Die Autoren danken Alex Schier für die freundliche Aufteilung der Zebrabow-M transgene Linie, Geoffrey Verbrennungen für den pDest Vektor und Renee Ethier-Daigle für hervorragende Betreuung der Fische Anlage und Leitungen. FINANZIERUNG: Wir sind dankbar für die großzügige finanzielle Unterstützung von NIDCR RO3DE024490 und Shriners Hospitals for Children (ECL) und Post-Doc-Ausbildungsstipendien von Shriners Hospitals for Children (LR und YK).

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt alle Verfahren unter Protokollnummer # 2010N000106. Dies ist im Einklang mit der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International (AAALAC) Richtlinien. 1. Reagenzien und Materialien Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie 1 l 50X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 1) und bereiten 1 l 1X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 2). </li><li> Vorbereitung E3 Embryo Medium mit N-Phenylthioharnstoff (PTU), die durch Zugabe von 30 mg PTU zu 1 l 1X E3. Stir O / N, um sicherzustellen, daß die PTU vollständig gelöst hat. Lagern bei RT. </li><li> Auf Pronase-Lösung herzustellen, verdünnter 150 ul Pronase (0,5 mg / ml) mit 15 ml 1X E3. Diese Menge reicht für 1 Petrischale. Verwenden Sie sofort. </li><li> Bereiten Methylcellulose-Lösung. <ol><li> Vorbereitung E3-Tricaine Lösung durch Mischen von 75 ml 0,2% Tricaine mit 25 ml1X E3. Sieden 3 g Methylcellulose in 75 ml E3-Tricaine Lösung. </li><li> Bilden das Endvolumen auf 100 ml mit E3-Tricaine Lösung. Die endgültige Methylcelluloselösung ist viskos und opak mit einem gelblichen Farbton. Lagerung: RT lichtgeschützt. </li></ol></li><li> Tamoxifen Lager und Induktionslösung <ol><li> Vorbereitung 5 mM Tamoxifen Stammlösung durch Auflösen von 4-Hydroxytamoxifen in 100% Ethanol. Shop Lager bei -80 ° C. </li><li> Bereiten Sie frische Verdünnung von Tamoxifen auf den Wunsch Konzentration in 1X E3, um die Induktion Lösung zu erhalten. VORSICHT! Bitte wenden Sie sich vor dem Gebrauch MSDS. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 1 l 0,2% Tricaine gemäß Tabelle 3. </li><li> Erhalten konfokalen Rutschen. Kleben Sie vier Deckglas (18 x 18) zusammen, um einen Block zu bilden dann legen Sie 2 Blocks auf einem 24 x 60 Deckglas 2 cm voneinander entfernt, damit die Montage des Embryos in der Mitte. </li></ol> 2. Embryo Vorbereitung <ol><li> Transgenen Linien. <br/&gt; Hinweis: Zebrabow-M war ein großzügiges Geschenk von Alex Schier Labor. </li><li> Sox10: ERT2-Cre HINWEIS: Generieren Sie die Targeting-Vektor pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre unter Verwendung von Standardverfahren und molekulare Klonierung kommerziell erhalten Rekombination Cloning-Technologie. <ol><li> Kombinieren Sie 5 &quot;entry clone (pENTR5&#39;- sox10p) enthält 7.2Kb des Sox10-Promotor, eine Gateway-Mitte-Klon (PME-ERT2-Cre) und eine 3&#39;-entry clone (pENTR3&#39;-polyA) in einer LR-Reaktion mit Objektiv Ziel vector pDestTol2- α-Kristallin: YFP. </li><li> Reinige Konstrukt pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre. Co-einspritzen des gereinigten Konstrukts (100 ng / ul) mit Tol2 Transposase mRNA (50 ng / &amp; mgr; l) in WT Embryonen (F0) an dem einen Zellstadium. </li><li> Screen F0 Erwachsenen Gründer für Keimbahn-Übertragung auf der Grundlage starker gelber Fluoreszenz in F1 Embryonen. </li></ol></li><li> Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M <ol><li> Outcross die Zebrabow-MLinie (2.1.1) mit der Sox10: ERT2-Cre transgene Linie. </li><li> Wählen Sie die Embryonen eine starke allgegenwärtigen RFP Ausdruck und YFP Linsenmarkierung und wachsen sie, bis Erwachsenen zeigt. </li></ol></li></ol> 3. Embryonen <ol><li> Richten Sie mehrere Paare von Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M transgenen Zebrafisch von 17.00 bis 06.00 Uhr am Tag 1. </li><li> Am folgenden Tag, ziehen Sie die Teiler in der Früh und sammeln die Eier um die Mittagszeit. </li><li> Übertragen Sie sie auf Petrischalen und fügen Sie 15 ml des Pronaselösung, um die Embryonen dechorionate. </li><li> Die Embryonen für 1 bis 5 min inkubieren, bis ca. 60% der Embryonen wurden dechorionated. Die Reaktion durch Dekantieren der Pronaselösung und waschen Sie die Embryonen 3-4 mal mit frischem E3 Medium. </li><li> Inkubieren Sie die dechorionated Embryonen in E3 bei RT O / N und lassen Sie sie zu entwickeln, um die 10 Somiten Stadium zu erreichen. Inkubieren 50-60 Embryonen pro Gelege zu verschiedenen Entwicklungswachstum zu vermeiden. </li></ol&gt; 4. Behandlung <ol><li> Überprüfen Entwicklungsstadium der Embryonen unter einem Lichtfeld-Mikroskop, um sicherzustellen, sie sind auf dem 10 Somiten Stadium. </li><li> Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem rot fluoreszierendes Protein (RFP) Filter, isolieren die leuchtend roten Embryonen. </li><li> Verfahren zur