The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.

עיצוב עובש 1. 3D וחלקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העבודה, לקבל ערכת אלסטומר סיליקון, חדר הדמיה תא חי, coverslip זכוכית 22 מ&quot;מ, וקוביית מתכת אלומיניום במכונה עם ממדים 10.07 מ&quot;מ x 3.95 מ&quot;מ x 5.99 מ&quot;מ. הכן את חדר ההדמיה תא החי לדפוס על ידי הצבת coverslip בבעל תחתית והרכבה שאר הקאמרית בבימויו של כספק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, באמצעות מלקחיים, למקם את קוביית מתכת ואלומיניום במכונה באמצע דיור תא ההדמיה תא החי ועל גבי coverslip, ולאחר מכן מניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים פתרונות אלסטומר סיליקון על פי הפרוטוקול של היצרן לעשות 5 מיליליטר של אלסטומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בעזרת מרית מעבדה חד פעמית לשפוך פתרון אלסטומר סיליקון להתקנת תא הדמיה תא חי ולהבטיח שלא להזיז קוביית מתכת ואלומיניום במכונה ממוקמת. הנח את המערכת על ספסל המעבדה, בO בטוח מיקום / N לריפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לפרקחדר ההדמיה תא החי, כפי שהומלץ על ידי היצרן ולשלוף עובש באמצעות מלקחיים. בעזרת מלקחיים, לחלץ בזהירות קוביית מתכת ואלומיניום במכונה מעובש. עבור לכיור ולשטוף את התבנית עם מים ללא יונים. מניחים את התבנית על מגבת נייר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יבש, באמצעות סכין שירות תחביב, לחתוך חריצים באמצעות העובש, במרווחים של 2.34 מ&quot;מ מכל צד אורך, בתוך תבנית סיליקון. ודא שהיות העובש במקום בטוח ויבש עד שיהיו מוכנים לבנות המערכת לניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הידרופילי והידרופובי זכוכית Coverslips הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאפשר את מטריצת קולגן לדבוק פני השטח, ליצור coverslips הידרופילי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה חד פעמית, למדוד את 150 μl של 3-aminopropyl-trimethoxysilane ויוצקים פתרון בצינור 50 מיליליטר. להוסיף 30 מיליליטר של אתנול 100% לצינור 50 מיליליטר עם טפטפת חד פעמי שני ולסגור את המכסה. מערבולת הפתרון עבור 2 דקות, כדי להבטיח ערבוב מלא. Pהפתרון שלנו בצלחת פטרי מזכוכית ומניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 15 מיליליטר של 100% אתיל אלכוהול בצלחת פטרי שנייה ומניח בצד (לוודא לתייג מנות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה חד פעמית חדשה, למדוד את 30 מיליליטר של מים ללא יונים ויוצקים פתרון לתוך צינור 50 מיליליטר. בשלב הבא, באמצעות מדד פיפטה חד פעמי חדש מתוך 1,875 μl של glutaraldehyde ויוצקים פתרון לתוך צינור 50 מיליליטר ולסגור את המכסה. מערבולת הפתרון עבור 2 דקות, כדי להבטיח ערבוב מלא. יוצקים את התערובת לתוך צלחת פטרי שלישית, ומניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להוציא coverslip זכוכית עגולה 22 מ&quot;מ אחד ולשטוף שני הצדדים עם 100% תערובת אתנול באמצעות פיפטה חד פעמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip זכוכית שטף לתוך 3-aminopropyl-trimethoxysilane עם 30 מיליליטר של 100% אתנול צלחת פתרון ולאפשר לשבת בפתרון במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, להוציא coverslip זכוכית ולשטוף שוב עם 100% פתרון אתנול עם פיפטה חד פעמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק coverslip זכוכית שטוף ל1,875μl של glutaraldehyde ו -30 מיליליטר של תערובת מים ללא יונים ומניחים בצד למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להסיר את coverslip זכוכית עם מלקחיים ולשטוף עם מים ללא יונים ומניח על גבי O רקמה היבש / N לייבוש על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טבילה חוזרת coverslip ומרגש עבור coverslips לפי צורך עם הפתרונות שנוצרו זהים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך coverslips הידרופובי על ידי הפרוטוקול נתון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, של חומצה אצטית 100 μl ו19.4 מיליליטר של הקסאן בצינור 50 מיליליטר ומערבולת למשך 2 דקות. יוצקים פתרון בצלחת פטרי מזכוכית ומניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים נקיים, להוציא coverslip כוס אחת ושחרר לפתרון מעורב הכין עבור 2 דקות. לאחר 2 דקות חלפו, להוציא coverslip זכוכית עם מלקחיים ולשטוף עם מים ללא יונים באמצעות coverslip פיפטה והמקום הפנוי על O רקמה היבש / N לייבוש על RT. coverslip חנות בצלחות פטרי פלסטיק עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DIPP coverslip חזורing ומרגש עבור coverslips לפי צורך עם הפתרונות שנוצרו