Los autores agradecen a Alex Schier para compartir amablemente la línea transgénica Zebrabow-M, Geoffrey Burns, para el vector pDEST y Renee Ethier-Daigle para un excelente cuidado de las instalaciones y líneas de peces. FINANCIACIÓN: Estamos muy agradecidos por el generoso apoyo financiero de NIDCR RO3DE024490 y Hospitales Shriners para niños (ECL) y becas de formación post-doctoral de los Hospitales Shriners para Niños (LR y YK).

Cuidado y Uso Comité Hospital General de Massachusetts Institucional Animal (IACUC) aprobó todos los procedimientos previstos en el número de protocolo # 2010N000106. Esto está de acuerdo con la Asociación para la Evaluación y Acreditación de directrices Laboratorio Animal Care International (AAALAC). 1. Los reactivos y materiales de preparación <ol><li> Preparar 1 l de 50X medio E3 embrión (Ver Tabla 1) y preparar 1 L de medio embrión 1X E3 (Ver Tabla 2). </li><li> Preparar medio de embrión E3 con N-feniltiourea (PTU) mediante la adición de 30 mg de PTU a 1 L de 1X E3. Stir O / N para asegurar que el PTU se haya disuelto completamente. Guarde a temperatura ambiente. </li><li> Para preparar la solución de pronasa, diluir 150 ml de pronasa (0,5 mg / ml) con 15 ml de 1X E3. Esta cantidad es suficiente para un plato de Petri 1. Utilizar inmediatamente. </li><li> Prepare la solución de metilcelulosa. <ol><li> Preparar la solución E3-tricaína mezclando 75 ml de 0,2% con 25 ml tricaínade 1X E3. Hervir 3 g de metilcelulosa en 75 ml de la solución E3-tricaína. </li><li> Completar el volumen final a 100 ml con solución E3-tricaína. La solución de metilcelulosa al final es viscosa y opaca con un tinte amarillento. Almacenamiento: RT protegido de la luz. </li></ol></li><li> El tamoxifeno acción y solución de inducción <ol><li> Preparar 5 mM solución madre tamoxifeno por disolución de 4-hidroxitamoxifeno en etanol 100%. Tienda de stock a -80 ° C. </li><li> Preparar la dilución fresca de tamoxifeno a la concentración deseo en 1X E3 para obtener la solución de inducción. ¡CUIDADO! Por favor, consulte la hoja antes de su uso. </li></ol></li><li> Preparar 1 L de 0,2% tricaína según la Tabla 3. </li><li> Obtener diapositivas confocal. Pega cuatro cubreobjetos (18 x 18) juntos para formar un bloque a continuación, colocar los bloques en un 2 x 24 60 cubreobjetos 2 cm entre sí para permitir el montaje del embrión en el centro. </li></ol> 2. Preparación de embriones <ol><li> Las líneas transgénicas. <br/&gt; NOTA: Zebrabow-M fue un generoso regalo de laboratorio de Alex Schier. </li><li> SOX10: ERT2-Cre NOTA: Generar el vector dirigido pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre usando métodos de clonación molecular estándar y obtiene comercialmente recombinación tecnología de clonación. <ol><li> Combinar 5 &#39;clon de entrada (pENTR5&#39;- sox10p) que contiene el promotor de 7.2Kb SOX10, un clon media Gateway (PME-ERT2-Cre), y un 3&#39; clon de entrada (pENTR3&#39;-poliA) en una reacción LR con destino lente vector pDestTol2- α-cristalina: YFP. </li><li> Purificar constructo pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. Co-inyectar la construcción purificada (100 ng / l) con Tol2 ARNm transposasa (50 ng / l) en embriones WT (F0) en la fase de una célula. </li><li> Pantalla fundadores F0 adultos para la transmisión de la línea germinal basan en una fuerte fluorescencia amarilla en embriones F1. </li></ol></li><li> SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M <ol><li> Outcross la Zebrabow-Mlínea (2.1.1) con el SOX10: línea transgénica ERT2-Cre. </li><li> Seleccionar embriones que presentan una fuerte expresión RFP ubicua y el marcador lente YFP y crecer hasta los adultos. </li></ol></li></ol> 3. Embryo Collection <ol><li> Configurar varios pares de SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M pez cebra transgénico 17:00-18:00 del día 1. </li><li> Al día siguiente, tire de los divisores de la mañana y recoger los huevos alrededor del mediodía. </li><li> Transferirlos a cápsulas Petri y añadir 15 ml de la solución de pronasa a dechorionate los embriones. </li><li> Incubar los embriones de 1 a 5 minutos hasta aproximadamente el 60% de los embriones han sido dechorionated. Detener la reacción por decantación la solución de pronasa y lavar los embriones 3-4 veces con medio fresco E3. </li><li> Incubar los embriones dechorionated en E3 a TA O / N y dejar que ellos desarrollan para alcanzar la etapa 10 somitas. Incubar 50-60 embriones por el embrague para evitar diferente crecimiento del desarrollo. </li></ol&gt; 4. Tratamiento <ol><li> Compruebe la etapa de desarrollo de los embriones en un microscopio de campo claro para asegurar que están en la etapa de 10 somitas. </li><li> El uso de un microscopio de fluorescencia con una proteína fluorescente (RFP) filtro rojo, aislar a los embriones de color rojo brillante. </li><li> Proceder a la inducción de la recombinación Cre-mediante la adición de 10 mM de solución hydroxytamoxifen a la placa de Petri e incubar los embriones aislados en 28,5 ° C durante 3 hr. </li><li> Decantar la solución tamoxifeno y lavar los embriones varias veces con el E3. ¡CUIDADO! deseche la solución tamoxifeno en un recipiente especial desechos biológicos. </li><li> Incubar los embriones a 28,5 ° CO / N. </li><li> Cuando los embriones son aproximadamente los 28-29 etapa somitas (alrededor de 24 horas después de la fecundación), incubar los embriones a 28,5 ° C en el E3-PTU solución de aquí en adelante. NOTA: PTU es aquí utilizado para inhibir la formación de melanóforos en los embriones en desarrollo. Este tratamiento es necesarioevitar la distorsión de la señal de fluorescencia por melanóforos auto-fluorescente. </li><li> Incubar los embriones a 28,5 ° C </li></ol> Selección 5. Embriones <ol><li> Para visualizar las estructuras craneofaciales plenamente desarrollados, seleccione los embriones a los 4 días después de la fecundación de la intensidad de la señal roja y Cre positividad marcador expresión (amarilla en la retina). </li><li> Anestesiar al embriones con solución E3 / 0,015% tricaína. La anestesia se confirma cuando no hay movimientos activos o actividad de la aleta se observa cuando pinchar suavemente el embrión. </li></ol> 6. Montaje del Embrión en Metilcelulosa <ol><li> Transferir el embrión seleccionado para la imagen en una placa de Petri que contiene una gota de metilcelulosa y embalsamar suavemente el embrión con metilcelulosa. </li><li> En una diapositiva confocal limpia, coloque una gota de metilcelulosa fresco y montar el embrión dentro de la gota usando una punta microloader. Posición embrión teniendo dorsal precaución de no tocarel embrión directamente. </li><li> Cubrir el embrión montado con un cubreobjetos de 25 x 25 y ajuste la posición del embrión si es necesario mediante la manipulación del cubreobjetos. </li><li> El embrión está ahora listo para la imagen. </li></ol> 7. Análisis por microscopía de fluorescencia <ol><li> Utilice el objetivo 20x seca lente (apertura numérica 0,75; tamaño del agujero de alfiler 2,0 micras) para enfocar el embrión. </li><li> Pulse el botón L100 en el microscopio y seleccionar los canales en el software. </li><li> Seleccione el botón de configuración confocal y haga clic en &#39;auto&#39; y seleccione los siguientes canales antes de cerrar la ventana: Ch1: PPC, Ch2: GFP, Ch3: RFP o mCherry </li><li> Encienda CH2 y CH3 antes de hacer clic en el botón &quot;eliminar interlock &#39;. Haga clic en &quot;juego&quot; para comenzar la exploración. </li><li> Concéntrese en estructura de interés, que es mejor hacerlo iniciando con marco ½ / seg y de alto voltaje (HV) 150 y luego ajustar la configuración en consecuencia hasta que la calidad de imagen deseada es achieved. En el PP sería más brillante que otros colores, por lo tanto, ajustar el HV. Cambie la posición de Z a encontrar tanto YFP y células positivas RFP. </li><li> Una vez configurado con los ajustes, la captura de la imagen de su embrión. Guarde su imagen en el formato confocal formato de software de imagen y TIFF para el procesamiento de imágenes en cada canal de división. </li><li> A continuación, para obtener imágenes de la PPC, apague CH2 y CH3 y encienda Ch1. Re-ajustar la configuración como en el paso 5 sin cambiar el área de enfoque. NOTA: PPC puede ser muy difícil de detectar debido a la señal de fondo en el canal azul que pueden ser eludidas mediante el ajuste del tamaño del agujero de alfiler. Un tamaño del agujero de alfiler grande permite una mejor detección de la fluorescencia mediante la reducción de ruido de señal / fondo. Sin embargo, un agujero de alfiler grandes reducirán efecto confocal, comprometer la calidad de imagen. Por lo tanto, se requiere un ajuste cuidadoso de los ajustes para lograr la calidad de imagen deseada y la intensidad. </li><li> Captura de la imagen y guardarla en el formato tanto (software confocal y TIFF) para procesamiento de imágenes. Las imágenes pueden ser procesados ​​utilizando el software común de procesamiento de imágenes para fusionar capas y mejorar los ajustes de color como se describe por Pan y sus colegas 8. </li></ol>

