The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.

1. 3D قالب تصميم وأجزاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قالب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل العمل، الحصول على عدة سيليكون المطاط الصناعي، وغرفة التصوير الخلية الحية، وكوب 22 ملم ساترة، وتشكيله المعادن مكعب مع أبعاد 10.07 مم × 3.95 مم × 5.99 ملم. إعداد الحية غرفة التصوير الخلية صب من خلال وضع ساترة في حامل القاع، وتجميع ما تبقى من الغرفة وفقا لتوجيهات من قبل البائع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، وذلك باستخدام ملقط، ضع تشكيله مكعب معدن الألمنيوم في وسط الحي التصوير الخلية غرفة السكن وعلى رأس ساترة، ثم توضع جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج حلول المطاط الصناعي السيليكون وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لجعل 5 مل من المطاط الصناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مختبر ملعقة المتاح، صب سيليكون حل المطاط الصناعي في العيش التصوير الخلية إعداد غرفة وضمان عدم نقل ضعت تشكيله مكعب معدن الألمنيوم. وضع النظام على مقاعد البدلاء المختبر في موقع آمن O / N لعلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، تفكيكغرفة التصوير الخلية الحية، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة وسحب العفن باستخدام الملقط. باستخدام ملقط، استخراج بعناية تشكيله مكعب معدن الألمنيوم من العفن. الذهاب إلى الحوض وشطف القالب بالماء منزوع الأيونات. وضع القالب على منشفة ورقية لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجاف مرة واحدة، وذلك باستخدام سكين فائدة هواية، وقطع الشقوق من خلال القالب، متباعدة 2.34 مم وبصرف النظر عن كل نهاية الطولية، داخل القالب السيليكون. ضمان إقامة العفن في مكان آمن وجاف حتى كنت على استعداد لبناء نظام للتجربة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الماء والزجاج مسعور إعداد Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسماح للمصفوفة الكولاجين التمسك السطح، وخلق coverslips ماء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة القابل للتصرف، وقياس من 150 ميكرولتر من 3 أمينو-trimethoxysilane وتصب حل في أنبوب 50 مل. إضافة 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى أنبوب 50 مل مع ماصة المتاح الثانية وإغلاق الغطاء. دوامة الحل لمدة 2 دقيقة، وضمان خلط كاملة. Pالحل لدينا في طبق بتري الزجاج ويوضع جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 15 مل من 100٪ الكحول الإيثيلي في طبق بيتري الثاني ويوضع جانبا (تأكد من تسمية الأطباق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة المتاح جديدة، وقياس من 30 مل من الماء منزوع الأيونات وتصب حل في أنبوب 50 مل. المقبل، وذلك باستخدام مقياس ماصة للتصرف جديد من 1875 ميكرولتر من غلوتارالدهيد وتصب الحل في نفس أنبوب 50 مل وإغلاق الغطاء. دوامة الحل لمدة 2 دقيقة، وضمان خلط كاملة. صب الخليط في طبق بيتري الثالث، ويوضع جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، واخراج واحد 22 ملم الزجاج جولة ساترة وشطف كلا الجانبين مع 100٪ خليط من الإيثانول باستخدام ماصة المتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع تشطف ساترة الزجاج إلى 3-أمينو-trimethoxysilane مع 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ طبق الحل والسماح للجلوس في حل لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالملقط، واخراج الزجاج ساترة وشطف مرة أخرى مع 100٪ من محلول الإيثانول مع ماصة المتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إسقاط تشطف ساترة الزجاج في 1875ميكرولتر من غلوتارالدهيد و 30 مل من خليط الماء منزوع الأيونات ويوضع جانبا لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، وإزالة الزجاج ساترة مع ملقط وشطف مع الماء منزوع الأيونات ومكان على O الأنسجة الجافة / N لتجف في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غمس ساترة ونقل عن العديد من coverslips حسب الحاجة مع حلول لدت نفسها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل coverslips مسعور بواسطة بروتوكول معين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl، 100 ميكرولتر من حمض الخليك و 19.4 مل من الهكسان في أنبوب 50 مل ودوامة لمدة 2 دقيقة. صب الحل في الزجاج طبق بتري وتوضع جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط نظيفة، واخراج واحدة ساترة الزجاج وتسقط في تحضير محلول مختلط لمدة 2 دقيقة. بعد مرور 2 دقيقة، واخراج الزجاج ساترة مع ملقط وشطف مع الماء منزوع الأيونات باستخدام المتاح ماصة ومكان ساترة O الأنسجة الجافة / N لتجف في RT. متجر ساترة في أطباق بتري بلاستيكية