الكتاب أشكر أليكس شير لتتكرم تقاسم خط Zebrabow-M المعدلة وراثيا، جيفري بيرنز للناقلات pDEST ورينيه ايتييه-ديغل] لرعاية ممتازة للمنشأة الأسماك والخطوط. التمويل: ونحن ممتنون للدعم السخي بتمويل من NIDCR RO3DE024490 ومستشفى شراينرز للأطفال (ECL) والزمالات التدريبية ما بعد الدكتوراه من مستشفى شراينرز للأطفال (LR وYK).

وافقت لجنة ماساتشوستس العام مستشفى المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) جميع الإجراءات المنصوص عليها في البروتوكول رقم # 2010N000106. هذا هو في الامتثال مع جمعية للتقويم والاعتماد في مختبر رعاية الحيوان الدولية (AAALAC) المبادئ التوجيهية. 1. الكواشف والمواد التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 L من 50X E3 المتوسط ​​الجنين (انظر الجدول 1) وإعداد 1 لتر من 1X E3 المتوسط ​​الجنين (انظر الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد E3 المتوسط ​​الجنين مع N-الفنيل (PTU) وذلك بإضافة 30 ملغ من PTU إلى 1 L من 1X E3. ضجة O / N لضمان أن PTU قد حلت تماما. تخزين في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل pronase، وتمييع 150 ميكرولتر من pronase (0.5 ملغ / مل) مع 15 مل من 1X E3. هذا المبلغ يكفي لطبق بتري 1. استخدامها على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل ميثيل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل E3-تريكين عن طريق خلط 75 مل من 0.2٪ تريكين مع 25 ملمن 1X E3. يغلي 3 جرام من ميثيل في 75 مل من محلول E3-تريكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الحجم النهائي إلى 100 مل مع حل E3-تريكين. الحل ميثيل النهائي هو لزج وغير شفافة مع لون مصفر. التخزين: RT محمية من الضوء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تاموكسيفين الأسهم وحل التعريفي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 ملي حل الأسهم تاموكسيفين عن طريق إذابة في الإيثانول بنسبة 100٪، hydroxytamoxifen 4. متجر السهم عند -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيف جديدة من التاموكسيفين في تركيز الرغبة في 1X E3 للحصول على حل الاستقراء. الحذر! يرجى الرجوع MSDS قبل الاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 L 0.2٪ تريكين حسب الجدول 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الشرائح مبائر. الغراء أربعة ساترة (18 × 18) معا لتشكيل كتلة ثم وضع لبنات 2 على 24 × 60 سم ساترة 2 الى جانب اتاحة الفرصة المتزايدة للجنين في الوسط. </li></ol> 2. إعداد الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوط المعدلة وراثيا. <br/&gt; ملاحظة: كان Zebrabow-M هدية سخية من مختبر اليكس شير ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية ملاحظة: توليد ناقلات استهداف pDestTol2- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية باستخدام أساليب الاستنساخ الجزيئي القياسية والحصول على تجاريا إعادة التركيب تكنولوجيا الاستنساخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين 5 &quot;استنساخ الدخول (pENTR5&#39;- sox10p) التي تحتوي على 7.2Kb من المروج sox10، استنساخ الأوسط عبارة (PME-ERT2-لجنة المساواة العرقية)، و3 &#39;استنساخ الدخول (pENTR3&#39;-بوليا) في رد فعل LR مع جهة العدسة ناقلات pDestTol2- α-غلوبولين العدسة: YFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية بناء pDestTol2- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية. شارك في حقن بناء (100 نانوغرام / ميكرولتر) تنقيته مع Tol2 transposase مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر) في أجنة WT (F0) في مرحلة خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة مؤسسي F0 الكبار لنقل خط الجرثومية على أساس مضان أصفر قوي في الأجنة F1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية؛ Zebrabow-M <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهجين وZebrabow-Mخط (2.1.1) مع sox10: خط المعدلة وراثيا ERT2-لجنة المساواة العرقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر الأجنة اظهار تعبير قوي في كل مكان RFP وYFP عدسة علامة وتنمو لهم حتى الكبار. </li></ol></li></ol> 3. الأجنة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عدة أزواج من sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية؛ Zebrabow-M الزرد المعدلة وراثيا 17:00 حتي 18:00 في يوم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وسحب فواصل في الصباح وجمع البيض عند الظهر تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقلها إلى أطباق بتري وإضافة 15 مل من محلول pronase إلى dechorionate الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة عن 1-5 دقائق حتى تم dechorionated ما يقرب من 60٪ من الأجنة. وقف رد فعل من قبل الصب الحل pronase وغسل الأجنة 3-4 مرات مع الطازجة المتوسطة