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Líneas transgénicas azules y fotoconvertible Alcian como se ha descrito anteriormente complementa entre sí para definir el intrincado proceso de cartílago y desarrollo de los huesos. Sin embargo, la migración celular en vivo y la organización durante la organogénesis mucho tiempo se ha planteado la hipótesis e indirectamente demostrado pero nunca visualizó. Línea transgénica Zebrabow-M junto con un cartílago Cre específica permite la observación en vivo simultánea de todos estos eventos distintos implicad...

Desarrollo craneofacial requiere, interacciones celulares y tisulares moleculares complejas para impulsar la proliferación celular, la migración y la diferenciación 1,2, 3. Este proceso estrechamente regulado y complejo está sujeto a perturbaciones genéticas y ambientales, de tal manera que las deformidades craneofaciales se encuentran entre las malformaciones congénitas más comunes 1-9. Si bien las intervenciones quirúrgicas siguen siendo la base del tratamiento de anomalías craneofaciales, la comprensión de la base del desarrollo es esencial para innovar terapias futuras. Por lo tanto, el estudio de la morfogénesis y los mecanismos en la convergencia y la extensión y la integración de células proporciona nuevos conocimientos sobre la formación del esqueleto craneofacial 1. Craneal migrar y la cresta neural pueblan el primer arco faríngeo, procesos mandibulares luego formar pares que se extienden para formar el cartílago de Meckel, que prefigura la mandíbula. Morfogénesis of cartílago de Meckel requiere organización condrocitos mediante la proliferación de dirección, la polarización celular y 1,10 diferenciación. Sin embargo, la complejidad de la organización de los condrocitos en el crecimiento y la extensión del cartílago de Meckel sigue siendo poco clara. Comprender el comportamiento celular dinámica es fundamental para comprender las malformaciones congénitas que afectan al tamaño de la mandíbula, como fenotipos mandíbula hipoplasia 11. Embriones de pez cebra ofrecen muchas ventajas del desarrollo y genéticos para el estudio detallado de los cartílagos morfogénesis de Meckel. Su maleabilidad genética, la transparencia, la ex vivo y el rápido desarrollo son poderosas ventajas de préstamos bien para la observación del movimiento celular y la organización de imágenes en vivo 6. El uso de herramientas de trazado de linaje, como SOX10: línea transgénica Kaede, nosotros y otros han delineado los orígenes de la cresta neural del esqueleto craneofacial embrionaria 1,5. Using del SOX10: ERT2-Cre con el ubi: línea transgénica Zebrabow-M, ahora es posible explorar los detalles de los movimientos celulares durante el desarrollo craneofacial. El Zebrabow-M, es una línea transgénica diseñado con el promotor de ubiquitina de conducir la expresión de diferentes fluoróforos, cada uno flanqueado por sitios lox 8. El fluoróforo predeterminado Zebrabow-M es rojo, expresando RFP. Después de la inducción de la expresión de Cre, la Zebrabow-M construir recombina y células expresan una combinación de diferentes fluoróforos (RFP, CFP y YFP) la creación de expresión multi-espectral en el embrión. Todas las células hijas que dividen a partir de las células marcadas después del evento de recombinación son entonces clonalmente etiquetados, de modo que las poblaciones de células que se derivan de diferentes progenitores yuxtapuestas están etiquetados clonalmente. Por este etiquetado celular clonación, la proliferación de células y la migración con la resolución clonal pueden ser seguidos (Figura 1 y 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