حتى استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر ساترة DIPPجي والتحرك لأكبر عدد ممكن من coverslips حسب الحاجة مع حلول لدت نفسها. </li></ol></li></ol></li></ol> الجمعية 2. القالب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام القوالب، وذلك باستخدام ماصة المتاح شطف القالب مع 90٪ ايثيل الكحول أكثر من حاوية النفايات الكيميائية. بعد ذلك، وضع القالب في طبق بيتري مملوءة بالماء منزوع الأيونات والسماح للجلوس O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ قالب من الحل باستخدام ملقط ومكان على منشفة على الهواء الجاف قبل بدء التجمع العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن العفن هو تجفيف الهواء، وقطع لل coverslips ماء مربع الى قسمين المستطيلات أكبر قليلا من 3.95 مم × 5.99 مم باستخدام أداة يخدش الماس عالية الدقة. حرك كل ساترة قطع مستطيل في فتحات قطع في قالب السيليكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه العفن رأسا على عقب وتطبيق الشحوم فراغ على طول الجزء السفلي من القالب السيليكون باستخدام ماصة المتاح. المقبل، والوجه العفن الظهر من الناحية اليمنى فوق واضغط على الجزء السفلي من العفن على دائرية يغطي الزجاج ماءالشفاه لإنشاء ختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع القفازات القابل للتصرف، والتقاط العفن تجميعها ووضعها في طبق بتري المتاح ومن ثم إلى غطاء محرك السيارة الحيوي. تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية الحيوية غطاء محرك السيارة لمدة 1 ساعة لتعقيم العفن قبل حدوث التجريب. </li></ol> 3. الكولاجين الخلطات و مصفوفة 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إعداد مزيج الكولاجين، وصمة عار، وإعداد الخلايا لتصوير وفقا لبروتوكولات القياسية 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام التقنيات المخبرية المعيارية والبروتوكولات 29،30، في القلنسوة الحيوية، مزيج سائل الاعلام الخلية وجاذب كيميائي في أنبوب 15 مل إلى تركيز جاذب كيميائي المطلوب. ماصة 5 مل من خلية حل معين وسائل الإعلام جاذب كيميائي التركيز في أنبوب 15 مل ونقل الحل في حمام الماء الساخن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، استخراج 5 مل من وسائل الاعلام الخلايا عادلة في الثانية أنبوب 15 مل ومكان في حمام الماء الساخن لتسخين حل للتجارب المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في القلنسوة الحيوي، ماصة 30 ميكرولتر من 10X العازلة الفوسفاتإد حل (PBS) في أنبوب الطرد المركزي الجزئي. إضافة 6 ميكرولتر من 1 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) في نفس أنبوب الطرد المركزي الصغيرة ودوامة لمدة 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الكولاجين أنا حل ذيل فأر من الثلاجة والانتقال إلى غطاء محرك السيارة الحيوي باستخدام التقنيات المخبرية المعيارية والبروتوكولات 29. ضمان الكولاجين لا يزال باردا. ماصة 168.3 ميكرولتر من الكولاجين في نفس أنبوب الطرد المركزي الجزئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، إضافة 18 ميكرولتر من المجهرية المعدلة الكربوكسيل الفلورسنت الأصفر والأخضر باستخدام ماصة لنفس أنبوب الطرد المركزي الجزئي. دوامة أنبوب الطرد المركزي الجزئي مع جميع الحلول لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 77.7 ميكرولتر من المطلوب خليط الخلية خلية الإعلام (حوالي 2 × 10 6 خلية / مل تركيز) إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة وتخلط باستخدام ماصة لمدة 20 ثانية. عند الضرورة، تغيير كثافة مصفوفة باتباع الخليط الكولاجين مخصص تكييفها لإضافة الخرز الفلورسنت والجدول بقاء الخلية (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 300 &amp; #181؛ ل من مزيج خلايا الكولاجين في مركز جيد (جيد # 2) من التجمع قالب استعداد. وضع القالب على طبق بتري المتاح ونقلها إلى الحاضنة القياسية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النظام من الحاضنة والمكان مرة أخرى إلى الحيوي غطاء محرك السيارة. باستخدام ملقط، إزالة كل زلات غطاء مسعور من قبل تحامل على الجزء العلوي من كل ساترة وسحب ما يصل، وبعيدا عن القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل النظام برمته إلى المجهر المطلوبة وصورة للتأكد من الجانبين الكولاجين العفن لا تزال على التوالي للسماح التدرج مستو نشرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع نظام لا يزال تحت المجهر، وذلك باستخدام 100 ميكرولتر على قناة واحدة ماصة، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلية إلى جانب # 1. المقبل، وذلك باستخدام 100 ميكرولتر على قناة واحدة ماصة إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلية مع تركيز جاذب كيميائي المطلوب