זהים. </li></ol></li></ol></li></ol> עצרת 2. עובש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימוש בתבניות, באמצעות פיפטה חד פעמית לשטוף את התבנית עם 90% אתיל אלכוהול על מיכל פסולת כימי. בשלב הבא, למקם את התבנית בצלחת פטרי מלאה במים ללא יונים ולאפשר לשבת O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח עובש מהפתרון באמצעות מלקחיים ומניחים על מגבת לייבוש באוויר לפני שמתחיל ההרכבה העובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד העובש הוא אוויר ייבוש, לחתוך את coverslips הידרופילי הריבוע לשני מלבנים מעט הגדול יותר 3.95 מ&quot;מ x 5.99 מ&quot;מ באמצעות כלי scribing יהלומי דיוק גבוה. להחליק כל coverslip מלבן לחתוך לתוך החריצים לחתוך לתוך תבנית סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התבנית הפוכה ולמרוח משחה ואקום לאורך תחתית תבנית סיליקון באמצעות פיפטה חד פעמית. בשלב הבא, להפוך את התבנית בחזרה בצד ימני ולחץ על תחתית התבנית על גבי מכסה הזכוכית הידרופילי המעגלימס שפות כדי ליצור חותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כפפות חד פעמיות, להרים את העובש התאסף ומקום לתוך צלחת פטרי חד פעמית ולאחר מכן ליו-מכסה המנוע. הפעל מנורת יו-ברדס UV במשך שעה 1 לעקר את התבנית לפני ניסויים מתרחש. </li></ol> 3. תערובת קולגן ו3D מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת תערובת קולגן, הכתם ולהכין תאים להדמיה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטית ופרוטוקולים 29,30, ביו-מכסה המנוע, לערבב תקשורת סלולארי וchemoattractant בצינור 15 מיליליטר לריכוז chemoattractant רצוי. פיפטה 5 מיליליטר של תמיסת ריכוז תאים ספציפית מדיה-chemoattractant לתוך צינור 15 מ&quot;ל ולהעביר את הפתרון לתוך אמבט מים מחומם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, לחלץ 5 מיליליטר של תקשורת סלולארי רק לתוך צינור 15 מיליליטר שני ומקום באמבט מים מחומם כדי לחמם את הפתרון לניסויים במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביו-למכסה המנוע, 30 μl פיפטה של ​​10x חיץ פוספטפתרון אד (PBS) לתוך צינור צנטריפוגות מיקרו. הוסף 6 μl של הידרוקסיד נתרן 1 N (NaOH) לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו ומערבולת למשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג פתרון זנב עכברוש אני קולגן מהמקרר ולעבור ליו-מכסה המנוע תוך שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטית ופרוטוקולים 29. ודא קולגן הוא עדיין קר. פיפטה 168.3 μl של קולגן לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להוסיף 18 μl של microspheres-שונה carboxylate ניאון צהוב-ירוק בעזרת פיפטה לאותו צינור צנטריפוגות מיקרו. מערבולת צינור צנטריפוגות מיקרו עם כל הפתרונות למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 77.7 μl של תערובת מדיה-תא תא רצוי (כ 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ריכוז) לצינור צנטריפוגות מיקרו ולערבב באמצעות קצה פיפטה במשך 20 שניות. במידת צורך, לשנות את צפיפות המטריצה ​​על ידי ביצוע תערובת קולגן המותאם אישית מותאמת לתוספת של חרוזי ניאון ושולחן כדאיות תא (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 300 &amp; #181; L של תערובת קולגן תאים למרכז היטב (גם מס &#39;2) של ההרכבה העובש מוכנה. מניחים את התבנית על צלחת פטרי חד פעמית ולהעביר אותו לחממה סטנדרטית עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מערכת מהחממה ולמקם בחזרה ליו-מכסה המנוע. בעזרת מלקחיים, להסיר את שני התלושים לכסות הידרופובי על ידי כיווץ על החלק העליון של כל coverslip ומושך כלפי מעלה והרחק מהתבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את המערכת כולה למיקרוסקופיה ותמונה הרצויות על מנת להבטיח צדדים עובש קולגן עדיין ישר, כדי לאפשר שיפוע דיפוזיה מישוריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המערכת עדיין מתחת למיקרוסקופ, באמצעות פיפטה ערוץ יחיד 100 μl, להוסיף מדיה תא 100 μl ולמס &#39;1. בשלב הבא, בעזרת פיפטה ערוץ יחיד 100 μl להוסיף של תקשורת תא עם ריכוז chemoattractant רצוי 100 μl ולמס &#39;3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הוספת פתרונות לשתי הבארות, להתחיל הדמיה. </li></ol> 4. הדמיה ודיפוזיהדוגמנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אחד לא רוצה למצוא את מקדם הדיפוזיה לצפיפות קולגן הספציפי כדי לחשב את הריכוז המסוים, בצע את הפרוטוקול שלהלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפרוטוקול שניתן לעיל תחת הכותרת &quot;תערובת קולגן ו3D מטריקס,&quot; במקום לייצר תקשורת תא עם ריכוז chemoattractant רצוי, לעשות