Induktion des Cre-Rekombination durch Zugabe von 10 uM Hydroxytamoxifen Lösung in eine Petrischale und Inkubieren der isolierten Embryonen bei 28,5 ° C für 3 Stunden. </li><li> Dekantiert man die Tamoxifen-Lösung und waschen Sie die Embryonen mehrmals mit E3. VORSICHT! verwerfen die Tamoxifen-Lösung in einem speziellen biologischen Abfallbehälter. </li><li> Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° CO / N. </li><li> Wenn die Embryonen sind ungefähr 28-29 Somiten Stadium (etwa 24 Stunden nach der Befruchtung), Inkubation der Embryonen bei 28,5 ° C in der E3-PTU-Lösung Jenseits. HINWEIS: PTU hier verwendet, um die Bildung von Melanophoren in den sich entwickelnden Embryonen zu hemmen. Diese Behandlung notwendig istvermeiden Sie die Signalverzerrung der Fluoreszenz von Autofluoreszenz Melanophoren. </li><li> Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° C </li></ol> 5. Embryonenauswahl <ol><li> Um die ausgereifte kraniofazialen Strukturen sichtbar zu machen, wählen Sie die Embryonen im 4 Tage nach der Befruchtung für die Intensität des roten Signals und Cre Expressionsmarker Positivität (gelb in der Netzhaut). </li><li> Betäuben die Embryonen mit E3 / 0,015% Tricaine Lösung. Anästhesie wird bestätigt, wenn keine aktiven Bewegungen oder fin-Aktivität beobachtet wird, wenn sanft Drängen des Embryos. </li></ol> 6. Montage der Embryo in Methylcellulose <ol><li> Übertragung der gewählten Embryo zur Bildgebung in eine Petrischale gegeben, die einen Tropfen von Methylcellulose und sanft embalm den Embryo mit Methylcellulose. </li><li> Auf eine saubere konfokalen Rutsche, einen Tropfen von frischem Methylcellulose und montieren Ihren Embryo innerhalb der Tropfen mit Hilfe eines Microloader Spitze. Position Embryo dorsal unter Vorsicht, nicht zu berührender Embryo direkt. </li><li> Decken Sie die montierten Embryo mit einer 25 x 25 Deckglas und die Position des Embryos ggf. durch Manipulation des Deckglases. </li><li> Der Embryo ist nun bereit, image. </li></ol> 7. Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Nutzen Sie die 20-fach trockenen Linsenobjektiv (numerische Apertur 0,75; Lochblendengröße 2,0 um) zum Fokussieren des Embryos. </li><li> Drücken Sie die L100-Taste auf dem Mikroskop und wählen Sie die Kanäle in der Software. </li><li> Wählen Sie das konfokale Setup-Taste und klicken Sie auf &#39;auto&#39; und wählen Sie die folgenden Kanäle vor dem Schließen des Fensters: Ch1: CFP, Kanal 2: GFP, Ch3: RFP oder mCherry </li><li> Schalten Sie CH2 und CH3, bevor Sie auf die &#39;entfernen Interlock &quot;-Taste. Klicken Sie auf &quot;Play&quot;, um das Scannen zu beginnen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Struktur von Interesse, die sich am besten, indem Sie mit ½ Rahmen / s und Hochspannung (HV) 150 und dann die Einstellungen entsprechend durchgeführt wird, bis die gewünschte Bildqualität achieved. Der RFP wäre heller als andere Farben, damit die HV einzustellen. Ändern Sie die Z-Position, um sowohl YFP und RFP-positiven Zellen zu finden. </li><li> Sobald Sie mit den Einstellungen festgelegt, erfassen Sie das Image Ihres Embryos. Speichern Sie Ihr Bild in der konfokalen Imaging-Software-Format und TIFF-Format für die Bildverarbeitung in jedem Split-Kanal. </li><li> Als nächstes wird für CFP-Bildgebung, schalten Sie CH2 und CH3, und schalten Sie Ch1. Durch Veränderung der Einstellungen wie in Schritt 5 ohne Änderung des Fokusbereichs. HINWEIS: CFP kann wirklich schwer zu erkennen aufgrund von Hintergrundsignal in blauen Kanal, der durch Einstellen der Lochblendengröße umgangen werden kann. Eine größere Lochblendengröße ermöglicht eine bessere Detektion der Fluoreszenz durch die Reduzierung Signal / Rausch-Verhältnis. Allerdings wird eine größere Pinhole konfokalen Effekt zu reduzieren, Kompromisse bei der Bildqualität. Daher ist eine sorgfältige Einstellung der Einstellungen erforderlich ist, um die gewünschte Bildqualität und Intensität zu erreichen. </li><li> Nehmen Sie das Bild und speichern Sie es in der sowohl Format (konfokalen Software und TIFF) für die Bildverarbeitung. Bilder können dann mit gängigen Bildverarbeitungssoftware, um Schichten zusammenzuführen und zur Verbesserung der Farbeinstellungen, wie Pan und Kollegen 8 beschrieben verarbeitet werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Alcianblau und Photokonvertierbare transgenen Linien wie oben beschrieben, gegenseitig ergänzt den komplizierten Prozess der Knorpel- und Knochenentwicklung zu bestimmen. Allerdings hat Live-Zellmigration und Organisation während der Organogenese lange vermutet worden und indirekt nachgewiesen, aber nie visualisiert. Zebrabow-M transgene Linie gepaart mit einer Knorpel spezifischen Cre ermöglicht die gleichzeitige Live-Beobachtung aller dieser verschiedenen Ereignisse im Knochen- und Knorpelbildung beteiligt. Diese T...