في بئر رقم 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور بعد إضافة الحلول في كلا البئرين، بدء التصوير. </li></ol> 4. التصوير وإنتشارتصميم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان أحد يريد أن يجد معامل الانتشار لكثافة الكولاجين محددة لحساب تركيز محدد، اتبع بروتوكول أدناه: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متابعة بروتوكول معين بعنوان فوق &quot;الكولاجين الخلطات و مصفوفة 3D&quot;، بدلا من توليد وسائل الاعلام الخلية مع تركيز جاذب كيميائي المطلوب، وجعل رودامين 5 ميكرومتر في أنبوب 15 مل باستخدام العمليات الحسابية والبروتوكولات 30 القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة مصفوفات الكولاجين 3D مع نظام متحد البؤر التي شنت على مجهر مقلوب باستخدام الليزر الأرجون (488 نانومتر) لالتقاط مضان. صورة كل 2 أو 3 ثانية لمدة تصل إلى 7 ساعات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنتشار النمذجة: استخدام نموذج رياضي هو مبين أدناه، وكتابة رمز البرنامج الحاسوبي لمعالجة وتحليل هذه الخطوات العامة. <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد الصور إلى برنامج حاسوبي لإعادة قياس وتطبيع كتبها أقصى intenSITY. تحويل الصور إلى اللون الرمادي اللون خريطة الصورة لتحديد الحافة. اختيار محور على طول وسط الصورة، إلى يمين الوسط ويسار الوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام رمز البرنامج الحسابي، رسم كثافة طبيعية، جنبا إلى جنب مع كثافة الحقيقية والفرق بينهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبلة، وإدخال المعلمات الضرورية للتركيب (تركيز، والوقت، وطول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم تركيز تطبيع مقابل الوقت وبيان التركيز عبر محور س مع نوبة متعدد الحدود على البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب معامل الانتشار باستخدام شفرة برمجية الحسابية. </li></ol></li></ol> 5. القياسات التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالعودة إلى معادلة الانتشار، إعادة كتابة المعادلة للعثور على تركيز معين في أي مكان داخل النظام كما هو مبين في أدناه. <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> أين: L = طول عشرالبريد الكولاجين مصفوفة س = الموقع قيد التحقيق D = معامل الانتشار ر = الوقت المنقضي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال التجارب الكيميائي، وضمان لتسجيل وقت محدد أن chemokine اللحظة التي تم إضافتها إلى النظام. مرة واحدة يتم العثور على حركة الهجرة الخلية، وضمان لتسجيل متحد البؤر تسجيل مرور الزمن، ولاحظ في الوقت المحدد والمكان من حافة حيث وقعت التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال تحليل البيانات، والمكونات وأشار انقضى الوقت والمكان ومعامل الانتشار للخلية معينة في المعادلة للعثور على تركيز معين تطبيع في أي نقطة داخل الكولاجين لكلا نشر والتجارب الخلية. </li></ol> 6. تتبع هجرة الخلايا الاستفادة TFM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتتبع هجرة الخلايا باستخدام تقنيات TFM / DVC اتباع البروتوكول التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة تركيز جاذب كيميائي المطلوب في بئر رقم 3، بدء التصوير المصفوفات الكولاجين 3D مع نظام متحد البؤر التي شنت على ميكر مقلوبoscope للعثور على خلية للتحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تم العثور على خلية تتحرك، وضع الخلية في منتصف مجال الرؤية والاستفادة من محرك كهربائي ضغطي (للصورة في محور ض)، وصورة كل 1 أو 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب جيل قوة الخلية وتشوه، وتوليد رمز الحسابية للعثور على النزوح من الخرز مضان بعد بروتوكولات TFM / DVC 31. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Adzick, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Biology+of+Wound+Repair.">The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair.</a> Ann Surg. 225 (2), 236 (1997).</li><li>Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+an+unconventional+approach+to+isolation+of+first+mammalian+morphogens.">Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens.</a> Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).</li><li>Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cancer.">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li><li>Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+effect+of+chemotaxis+on+glioblastoma+tumor+progression.">Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression.</a> AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).