The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.

Diseño de molde 1. 3D y Refacciones <ol><li> Molde <ol><li> Antes de trabajar, obtener un kit de elastómero de silicona, una cámara de imágenes de células vivas, un cubreobjetos de vidrio de 22 mm, y un cubo de metal de aluminio mecanizado con dimensiones de 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Prepare la cámara de imágenes de células vivas para el moldeo mediante la colocación de cubreobjetos en el soporte inferior y el montaje del resto de la cámara de la manera indicada por el vendedor. </li><li> A continuación, utilizando unas pinzas, coloque el cubo de metal de aluminio mecanizado en el medio de la vivienda en vivo cámara de imágenes de células y en la parte superior del cubreobjetos, y luego dejar de lado. </li><li> Mezclar las soluciones de elastómero de silicona de acuerdo con el protocolo del fabricante para hacer 5 ml de elastómero. </li><li> Usando una espátula de laboratorio desechable, vierta la solución de elastómero de silicona en la configuración de cámara imágenes de células vivas y garantizar que no se mueva colocado cubo de metal de aluminio mecanizado. Coloque el sistema sobre la mesa del laboratorio, en un lugar seguro O / N para el curado. </li><li> A la mañana siguiente, deconstruirla cámara de imágenes de células vivas, según lo recomendado por el fabricante y sacar del molde utilizando fórceps. Con unas pinzas, extraiga con cuidado el cubo de metal de aluminio mecanizado de molde. Ir al fregadero y enjuague el molde con agua desionizada. Coloque el molde sobre una toalla de papel para secarse. </li><li> Una vez seco, utilizando un cuchillo manía, corte ranuras a través del molde, espaciados 2,34 mm de distancia de cada extremo longitudinal, en el interior del molde de silicona. Asegúrese de que las estancias de molde en un lugar seguro y seco hasta que esté listo para construir el sistema para un experimento. </li></ol></li><li> Hidrófilas e hidrófobas Glass Preparación Cubreobjetos <ol><li> Para permitir que la matriz de colágeno a que se adhieran a una superficie, crear cubreobjetos hidrófilos: <ol><li> Utilizando una pipeta desechable, mida 150 l de 3-aminopropil-trimetoxisilano y se vierte la solución en un tubo de 50 ml. Añadir 30 ml de etanol al 100% al tubo de 50 ml con una segunda pipeta desechable y cierre la tapa. Vortex la solución durante 2 min, asegurando un mezclado completo. Pnuestra solución en una placa de Petri de vidrio y dejar de lado. </li><li> Verter 15 ml de 100% de alcohol etílico en una segunda placa de Petri y dejar de lado (asegúrese de etiquetar los platos). </li><li> Usando una nueva pipeta desechable, mida 30 ml de agua desionizada y se vierte la solución en un tubo de 50 ml. A continuación, utilizando una nueva medida pipeta desechable a cabo 1.875 l de glutaraldehído y se vierte la solución en el mismo tubo de 50 ml y cierre la tapa. Vortex la solución durante 2 min, asegurando un mezclado completo. Vierta la mezcla en tercera placa de Petri, y dejar de lado. </li><li> Con unas pinzas, saca uno 22 mm cubreobjetos de cristal redondo y enjuague ambos lados con 100% de mezcla de etanol con una pipeta desechable. </li><li> Coloque cubreobjetos de vidrio enjuagado en 3-aminopropil-trimetoxisilano con 30 ml de etanol al 100% plato solución y deje reposar en la solución durante 5 minutos. </li><li> Con unas pinzas, sacar cubreobjetos de vidrio y aclarar de nuevo con una solución de etanol al 100% con la pipeta desechable. </li><li> Caída cubreobjetos enjuagados en 1875l de glutaraldehído y 30 ml de la mezcla de agua desionizada y dejar de lado durante 30 minutos. </li><li> Después de 30 minutos, retire cubreobjetos de vidrio con unas pinzas y enjuague con agua desionizada y coloque sobre el tejido seco O / N para secar a temperatura ambiente. </li><li> Inmersión cubreobjetos Repetir y moverse durante tantos cubreobjetos según sea necesario con las mismas soluciones generadas. </li></ol></li><li> Hacer cubreobjetos hidrofóbicos por el protocolo dado. <ol><li> Añadir 500 l de tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 l de ácido acético y 19,4 ml de hexano en un tubo de 50 ml y agitar durante 2 min. Vierta la solución en vidrio placa de Petri y dejar de lado. </li><li> Con unas pinzas limpias, sacar un cubreobjetos de vidrio y colocar en una solución mixta preparada durante 2 min. Transcurridos 2 minutos, sacar cubreobjetos de vidrio con unas pinzas y enjuague