Kraniofazialen Entwicklung erfordert komplexe molekularer, zellulärer und Gewebe-Wechselwirkungen, die Zellproliferation, Migration und Differenzierung 1,2, 3 fahren. Diese streng reguliert und komplexer Prozess unterliegt genetischen und umweltbedingten Störungen, so dass kraniofazialen Fehlbildungen gehören zu den häufigsten Geburtsfehlbildungen 1-9. Während chirurgischer Eingriffe bleiben die Hauptstütze der Behandlung für kraniofaziale Anomalien, das Verständnis der Entwicklung Basis ist wichtig, um zukünftige Therapien zu innovieren. Daher Studium der Morphogenese und die Mechanismen in der Konvergenz und der Erweiterung und Zell Integration bietet neue Einblicke in die Bildung des kraniofazialen Skeletts 1. Schädel Neuralleiste migrieren und Füllen der ersten Schlundbogen, dann gepaart bilden Kiefer Prozesse, die zur Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt bilden verlängern. Morphogenese of der Meckel-Knorpel benötigt Chondrozyten-Organisation über Richtungsproliferation, Zellpolarisation und Differenzierung 1,10. Allerdings bleibt die Komplexität der Chondrozyten-Organisation in das Wachstum und die Erweiterung des Meckel-Knorpel unklar. Grundlegendes zu dynamischen Zellverhalten ist entscheidend für das Verständnis angeborene Fehlbildungen betroffen Kiefergröße, wie hypoplastische Mandibula Phänotypen 11. Zebrafischembryonen bieten viele Entwicklungs- und genetische Vorteile für die detaillierte Untersuchung der Meckel-Knorpel Morphogenese. Ihre genetische Lenkbarkeit, Transparenz, ex vivo und schnelle Entwicklung sind leistungsstarke Vorteile verleiht ihm auch zur Beobachtung der Zellbewegung und Organisation von Live-Imaging-6. Verwendung Linie-Tracing-Tools, wie Sox10: kaede transgene Linie, haben wir und andere der Neuralleiste Ursprünge der embryonalen kraniofazialen Skeletts 1,5 abgegrenzt. Using der Sox10: ERT2-Cre mit dem ubi: Zebrabow-M transgene Linie, ist es nun möglich, um Details des Zellbewegungen während kraniofazialen Entwicklung zu erforschen. Die Zebrabow-M, eine transgene Linie mit der Ubiquitin-Promotor, der die Expression von verschiedenen Fluorophore, die jeweils von Lox-Stellen flankiert 8 entwickelt. Die Zebrabow-M Standard Fluorophor Rot, RFP ausdrückt. Nach Induktion der Cre-Expression, die Zebrabow-M zu konstruieren rekombiniert und Zellen exprimieren eine Kombination von verschiedenen Fluorophoren (RFP, CFP und YFP) Erzeugen multispektraler Expression im Embryo. Alle Tochterzellen, die von den markierten Zellen nach dem Rekombinationsereignis teilen werden dann klonal beschriftet, so dass die Zellpopulationen, die aus verschiedenen nebeneinander liegenden Vorläuferzellen abgeleitet werden klonal beschriftet. Durch diese Klonierung Markierung von Zellen, können die Zellen-Proliferation und Migration mit klonaler Auflösung (Abbildung 1 und 2) eingehalten werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