</li><li>Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gradient+sensing:+towards+building+predictive+models+of+chemotaxis+in+cancer.">Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Cristini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+Instability+and+Cancer+Invasion.">Morphologic Instability and Cancer Invasion.</a> Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell's+sense+of+direction.">A cell's sense of direction.</a> Science. 284 (5415), 765-770 (1999).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+controlled+molecular+gradients+in+3D+gels.">Generating controlled molecular gradients in 3D gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).</li><li>Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor-induced+cell+motility+in+tumor+invasion.">Growth factor-induced cell motility in tumor invasion.</a> Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).</li><li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+leukocyte+locomotion+and+chemotaxis.">Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).</li><li>Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multichamber+fluidic+device+for+3D+cultures+under+interstitial+flow+with+live+imaging:+development,+characterization,+and+applications.">A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).</li><li>Noo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device.">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).</li><li>Shao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).</li><li>Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+agarose-based+microfluidic+platform+with+a+gradient+buffer+for+3D+chemotaxis+studies.">An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.</a> Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments.">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li><li>Gilbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+diffusion+through+collagen+membranes.">Macromolecular diffusion through collagen membranes.</a> Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).</li><li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+convection+in+collagen+gels:+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium.">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li><li>Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusivity+of+125I-calmodulin+through+collagen+membranes:+effect+of+source+concentration+and+membrane+swelling+ratio.">Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio.</a> Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).</li><li>Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. d. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+modifications+of+collagen+gels:+impact+on+diffusion.">Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion.</a> Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).</li><li>Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-stimulated+chemotaxis+of+human+neutrophils+in+a+3-D+conjoined+fibrin+gel+assay.">Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay.</a> J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li><li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting.">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors.">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).</li><li>Stephenson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , (2010).</li><li>Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fast+Iterative+Digital+Volume+Correlation+Algorithm+for+Large+Deformations.">A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations.</a> Exp. Mech. In press, (2014).</li><li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid,+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes.">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li><li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الخطوات الأكثر أهمية للتجارب الناجحة نشر مع أو بدون الخلايا هي: إعداد بشكل صحيح تصل الجمعية العفن. تطوير ما يلزم من البراعة اليدوية لمنع الضرر أثناء استخراج coverslips مسعور. ضمان للعثور على خط الانطلاق خطي جيد جدا لحساب معامل الانتشار بشكل صحيح؛ تصحيح الحسابات التجريبية...