con agua desionizada con una pipeta desechable y lugar cubreobjetos sobre el tejido seco O / N para secar a temperatura ambiente. Cubreobjetos tienda en platos de plástico Petri hasta su uso. </li><li> DIPP cubreobjetos Repitación y en movimiento para tantos cubreobjetos según sea necesario con las mismas soluciones generadas. </li></ol></li></ol></li></ol> Asamblea 2. Molde <ol><li> Antes de utilizar moldes, con una pipeta desechable enjuague el molde con un 90% de alcohol etílico en un contenedor para desechos químicos. A continuación, colocar el molde en una placa de Petri llena de agua desionizada y deje reposar O / N. </li><li> Tome el molde de la solución utilizando pinzas y colocar sobre una toalla para secar al aire antes de iniciar el montaje del molde. </li><li> Mientras el molde es de secado al aire, cortar los cubreobjetos hidrófilos cuadrados en dos rectángulos ligeramente mayores que 3,95 mm x 5,99 mm usando una herramienta de diamante-trazado de alta precisión. Deslice cada cubreobjetos corte rectangular en las ranuras cortadas en el molde de silicona. </li><li> Da la vuelta al molde boca abajo y aplicar grasa de vacío a lo largo de la parte inferior del molde de silicona con una pipeta desechable. A continuación, dar la vuelta al molde de vuelta del lado derecho hacia arriba y presione la parte inferior del molde sobre las cubiertas de vidrio hidrofílicos circulareslos labios para crear un sello. </li><li> Con guantes desechables, recoger el molde montado y colocar en un plato desechable Petri y luego en un bio-capucha. Encienda la lámpara de Bio-campana UV durante 1 hora para esterilizar el molde antes de que ocurra la experimentación. </li></ol> 3. El colágeno mezcla y Matrix 3D <ol><li> Antes de preparar la mezcla de colágeno, manchas y preparar células para obtener imágenes de acuerdo con protocolos estándar 28. </li><li> Utilizando técnicas de laboratorio estándar y protocolos de 29,30, en un bio-campana, mezclar los medios de comunicación celulares y quimioatrayente en un tubo de 15 ml a la concentración deseada quimioatrayente. Pipeta 5 ml de solución de concentración quimioatrayente medios celda específica en un tubo de 15 ml y mover la solución en un baño de agua caliente. </li><li> Con una pipeta, extraer 5 ml de medio de células sólo en un segundo tubo de 15 ml y colocar en un baño de agua caliente para calentar la solución para experimentos de microscopía. </li><li> En un bio-hood, pipeta de 30 l de 10x tampón fosfatosolución ed (PBS) en el tubo micro centrífuga. Añadir 6 l de 1 N de hidróxido de sodio (NaOH) en mismo tubo de centrífuga micro y agitar durante 15 seg. </li><li> Obtener colágeno I solución de cola de rata de la nevera y pasar a la bio-campana utilizando técnicas de laboratorio estándar y protocolos 29. Asegúrese de que el colágeno está frío. Pipetear 168,3 l de colágeno en mismo tubo micro centrífuga. </li><li> A continuación, añadir 18 l de color amarillo-verde microesferas modificado carboxilato fluorescentes utilizando una pipeta para el mismo tubo micro centrífuga. Vortex el tubo de centrífuga micro con todas las soluciones para 30 seg. </li><li> Añadir 77,7 l de mezcla de células deseada de células medios de comunicación (aproximadamente 2 x 10 6 células / ml de concentración) en el tubo de micro centrífuga y mezclar usando punta de la pipeta durante 20 s. Según sea necesario, alterar la densidad de la matriz siguiendo la mezcla de colágeno de encargo adaptado para la adición de perlas fluorescentes y mesa de la viabilidad celular (Tabla 1). </li><li> Pipetear 300 &amp; #181; l de mezcla de células de colágeno en el centro bien (bien # 2) del conjunto de molde preparado. Colocar el molde sobre un plato Petri desechable y moverlo en una incubadora estándar durante 20 min a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Retire sistema de incubadora y colocar de nuevo en bio-capucha. Con unas pinzas, retire los dos cubreobjetos hidrofóbicos por apriete sobre la parte superior de cada cubreobjetos y tirando hacia arriba y lejos del molde. </li><li> Mover todo el sistema para la microscopía y la imagen deseada para asegurar lados del molde de colágeno son todavía recto para permitir un gradiente de difusión planar. </li><li> Con el sistema aún bajo el microscopio, usando una 100 l de un solo canal pipeta, añadir 100 l de medio celular en el pocillo # 1. A continuación, utilizando un 100 l de un solo canal pipeta añadir 100 l de los medios de comunicación