E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة dechorionated في E3 في RT O / N والسماح لهم تطوير للوصول إلى مرحلة 10 القطع البدنية النمطية. احتضان 50-60 الأجنة في مخلب لتجنب نمو التنموية المختلفة. </li></رأ&gt; 4. علاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق المرحلة التنموية الأجنة &quot;تحت المجهر مجال ضوء للتأكد من أنها في مرحلة 10 القطع البدنية النمطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر الفلورسنت مع أحمر بروتين فلوري (RFP) مرشح، عزل الأجنة الحمراء الزاهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى تحريض جنة المساواة العرقية، إعادة التركيب من خلال إضافة 10 ميكرومتر من حل hydroxytamoxifen إلى طبق بتري واحتضان الأجنة المعزولة في 28.5 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الحل تاموكسيفين وغسل الأجنة عدة مرات مع E3. الحذر! تجاهل الحل تاموكسيفين في وعاء خاص النفايات البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في 28.5 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الأجنة هي تقريبا 28-29 مرحلة القطع البدنية النمطية (حوالي 24 ساعة الإخصاب آخر)، واحتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية في E3-PTU حل الآخرة. ملاحظة: PTU هنا تستخدم لمنع تشكيل melanophores في الأجنة النامية. هذا هو العلاج اللازم لتجنب تشويه إشارة مضان من قبل melanophores السيارات الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في 28.5 ° C </li></ol> 5. اختيار الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور هياكل القحفي تطويره بالكامل، حدد الأجنة في 4 أيام الإخصاب آخر لشدة الإشارة الحمراء وجنة المساواة العرقية التعبير علامة إيجابية (الصفراء في شبكية العين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة مع الحل E3 / 0.015٪ تريكين. تأكيد التخدير عندما لا تحركات نشطة أو النشاط الزعانف لوحظ عندما حث بلطف الجنين. </li></ol> 6. تركيب الأجنة في Methycellulose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجنين اختيارها للتصوير في طبق بتري تحتوي على قطرة من ميتيل وضمخ بلطف الجنين مع ميثيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شريحة متحد البؤر نظيفة، ضع قطرة من ميثيل الطازجة وجبل الجنين الخاص بك في غضون الهبوط باستخدام طرف microloader. موقف الجنين يأخذ ظهريا الحذر عدم لمسالجنين مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الجنين شنت مع 25 × 25 ساترة وضبط الموقف من الجنين إذا لزم الأمر عن طريق التلاعب في ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجنين هو الآن على استعداد لصورة. </li></ol> تحليل 7. بواسطة المجهر مضان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الهدف 20x والجاف عدسة (الفتحة العددية 0.75؛ الثقب حجم 2.0 ميكرون) لتركيز الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر L100 على المجهر واختيار القنوات في البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد زر الإعداد متحد البؤر وانقر على &#39;السيارات&#39; وحدد القنوات التالية قبل أن يغلق النافذة: CH1: CFP، CH2: GFP، CH3: طلب تقديم العروض أو mCherry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على CH2 CH3 وقبل النقر على زر &quot;إزالة التعشيق. انقر على &quot;مسرحية&quot; لبدء المسح الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على بنية الفائدة، التي من الأفضل القيام من خلال البدء مع الإطار ½ / ثانية والجهد العالي (HV) 150 ثم ضبط الإعدادات وفقا لذلك حتى نوعية الصورة المطلوبة هي ميلانhieved. ان طلب تقديم العروض تكون أكثر إشراقا من الألوان الأخرى، وبالتالي ضبط HV. تغيير Z موقف للعثور على حد سواء YFP والخلايا إيجابية طلب تقديم العروض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة مع مجموعة الضبط، التقاط صورة الجنين الخاص بك. حفظ الصورة الخاصة بك في شكل برامج التصوير وTIFF شكل متحد البؤر لمعالجة الصور في كل قناة الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، لتصوير CFP، إيقاف CH2 CH3 ووتشغيل CH1. إعادة ضبط الإعدادات كما في الخطوة 5 دون تغيير مجال التركيز. ملاحظة: CFP يمكن أن يكون من الصعب حقا للكشف بسبب إشارة الخلفية في القناة الزرقاء التي يمكن التحايل عليها من خلال تعديل حجم الثقب. A حجم الثقب أكبر يسمح كشف أفضل لمضان عن طريق الحد من إشارة / نسبة الضوضاء الخلفية. ومع ذلك، فإن الثقب أكبر تقليل تأثير متحد البؤر، المساومة على جودة الصورة. ولذلك، مطلوب التعديل الدقيق لإعدادات لتحقيق جودة الصورة المطلوبة وشدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصورة وحفظها في شكل كليهما (البرمجيات متحد البؤر وTIFF) لمعالجة الصور. ويمكن بعد ذلك معالجة الصور باستخدام مشترك برامج معالجة الصور لدمج الطبقات وتحسين إعدادات الألوان كما وصفها وعموم الزملاء 8. </li></ol>