حركة يفضل الخلايا نحو الانحدار تركيز، والمعروفة باسم الكيميائي، تلعب دورا هاما في العمليات المرضية والفسيولوجية في الجسم. هذه الأمثلة هي الجلد والغشاء المخاطي التئام الجروح 1، 2 التشكل، التهاب 3، و4،5 نمو الورم. وقد تبين أيضا أن الخلايا السرطانية يمكن أن تهاجر من خلال استراتيجيات كل من الخلية الهجرة الفردية والجماعية 6. وعلاوة على ذلك، يمكن لآليات عدم الاستقرار الأنتشارى لحث على فصل الخلايا واحد أو عنقودية من الجسم ورمي / الكائن ومن ثم يمكن أن يهاجر نحو مصدر من المواد الغذائية، وبالتالي غزو المناطق والأنسجة 7 أوسع. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن آليات الهجرة المتنوعة يمكن أن تكون نشطة في 2D و 3D في، وذلك بسبب الأدوار المختلفة للجزيئات الالتصاق 8. لذلك، خطوة إلى أهمية من الناحية الفسيولوجية في فحوصات المختبر للتحقيق في الحركة خلية في measureablه وسيلة بسيطة غير ذات أهمية في فهم حركة الخلية الظواهر 9. لسوء الحظ، وصعوبة في تحليل الهجرة الخليوي، وفحص شامل الكيميائي الكمي وعادة ما يتطلب طريقة شاقة طويلة، تقوم على قياس حركية الخلية والظواهر النقل نماذج محايدة. وتشمل النهج التجريبية الماضية للتحقيق الكيميائي خلية الغرفة بويدن 10 وتحت الفحص الاغاروز 11. ومع ذلك، في هذه المقايسات في وقت مبكر، والتجارب الهجرة الخلية لم ترصد الحركة في احترام لآخر. أكثر من ذلك، الأهم من ذلك، التدرجات تركيز المستخدمة في التجارب لم تكن واضحة المعالم أو مفهومة تماما مع الحفاظ فقط إشارات لمدة لا تتجاوز بضع ساعة. وعلاوة على ذلك، الكيميائي في وقت مبكر محاولات غرفة تقييد الهجرة الخلية على بعدين، ولم تسمح لأحد لمراقبة حركية الهجرة 12. أبحث في غرفة بويدن، وهو فحص نقطة النهايةلن يسمح للباحث لمراقبة الهجرة بصريا، ولا يمكن التفريق مباشرة الكيميائي (حركة الاتجاه) من تنشيط كيميائي (حركة عشوائية). بالإضافة إلى ذلك، العديد من المتغيرات على الاختلافات في حجم المسام وسمك الأغشية جعل غرفة صعبة للغاية لتتكاثر بسهولة وأخفى رد فعل المهاجرين من الخلايا لكيموكينات 13،14. مع الفهم الجديد من على microfluidics، وقد تم التحقيق غرف جديدة والأجهزة الدقيقة كأداة لتحقيق تنقل الخلية تحت ظروف تدفق فراغي أو الكيميائي 15،16. في ظل هذه الأجهزة الجديدة، أدخلت مقاييس خلية جديدة والتحقيق، مثل تأثير إجهاد القص على خلية 17،18. للأسف، غرف الكيميائي ميكروفلويديك السابقة والحالية دراسات الهجرة خلية تقتصر على ركائز و2D نكسة مهمة لأن العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث، والتراسل الفوريهجرة الخلايا المناعية، تنطوي الهجرة 3D. حل جاذب كيميائي في اتصال مع هلام 3D التي تحتوي على الخلايا كما تم ذكر فيها غرف للمراقبة المباشرة أيضا 19،20. هذه الدوائر واثنين من مقصورات، واحدة تحتوي على جاذب كيميائي واحدة تحتوي على الخلايا، وانضم بجانب بعضها البعض أفقيا 21 أو حلقات متحدة المركز 22. وأشار هذه النظم في الاتجاه الصحيح، ولكن لا تبقي نظام الكيميائي لفترة طويلة من الزمن. وعلاوة على ذلك، درس الباحثون أيضا انتشارية من خلال الأغشية الكولاجين في خلايا غسيل الكلى، فضلا عن انتشار جزيئات التتبع من خلال عينات الكولاجين تعرض لضغط الهيدروستاتيكي 23-25. بعض التجارب نشر في المواد الهلامية الكولاجين تعتمد على التعديلات الفيزيائية والكيميائية للالجل باستخدام المجالات المغناطيسية والتأسيس الكيماوية 26. وهناك طريقة شعبية لنمذجة الانتشارية في أعناقالأنسجة genous تعتمد على التصوير مضان المستمر نقطة photobleaching من. وقد كشفت هذه الطريقة تباين في معاملات نشر من الجزيئات في الأنسجة الكولاجينية المنحى. بعد، وقد استخدمت photobleaching من في الغضروف المفصلي وليس الكولاجين المصفوفات. في حين ما شابه ذلك، يجب أن تتم التجارب النمذجة اللازمة من خلال فهم على وجه التحديد معامل انتشار المواد الهلامية الكولاجين. الأهم من ذلك أن الأنظمة لا تستخدم وسيلة لقياس الجيل قوة الخلية. للأسف، يبدو أن معظم الأنظمة ليكون في عداد المفقودين واحد أو اثنين من العناصر الرئيسية للنظام مثالي: والسماح للتتبع الخلية، فهم نشرها التدرج مع عامل الكيميائي من خلال مصفوفة، مجموعة بسيطة نسبيا