celular con la concentración deseada en quimioatrayente bien # 3. </li><li> Inmediatamente después de la adición de soluciones en ambos pozos, comenzar de imágenes. </li></ol> 4. Imagen y DifusiónModelado <ol><li> Si uno quiere encontrar el coeficiente de difusión para la densidad de colágeno específico para calcular la concentración específica, siga el protocolo a continuación: <ol><li> Siga el protocolo dado anteriormente titulado &quot;Mezcla Colágeno y Matrix 3D&quot;, en lugar de generar medios de comunicación celular con la concentración quimioatrayente deseada, haga rodamina 5 M en un tubo de 15 ml utilizando cálculos y protocolos 30 estándar. </li><li> Image las matrices de colágeno 3D con un sistema confocal montados en un microscopio invertido usando un láser de argón (488 nm) para capturar la fluorescencia. Imagen cada 2 o 3 segundos para un máximo de 7 horas. </li></ol></li><li> Para Modelado Difusión: Usando el modelo matemático se muestra a continuación, escribir un código de software computacional para el procesamiento y análisis con estos pasos generales. <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Importación de imágenes en el software computacional para cambio de escala y la normalización de la inten máximosidad. Convertir imágenes a un color gris-mapa de la imagen para seleccionar el borde. Recogida de un eje a lo largo del centro de la imagen, a la derecha del centro y a la izquierda del centro. </li><li> Utilizando el código de software computacional, trazar la intensidad normalizada, junto con la verdadera intensidad y la diferencia entre los dos. </li><li> A continuación, introducir los parámetros necesarios para el montaje (concentración, tiempo y longitud). </li><li> Trazar la concentración normalizada frente al tiempo y el perfil de concentración a través del eje x con un ajuste polinómico a los datos. </li><li> Calcular el coeficiente de difusión utilizando el código de software computacional. </li></ol></li></ol> 5. Las mediciones experimentales <ol><li> Haciendo referencia de nuevo a la ecuación de difusión, reescribir la ecuación para hallar la concentración específica en cualquier ubicación dentro del sistema como se muestra a continuación. <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Dónde: L = Longitud del XXmatriz de colágeno e x = ubicación bajo investigación D = coeficiente de difusión t = tiempo transcurrido </li><li> Durante los experimentos de quimiotaxis, garantizar para registrar el tiempo específico que el momento de quimioquinas fue añadido al sistema. Una vez detectado el movimiento de la migración celular, asegúrese de grabar la grabación de lapso de tiempo confocal, y tenga en cuenta la hora y lugar de la orilla donde se produjo la imagen. </li><li> Durante el análisis de datos, conecte el observado transcurrido el tiempo, la ubicación y el coeficiente de difusión para la célula específica en la ecuación para encontrar la concentración específico normalizado en cualquier punto dentro del colágeno tanto para la difusión y experimentos celulares. </li></ol> 6. Seguimiento de la migración de células Utilizando TFM <ol><li> Para el seguimiento de la migración de células usando técnicas de TFM / DVC siguen el protocolo a continuación: <ol><li> Después de la adición de la concentración deseada en quimioatrayente bien # 3, comience imágenes de las matrices de colágeno en 3D con un sistema confocal montado en un micr invertidaoscope para encontrar una celda para investigar. </li><li> Una vez que se encuentra una célula en movimiento, colocar la célula en el medio del campo de vista y utilizar un motor piezoeléctrico (a la imagen en el eje z), imagen cada 1 o 2 min. </li><li> Para el cálculo de generación de la fuerza y la deformación celular, generar un código computacional para encontrar los desplazamientos de los granos de fluorescencia siguiendo los protocolos TFM / DVC 31. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Los pasos más críticos para experimentos de difusión de éxito con o sin células son: establecer correctamente el conjunto de molde; el desarrollo de la destreza manual necesaria para evitar daños durante la extracción de cubreobjetos hidrófobos; asegurando que encontrar una muy buena línea de salida lineal para calcular correctamente el coeficiente de difusión; corregir los cálculos experimentales de colágeno y quimioatrayente; utilizar correctamente el sistema de imágenes de células vivas para asegurar la...