Entwicklung der Wirbeltiere kraniofazialen Strukturen erfordert eine genaue Abstimmung der Zellmigration, Proliferation, Adhäsion und Differenzierung. Strukturieren der Meckel-Knorpel, einem ersten Schlundbogen-Derivat, beinhaltet die Migration der Schädel Neuralleiste (CNC) Zellen und die fortschreitende Partitionierung, Proliferation und Organisation von differenzierten Chondrozyten. Mehrere Studien haben CNC Migration während der Unterkiefer Morphogenese beschrieben, aber die Details, wie die Chondrozyten zu erreichen Organisation in das Wachstum und die Erweiterung der Meckel-Knorpel, bleibt unklar. Die Sox10 beschränkt und chemisch induzierte Cre-Rekombinase-vermittelte Rekombination erzeugt Permutationen von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (RFP, YFP und CFP), wodurch die Schaffung eines multispektralen Kennzeichnung von Vorläuferzellen und deren Nachkommen, was deutliche Klonpopulationen. Mittels konfokaler Zeitraffer-Fotografie, ist es möglich, die Chondrozyten beobachten behavioder während der Entwicklung des Zebrafisches Meckel-Knorpel. Multispektrale Zellmarkierung ermöglicht es Wissenschaftlern auf eine Verlängerung des Meckel-Chondrozyten zu demonstrieren. Während der Extensionsphase des Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt, interkalieren Chondrozyten zu Verlängerung zu bewirken, wie sie in einer organisierten Einzelzellschicht Reihe stapeln. Die Nichtbeachtung dieser organisierten interkalierenden Prozess zur Zellerweiterung vermitteln, bietet das Mobil mechanistische Erklärung für die hypoplastischen Unterkiefer, die wir in der Unterkieferfehlbildungen zu beobachten.

Traditionelle Knorpel Visualisierung ganze Berg Alcianblau Flecken ist von unschätzbarem Wert bei der Beobachtung der Entwicklung von Meckel-Knorpel und häufig verwendet, um endgültige zelluläre Organisation 12 (1A) zu visualisieren. Um die Entwicklung von Knorpelzellen weiter zu analysieren Überstunden, Linie Tracing mit Sox10: Kaede transgenen Linien hat uns ermöglicht, die Zellmigration, Konvergenz und Extension im Live-Embryonen 2,12 (1B) zu stud...

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&amp;#8217;s Cartilage

Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live- Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

visualization-chondrocyte-intercalation-directional-proliferation-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

9.0K Aufrufe.  Harvard Medical School.  Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live- Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel. 

Serie: Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...