حتى مع سهولة استنساخ، والتقليل من التفاعلات خلية خلية، والقدرة على قياس وحدة الأبعاد لالكمي (أي السرعة، القوة، وتركيز معين). Moghe وآخرون. </eم&gt; 27 اقترح نظاما الوفاء معظم هذه المتطلبات في الخلايا التي فرقت البداية في جميع أنحاء هلام بدلا من ركز على سطح المرشح، ولكن كان من الصعب قياس القوى التي تولد الخلية. لهذا الغرض، نقدم نظام مستو التدرج نشرها للتحقيق الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D، الذي يسمح احد للتغلب على القيود غرفة نشر الحديثة للفحوصات الحالية، التي تقوم على أساس الوقت الفاصل بين المجهري، إلى جانب تقنيات تحليل الصور لقياس الخلية القوات في بيئة 3D. يوفر هذا البروتوكول وسيلة بسيطة، لكنها مبتكرة لخلق 3D بسيطة نشرها الغرفة التي يمكن استخدامها لتحقيق الكيميائي 3D في خلايا مختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td>
			<td>a two-part misture with a 10:1 mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>CMB for 18mm round coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22mm Glass Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0180281</td>
			<td>Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machined aluminum metal cube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hobby utility knife</td>
			<td>X-Acto</td>
			<td>X3201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>00216A-10</td>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Standard floor model and tabletop centrifuges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
			<td>Fine Point Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-105A</td>
			<td>Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Acetic acid ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090</td>
			<td>Hexane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-precision diamond scribing tool</td>
			<td>Lunzer</td>
			<td>PV-081-3</td>
			<td>Straight extended tip scribe, .020&#34; (.50mm) diameter by .200&#34; (5.0mm) tip length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5C</td>
			<td>High-Vacuum Grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-500</td>
			<td>1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1N sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38215</td>
			<td>Sodium hydroxide concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-332</td>
			<td>Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;F-8813</td>
			<td>Carboxylate-modified microspheres, 0.5 &#181;m, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83689</td>
			<td>Rhodamine B for fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

قدرة هذا الاختبار إلى تقييم دقيق للهجرة الخلية تعتمد على الإعداد الجيد للنظام. لذا، فمن الأهمية بمكان للتأكد من تصميم القالب نظام نشر بدقة وعناية كبيرة في وضع coverslips على حد سواء مسعور وماء، كما هو موضح في الشكل رقم 1. إذا تم تصميم النظام بشكل صحيح وخلال مرحلة ن...

Watch this Scientific Journal Video about Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix at JoVE.com

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K Views.  California State University, Long Beach. Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Video: Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

رقاقة سلالة التدرج لتحفيز السلوكيات الخلوي في الخلية لادن المائية

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

أسلوب لتصميم ومحاكاة النفاذية ونشرها في نموذج ثلاثي الأبعاد من أنسجة في غشاء إدراج نظام لوحات متعددة جيدا

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

تقنية خياطة تينورهافي جديدة مع الأنسجة المهندسة الكولاجين الكسب غير المشروع لإصلاح عيوب وتر كبير

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...