Desarrollo de las estructuras craneofaciales vertebrados requiere una coordinación precisa de la migración celular, la proliferación, adhesión y diferenciación. Patrones del cartílago de Meckel, un primer arco faríngeo derivado, implica la migración de las células de la cresta neural craneal (CNC) y la división progresiva, la proliferación y la organización de los condrocitos diferenciados. Varios estudios han descrito la migración CNC durante la morfogénesis inferior de la mandíbula, pero los detalles de cómo los condrocitos alcanzar organización en el crecimiento y la extensión del cartílago de Meckel sigue sin estar claro. El SOX10 restringido y químicamente inducido Cre recombinasa recombinación mediada genera permutaciones de proteínas fluorescentes distintas (RFP, YFP y PPC), creando de este modo un etiquetado multi-espectral de células progenitoras y su progenie, lo que refleja poblaciones clonales distintas. Usando confocal fotografía time-lapse, es posible observar los condrocitos behavio durante el desarrollo del cartílago de Meckel el pez cebra. Etiquetado celular multiespectral permite a los científicos para demostrar la extensión de los condrocitos de Meckel. Durante la fase de extensión del cartílago de Meckel, que prefigura la mandíbula, los condrocitos se intercalan para efectuar la extensión, ya que se apilan en una fila en capas de una sola célula organizada. El fracaso de este proceso de intercalación organizado para mediar en la extensión de células proporciona la explicación mecanicista celular para mandíbula hipoplásica que observamos en las malformaciones de la mandíbula.

Visualización cartílago tradicional por enteros manchas azules montaje Alcian ha sido muy valioso para observar el desarrollo de cartílago de Meckel y de uso común para la visualización definitiva celular organización 12 (Figura 1). A fin de analizar los condrocitos en desarrollo las horas extraordinarias, el linaje de rastreo utilizando SOX10: Kaede líneas transgénicas nos ha permitido estudiar la migración celular, la convergencia y la extensión en embriones vivos 2,...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckelâ€™s Cartilage at JoVE.

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&amp;#8217;s Cartilage

Organización celular de los huesos craneofaciales mucho tiempo se ha planteado la hipótesis pero nunca visualizada directamente. Etiquetado de células multi-espectral y en vivo vivo imágenes permite visualizar el comportamiento celular dinámico en el maxilar inferior del pez cebra. Aquí, detallamos el protocolo que manipulamos Zebrabow peces transgénicos y observamos directamente intercalación celular y los cambios morfológicos de los condrocitos en el cartílago de Meckel.

Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

9.0K vistas.  Harvard Medical School.  Organización celular de los huesos craneofaciales mucho tiempo se ha planteado la hipótesis pero nunca visualizada directamente. Etiquetado de células multi-espectral y en vivo vivo imágenes permite visualizar el comportamiento celular dinámico en el maxilar inferior del pez cebra. Aquí, detallamos el protocolo que manipulamos Zebrabow peces transgénicos y observamos directamente intercalación celular y los cambios morfológicos de los condrocitos en el cartíl...

Video: Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC cuantificando el nivel de metilación de ADN de la distredenciación de condrocitos<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basado en la microinyección en Vivo implantación de cardiomiocitos embrionarios en el embrión aviar

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...