物学

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

流れの下で標的とする血管薬を研究するためのin Vitro 3D細胞培養動脈モデル

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...