rhodamine 5 מיקרומטר בצינור 15 מיליליטר באמצעות חישובים ופרוטוקולים סטנדרטיים 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת מטריצות קולגן 3D עם מערכת confocal רכובים על מיקרוסקופ הפוכה באמצעות לייזר ארגון (488 ננומטר) כדי ללכוד את הקרינה. תמונה כל שניות 2 או 3 עד 7 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמנות דיפוזיה: שימוש במודל המתמטי שמוצג להלן, לכתוב קוד תוכנה חישובית לעיבוד וניתוח בצעדים הכלליים אלה. <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבוא תמונות לתוך תוכנה חישובית לrescaling ונרמול ידי inten המרביסיטי. המרת תמונות לצבע מפה אפורה של התמונה כדי לבחור את הקצה. בחר ציר לאורך מרכז התמונה, מימין למרכז ושמאלה מהמרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקוד התוכנה חישובית, העלילה העצמה המנורמלת, יחד עם עוצמת האמיתית וההבדל בין שתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, קלט הפרמטרים הדרושים להרכבה (ריכוז, זמן, ואורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה הריכוז המנורמל לעומת זמן ופרופיל הריכוז על פני ציר x עם פולינום לנכון את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מקדם דיפוזיה באמצעות קוד התוכנה חישובית. </li></ol></li></ol> 5. מדידות ניסויי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתייחסו בחזרה למשוואת דיפוזיה, לשכתב את המשוואה כדי למצוא את הריכוז הספציפי בכל מקום במערכת כפי שמוצג בהמשך. <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> איפה: L = אורך של המטריצת קולגן דואר x = מיקום תחת חקירה D = מקדם דיפוזיה t = זמן שחלף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניסויי chemotaxis, להבטיח להקליט זמן המסוים שchemokine הרגע התווספה למערכת. ברגע שתנועת נדידת תאים נמצאת, להבטיח להקליט הקלטת הזמן לשגות confocal, ושים לב לזמן מסוים ומיקום מהקצה שבו התרחש הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניתוח הנתונים, לחבר את ציין שחלף הזמן, מיקום ומקדם דיפוזיה לתא הספציפי למשוואה כדי למצוא את הריכוז הספציפי המנורמל בכל נקודה בתוך קולגן עבור דיפוזיה וניסויים תא. </li></ol> 6. נדידת תאי מעקב ניצול TFM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר נדידת תאים תוך שימוש בטכניקות TFM / DVC לעקוב אחר הפרוטוקול להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התוספת של ריכוז chemoattractant רצוי ולמס &#39;3, להתחיל הדמיה מטריצות קולגן 3D עם מערכת confocal רכובה על MICR הפוךoscope למצוא תא לחקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתא נע נמצא, למקם את התא באמצע שדה הראייה ולנצל מנוע פיזואלקטריים (לתמונה בציר z), תמונה כל דקות 1 או 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחישוב דור כוח התא ועיוות, ליצור קוד חישובית כדי למצוא את ההתקות של חרוזים הקרינה הבאים פרוטוקולי TFM / DVC 31. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Adzick, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Biology+of+Wound+Repair.">The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair.</a> Ann Surg. 225 (2), 236 (1997).</li><li>Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+proteins:+an+unconventional+approach+to+isolation+of+first+mammalian+morphogens.">Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens.</a> Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).</li><li>Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cancer.">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li><li>Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+effect+of+chemotaxis+on+glioblastoma+tumor+progression.">Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression.</a> AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).</li><li>Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+gradient+sensing:+towards+building+predictive+models+of+chemotaxis+in+cancer.">Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Cristini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+Instability+and+Cancer+Invasion.">Morphologic Instability and Cancer Invasion.</a> Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell's+sense+of+direction.">A cell's sense of direction.</a> Science. 284 (5415), 765-770 (1999).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+controlled+molecular+gradients+in+3D+gels.">Generating controlled molecular gradients in 3D gels.