El movimiento preferido de las células hacia un gradiente de concentración, conocido como quimiotaxis, juega un papel importante en los procesos patológicos y fisiológicos en el cuerpo. Tales ejemplos son la piel y la mucosa cicatrización de la herida 1, 2 morfogénesis, la inflamación 3, y 4,5 el crecimiento del tumor. También se ha demostrado que las células cancerosas pueden migrar a través de ambas estrategias individuales y colectivas a la migración celular 6. Además, los mecanismos de inestabilidad difusionales pueden inducir la separación de células individuales o agrupados a partir de un cuerpo / objeto tumoral y luego puede emigrar hacia una fuente de nutrientes y por lo tanto invadir áreas 7 y tejidos más amplios. Además, se ha demostrado que diversos mecanismos de migración pueden ser activos en 2D y en 3D, debido a las diferentes funciones de las moléculas de adhesión 8. Por lo tanto, un movimiento para fisiológicamente relevante en ensayos in vitro para investigar la motilidad celular en un measureabley manera simple es de importancia en la comprensión de los fenómenos movimiento celular 9. Desafortunadamente, la dificultad en el análisis de la migración celular, un ensayo de quimiotaxis integral cuantificable por lo general requiere un método laborioso de largo, fundada en la medición de los modelos de la motilidad celular y los fenómenos de transporte imparciales. Enfoques experimentales anteriores para investigar la quimiotaxis de células incluyen la cámara de Boyden 10 y el que se ensaya agarosa 11. Sin embargo, dentro de estos primeros ensayos, los experimentos de migración celular no controlan el movimiento con respecto al tiempo. Más, importante, los gradientes de concentración utilizados para los experimentos fueron bien definidos o no completamente entendidas, mientras que sólo el mantenimiento de la señalización por no más de unas pocas horas. Por otra parte, los intentos de la cámara de quimiotaxis temprana restringen la migración de células de dos dimensiones y no permitieron una para supervisar la cinética de la migración 12. En cuanto a la cámara de Boyden, un ensayo de punto finalno permitiría al investigador para observar la migración visualmente y no podía diferenciar directamente quimiotaxis (movimiento direccional) de chemokinesis (movimiento aleatorio). Además, varias variables diferencias en el tamaño de poro y el grosor de las membranas hechos a la cámara muy difícil de reproducir fácilmente y ocultan la reacción migrante de las células a quimiocinas 13,14. Con la nueva comprensión de la microfluídica, nuevas cámaras y micro-dispositivos se han investigado como un instrumento para investigar la locomoción celular bajo condiciones de flujo intersticiales o quimiotaxis 15,16. Bajo estos nuevos dispositivos, nuevas métricas de células se introdujeron e investigados, como el efecto del esfuerzo cortante en un celular 17,18. Desafortunadamente, las cámaras de quimiotaxis de microfluidos pasadas y actuales limitan estudios de la migración de células a los sustratos-2D un retroceso importante ya que muchos procesos biológicos, incluyendo la invasión celular tumoral y la metástasis, y immigración celular inmune, implica la migración 3D. -Cámaras donde una solución quimioatrayente está en contacto con un gel que contiene células 3D también han sido reportados también observación directa 19,20. Estas cámaras tienen dos compartimentos, uno que contiene un quimioatrayente y uno que contiene células, se unió al lado de uno otro horizontalmente 21 o como anillos concéntricos 22. Estos sistemas se apuntaban en la dirección correcta, pero no mantienen un sistema de quimiotaxis por un período prolongado de tiempo. Además, los investigadores también han examinado la difusividad a través de membranas de colágeno en las células de diálisis, así como la difusión de moléculas trazadoras a través de muestras de colágeno sometido a la presión hidrostática 23-25. Algunos experimentos de difusión en geles de colágeno se basan en modificaciones físicas y químicas del gel utilizando campos magnéticos y la incorporación química 26. Un método popular para modelar difusividad en collatejidos indíge- se basa en la imagen de fluorescencia de fotoblanqueo punto continuo. Este método ha revelado anisotropía en los coeficientes de difusión de macromoléculas en tejidos de colágeno orientadas. Sin embargo, photobleaching se ha utilizado en el cartílago articular y no colágeno matrices. Aunque similares, los experimentos de modelización necesarias deben ser realizadas a través de la