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

خطوط المعدلة وراثيا الزرقاء وphotoconvertible الألسيان كما هو موضح أعلاه يكمل بعضها البعض لتحديد عملية معقدة من الغضاريف ونمو العظام. ومع ذلك، منذ فترة طويلة افترض الهجرة الخلوية الحية والمنظمة خلال توالد وغير مباشرة ولكن أثبتت تصور أبدا. Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا إلى جانب و?...

وتتطلب التنمية القحفي الجزيئية، والتفاعلات الخلوية والأنسجة المعقدة لدفع تكاثر الخلايا، والهجرة والتمايز 1،2، 3. هذه عملية منظمة بإحكام ومعقدة وتخضع لاضطرابات وراثية وبيئية، بحيث تشوهات القحفي هي من بين تشوهات المواليد الأكثر شيوعا 1-9. في حين لا تزال التدخلات الجراحية الدعامة الأساسية لعلاج الشذوذ القحفي، فهم أساس التنمية ضروري لابتكار علاجات في المستقبل. لذلك، ودراسة التشكل والآليات في التقارب والإرشاد والتكامل الخلية يقدم أفكارا جديدة في تشكيل الهيكل العظمي القحفي 1. الجمجمة العصبية ترحيل قمة وملء أول البلعوم القوس، عمليات الفك السفلي ثم شكل تقرن التي تمتد لتشكيل غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي. التشكل سو غضروف ميكل يتطلب تنظيم خلية غضروفية عبر انتشار الاتجاه، الاستقطاب الخلايا والتمايز 1،10. ومع ذلك، فإن تعقيد تنظيم خلية غضروفية في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. فهم سلوك الخلية الحيوي أمر بالغ الأهمية لفهم التشوهات الخلقية التي تؤثر على حجم الفك السفلي، مثل الظواهر الفك السفلي مصبغ 11. الأجنة الزرد توفر العديد من المزايا التنموية وراثية لدراسة مفصلة للغضروف ميكل التشكل. من قابلية الإستطراق الجيني، والشفافية، فيفو السابقين والتطور السريع مزايا قوية الإقراض جيدا لرصد حركة الخلايا والمنظمة من قبل التصوير الحي 6. باستخدام أدوات تتبع النسب، مثل sox10: خط المعدلة وراثيا Kaede الذي، نحن وغيرنا قد حددت أصول قمة العصبية الهيكل العظمي القحفي الجنينية 1،5. باليودنانوغرام sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية مع يو بي آي: Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا، أصبح من الممكن الآن لاستكشاف تفاصيل الحركات الخلوية أثناء تطوير القحفي. وZebrabow-M، هو خط المعدلة وراثيا هندسيا مع المروج بتحول القيادة التعبير عن fluorophores مختلفة، ولكل يحيط بها مواقع السلمون المدخن 8. وfluorophore الافتراضي Zebrabow-M هو أحمر، معربا عن طلب تقديم العروض. بعد تحريض لجنة المساواة العرقية التعبير، وZebrabow-M بناء يعيد توحيد والخلايا التعبير عن مزيج من fluorophores مختلفة (RFP، CFP وYFP) خلق التعبير متعددة الأطياف في الجنين. كل الخلايا الوليدة التي تفرق من الخلايا المسمى بعد وقوع الحدث إعادة التركيب ثم يتم المسمى متطابق بسلالة، لذلك وصفت أن السكان الخلية التي تستمد من الأسلاف جنبا إلى جنب مختلفة متطابق بسلالة. من خلال هذا الوسم خلية الاستنساخ، وتكاثر الخلايا والهجرة مع قرار نسيلي يمكن اتباعها (الشكل 1 و 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