</a> Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).</li><li>Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor-induced+cell+motility+in+tumor+invasion.">Growth factor-induced cell motility in tumor invasion.</a> Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).</li><li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+leukocyte+locomotion+and+chemotaxis.">Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).</li><li>Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multichamber+fluidic+device+for+3D+cultures+under+interstitial+flow+with+live+imaging:+development,+characterization,+and+applications.">A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications.</a> Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).</li><li>Noo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device.">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).</li><li>Shao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).</li><li>Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+agarose-based+microfluidic+platform+with+a+gradient+buffer+for+3D+chemotaxis+studies.">An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.</a> Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments.">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li><li>Gilbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+diffusion+through+collagen+membranes.">Macromolecular diffusion through collagen membranes.</a> Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).</li><li>Ramanujan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+convection+in+collagen+gels:+implications+for+transport+in+the+tumor+interstitium.">Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium.</a> Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).</li><li>Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusivity+of+125I-calmodulin+through+collagen+membranes:+effect+of+source+concentration+and+membrane+swelling+ratio.">Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio.</a> Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).</li><li>Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. d. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+modifications+of+collagen+gels:+impact+on+diffusion.">Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion.</a> Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).</li><li>Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-stimulated+chemotaxis+of+human+neutrophils+in+a+3-D+conjoined+fibrin+gel+assay.">Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay.</a> J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).</li><li>Sundd, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+paxillin+in+rolling+neutrophils+by+dual-color+quantitative+dynamic+footprinting.">Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting.</a> Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Volume+Transfers+with+Serological+Pipettes+and+Micropipettors.">Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors.</a> J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).</li><li>Stephenson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , (2010).</li><li>Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fast+Iterative+Digital+Volume+Correlation+Algorithm+for+Large+Deformations.">A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations.</a> Exp. Mech. In press, (2014).</li><li>Shenoy, V., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Collagen+and+Hyaluronic+Acid,+Rigid-Rod-Flexible+Polymer+Composite+Matrixes.">Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes.</a> Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).</li><li>Leddy, H., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Molecular+Diffusion+in+Articular+Cartilage+Measured+using+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

השלבים הקריטיים ביותר לניסויי דיפוזיה מוצלחים עם או בלי תאים הם: כראוי הקמת ההרכבה העובש; פיתוח המיומנות הידנית הנחוצה כדי למנוע נזק במהלך החילוץ של coverslips הידרופובי; הבטחה למצוא קו זינוק ליניארי טוב מאוד כדי לחשב את מקדם הדיפוזיה כראוי; לתקן חישובים ניסיוניים של שני ...