comprensión específicamente el coeficiente de difusión de los geles de colágeno. Más importante aún, los sistemas no utilizan un método para medir la generación de fuerza de la célula. Desafortunadamente, la mayoría de los sistemas parecen faltar uno o dos elementos clave para un sistema ideal: la que permite el seguimiento de la célula, una comprensión gradiente de difusión con un factor quimiotáctico través de la matriz, relativamente sencilla configuración con una facilidad de la reproducibilidad, la minimización de interacciones célula-célula, y la capacidad de medir unidades dimensionales para la cuantificación (es decir, velocidad, fuerza, concentración específica). Moghe et al. </em&gt; 27 propuso un sistema que cumple la mayoría de estos requisitos en el que las células se dispersan inicialmente en todo el gel en lugar de concentrados en la superficie del filtro, pero era difícil de medir las fuerzas que la célula genera. Para este propósito, se presenta un sistema de difusión de gradiente plana para investigar la quimiotaxis en una matriz de colágeno en 3D, lo que permite superar las limitaciones modernas cámara de difusión de los ensayos existentes, que se basa en la microscopía de lapso de tiempo, junto con las técnicas de análisis de imagen para medir celular fuerzas en un entorno 3D. Este protocolo proporciona una manera simple, pero innovadora de la creación de una cámara de difusión 3D simple que se puede utilizar para investigar la quimiotaxis 3D en diferentes células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td>
			<td>a two-part misture with a 10:1 mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>CMB for 18mm round coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22mm Glass Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0180281</td>
			<td>Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machined aluminum metal cube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hobby utility knife</td>
			<td>X-Acto</td>
			<td>X3201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(aminopropyl) trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>00216A-10</td>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Standard floor model and tabletop centrifuges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
			<td>Fine Point Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-518-105A</td>
			<td>Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Acetic acid ACS reagent, &#8805;99.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090</td>
			<td>Hexane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>anhydrous, 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-precision diamond scribing tool</td>
			<td>Lunzer</td>
			<td>PV-081-3</td>
			<td>Straight extended tip scribe, .020&#34; (.50mm) diameter by .200&#34; (5.0mm) tip length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>14-635-5C</td>
			<td>High-Vacuum Grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-500</td>
			<td>1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1N sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38215</td>
			<td>Sodium hydroxide concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-332</td>
			<td>Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;F-8813</td>
			<td>Carboxylate-modified microspheres, 0.5 &#181;m, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83689</td>
			<td>Rhodamine B for fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3d collagen matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

La capacidad de este ensayo para evaluar con precisión la migración de la célula depende de una buena configuración del sistema. Por lo tanto, es fundamental para el maquillaje asegúrese de diseñar el molde sistema de difusión precisa y tener mucho cuidado en la colocación de cubreobjetos tanto hidrofóbicos e hidrofílicos, como se ilustra en la Figura 1. Si el sistema está diseñado correctamente y durante la etapa de modelado asegurando la difusión de encontrar una muy buena línea de salid...

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Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K vistas.  California State University, Long Beach. Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Investigación

Bioingeniería

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

Un método para la determinación y simulación de permeabilidad y difusión en un modelo de tejido 3D en una membrana Introduzca el sistema de placas de varios pocillos

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.