تطوير الهياكل القحفي الفقارية يتطلب التنسيق الدقيق للهجرة الخلايا وانتشار، الالتصاق والتمايز. الزخرفة من غضروف ميكل، والبلعوم الأولى قوس مشتق، ينطوي على الهجرة من قمة العصبية في الجمجمة (CNC) خلايا والتدريجي التقسيم وانتشارها وتنظيم غضروفية متباينة. وقد وصفت عدة دراسات الهجرة CNC خلال أقل التشكل الفك، ولكن تفاصيل كيفية غضروفية تحقيق التنظيم في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. وsox10 المقيدة والتي يسببها كيميائيا لجنة المساواة العرقية بوساطة recombinase إعادة التركيب يولد التباديل من البروتينات الفلورية متميزة (RFP، YFP وCFP)، وبالتالي خلق وضع العلامات المتعددة الأطياف من الخلايا الاولية وذريتهم، مما يعكس السكان نسيلي متميزة. باستخدام متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير الفوتوغرافي، فمن الممكن لمراقبة غضروفية behaviأو أثناء وضع الغضروف الزرد ميكل. وضع العلامات الخلية متعدد الأطياف تمكن العلماء من إثبات تمديد غضروفية وميكل. خلال مرحلة تمديد غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي، غضروفية يقحم لإحداث تمديد لأنها كومة في خلية واحدة في الصف الطبقات تنظيما. فشل هذه العملية الإقحام المنظمة للتوسط تمديد خلية يوفر التفسير الآلي الخلوي للفك السفلي عن نقص التنسج التي نلاحظها في تشوهات الفك السفلي.

كان التصور الغضروف التقليدي كلها جبل الألسيان بقع زرقاء لا تقدر بثمن في مراقبة وضع غضروف ميكل وتستخدم عادة لتصور نهائي الخلوي التنظيم 12 (الشكل 1A). لمزيد من تحليل غضروفية تطوير العمل الإضافي، وتتبع النسب باستخدام sox10: خطوط المعدلة وراثيا Kaede الذي مك...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckelâ€™s Cartilage at JoVE.

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&amp;#8217;s Cartilage

منذ فترة طويلة افترض تنظيم خلية من خلايا العظام القحفي ولكن لم تصور مباشرة. وضع العلامات خلية متعددة الأطياف والحية على الهواء مباشرة التصوير يسمح التصور من سلوك الخلية الحيوي في الفك السفلي الزرد. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتلاعب Zebrabow الأسماك المعدلة وراثيا ومراقبة مباشرة إقحام خلية والتغيرات المورفولوجية للغضروفية في غضروف ميكل.

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

9.0K Views.  Harvard Medical School.  منذ فترة طويلة افترض تنظيم خلية من خلايا العظام القحفي ولكن لم تصور مباشرة. وضع العلامات خلية متعددة الأطياف والحية على الهواء مباشرة التصوير يسمح التصور من سلوك الخلية الحيوي في الفك السفلي الزرد. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتلاعب Zebrabow ال...

Video: Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق<em&gt; في المختبر</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

في المختبر فحوصات تقييم الهجرة، والغزو، وانتشار خطوط الخلايا مخلدة تروفوبلست البشرية في الاثلوث الأول

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

الليزر التقاط ميكروتشريح الغضروف الجنيني الماوس والعظام لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...