התנועה העדיפה תאי כיוון מפל ריכוזים, הידוע בשם chemotaxis, ממלאת תפקיד חשוב בתהליכים פתולוגיים ופיסיולוגיים בגוף. דוגמאות כאלה הן ריפוי עור ורירית פצע 1, המורפוגנזה 2, דלקת 3, ו4,5 צמיחת גידול. כמו כן, הוכיח כי תאים סרטניים יכולים לנדוד דרך שתי אסטרטגיות תא-ההגירה האישיות וקולקטיביות 6. יתר על כן, מנגנוני חוסר יציבות diffusional יכולים לגרום להפרדה של תאים בודדים או התקבצו מגוף / אובייקט tumorous ואז יכול לעלות לכיוון מקור של חומרים מזינים ובכך לפלוש אזורים ורקמות 7 רחבים יותר. יתר על כן, הוכיח כי מנגנוני הגירה מגוונים יכולים להיות פעילים ב2D וב3D, בשל תפקידים שונים של מולקולות הידבקות 8. לכן, מעבר לרלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחני מבחנה לחקור תנועתיות תא בmeasureablדואר ודרך פשוטה הוא בעל משמעות בהבנת תנועת תא תופעות 9. למרבה הצער, הקושי בניתוח נדידת תאים, assay chemotaxis כימות מקיף בדרך כלל דורש שיטה מייגע ארוכה, שנוסדה על המדידה של דגמי תנועתיות תא ותופעות תחבורה נטולי פניות. גישות ניסיוניות עבר לחקור chemotaxis תא כוללות תא וידן 10 ומתחת assay agarose 11. עם זאת, בתוך מבחני המוקדמים אלה, ניסויי נדידת תאים לא לפקח על התנועה בכבוד לעת. יותר, וחשוב, הדרגתיים ריכוז המשמש לניסויים אינם מוגדר היטב או מובן לחלוטין תוך שמירת האיתות ללא יותר מכמה שעות בלבד. יתר על כן, ניסיונות קאמריים chemotaxis מוקדם מוגבלים נדידת תאים לשני ממדים ולא לאפשר אחד כדי לפקח על קינטיקה של הגירה 12. מסתכל על חדר בוידן, assay נקודות קצהלא יאפשר לחוקר לבחון הגירה מבחינה ויזואלית ולא יכל להבחין ישירות chemotaxis (תנועה כיוונית) מchemokinesis (תנועה אקראית). בנוסף, מספר משתנה-הבדלים בגודל הנקבובית ועובי של קרומי תוצרת קאמריים קשה מאוד לשחזר בקלות והסתירו את התגובה של תאים זרות לכמוקינים 13,14. עם ההבנה החדשה של מיקרופלואידיקה, תאים חדשים ומיקרו-מכשירים נחקרו ככלי לחקור תנועת תא תחת תנאי זרימת ביניים או Chemotaxis 15,16. תחת מכשירים החדשים אלה, מדדי תא חדשים הוכנסו ונחקרו, כמו ההשפעה של לחץ גזירה על תא 17,18. לרוע המזל, תאי chemotaxis microfluidic עבר ובהווה מוגבלים מחקרים של נדידת תאים למצעים-2D נסיגה חשובה שכן רבים תהליכים ביולוגיים, כוללים פלישת תאים סרטניים וגרורות, וimנדידת תאי mune, כרוכה הגירת 3D. תאים-בי תצפית ישירה פתרון chemoattractant הוא במגע עם ג&#39;ל 3D המכיל תאים יש גם דיווחו גם 19,20. יש תאים אלה שני תאים, אחד המכיל chemoattractant ואחד המכיל תאים, הם הצטרפו לצד אחד את השני בצורה אופקית 21 או כטבעות קונצנטריות 22. מערכות אלה הצביעו בכיוון הנכון, אבל לא שומרות מערכת chemotaxis לתקופה ארוכה של זמן. יתר על כן, חוקרים בחנו גם diffusivity דרך קרומי תאי קולגן בדיאליזה, כמו גם דיפוזיה של מולקולות נותב דרך דגימות קולגן נתון ללחץ ההידרוסטטי 23-25. ניסויי דיפוזיה חלק בג&#39;ל קולגן להסתמך על שינויים פיזיים וכימיים של ג&#39;ל באמצעות שדות מגנטיים והתאגדות כימית 26. שיטה פופולרית לדוגמנות diffusivity בcollaרקמות genous מסתמכת על ההדמיה הקרינה של photobleaching נקודה הרציף. שיטה זו חשפה אנאיזוטרופיה במקדמי דיפוזיה של מולקולות גדולות ברקמות collagenous בכיוון. ובכל זאת, photobleaching נעשה שימוש בסחוס במפרק ולא קולגן מטריצות. בעוד דומה, חייבים להתבצע ניסויי דוגמנות צורך בהבנה במיוחד מקדם דיפוזיה של ג&#39;ל קולגן. וחשוב יותר, המערכות לא לנצל שיטה למדידת דור כוח התא. למרבה הצער, רוב המערכות נראות חסרות מרכיבים מרכזיים אחד או שתיים למערכת אידיאלית: מאפשרים מעקב של תא, הבנת שיפוע דיפוזיה עם גורם chemotactic באמצעות המטריצה, להגדיר פשוט יחסית עם הקלות של שחזור, מזעור תאי תאים אינטראקציות, ואת היכולת למדוד יחידות ממדיות לכימות (כלומר, מהירות, כוח, ריכוז ספציפי). Moghe et al. </eמ &#39;&gt; 27 הציע מערכת שמלאה את רוב הדרישות אלה שבתאים היו בתחילה מפוזרים בג&#39;ל ולא התרכזו בשטח המסנן, אבל היה קשה למדוד כוחות שהתא מייצר. למטרה זו, אנו מציגים מערכת דיפוזיה השיפוע מישוריים לחקור chemotaxis במטריצת קולגן 3D, המאפשר לאדם להתגבר על מגבלות תא דיפוזיה מודרניות של מבחני קיימים, המבוסס על מיקרוסקופיה זמן לשגות, בשילוב עם טכניקות ניתוח תמונה למדוד תא כוחות בסביבת 3D. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, עדיין חדשנית של יצירת תא דיפוזיה פשוטה 3D שיכול לשמש כדי לחקור chemotaxis 3D בתאים שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td>
			<td>a two-part misture with a 10:1 mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>CMB for 18mm round coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22mm Glass Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0180281</td>
			<td>Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machined aluminum metal cube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hobby utility knife</td>
			<td>X-Acto</td>
			<td>X3201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>00216A-10</td>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Standard floor model and tabletop centrifuges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
			<td>Fine Point Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-105A</td>
			<td>Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Acetic acid ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090</td>
			<td>Hexane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-precision diamond scribing tool</td>
			<td>Lunzer</td>
			<td>PV-081-3</td>
			<td>Straight extended tip scribe, .020&#34; (.50mm) diameter by .200&#34; (5.0mm) tip length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5C</td>
			<td>High-Vacuum Grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-500</td>
			<td>1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1N sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38215</td>
			<td>Sodium hydroxide concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-332</td>
			<td>Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;F-8813</td>
			<td>Carboxylate-modified microspheres, 0.5 &#181;m, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83689</td>
			<td>Rhodamine B for fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

היכולת של assay זה להעריך את ההגירה של התאים במדויק מסתמכת על הגדרה טובה של המערכת. לכן, זה קריטי עבור לוודא לעצב את תבנית מערכת דיפוזיה מדויקת ודואגים גדולים בהצבת coverslips שני הידרופובי והידרופילי, כפי שמודגם באיור 1. אם המערכת מתוכננת כראוי ובשלב דוגמנות דיפוזי...

Watch this Scientific Journal Video about Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix at JoVE.com

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K Views.  California State University, Long Beach. Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Video: Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

טכניקת תפירת טנורהאפי חדשנית עם שתל קולגן מהונדס רקמה לתיקון פגמים גדולים בגיד

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: גישה חזקה, לא פולשנית כדי לחקור את חילוף החומרים האנרגיה התאית

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...