This work was supported by NIH grants (NS070577 and NS084869).

ملاحظة: تكوين جميع الحلول المذكورة أدناه يمكن العثور عليها في جدول المواد / المعدات. 1. البروتين عمود جسم تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن بروتين A عمود الدوران وجميع المخازن المطلوبة لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل البدء في إجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الدم المناعي 1: 1 مع بروتين A مفتش الاحتياطي ملزم. (5 مل من الدم ويوصى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف استفادة من البروتين وعمود الدوران على رأس مقاعد البدلاء لطرد أي راتنج التي قد تكون عالقة في الحد الأقصى. إزالة الغطاء العلوي وبرفق قبالة إغلاق أسفل. وضع عمود في أنبوب جمع 15 مل والسماح حلول التخزين لاستنزاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من البروتين A مفتش الاحتياطي ملزم والسماح للحل لاستنزاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق المصل المناعي المخفف إلى العمود وجمع من خلال تدفق. للحصول على أفضل النتائج، إضافة حجم العينة التي تحتوي على تركيز الأجسام المضادة تقل عن 80٪ من الأجسام المضادة ملزم capacit العمودذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود مع 15 مل من البروتين A مفتش الاحتياطي ملزم أو حتى الامتصاصية في 280 نانومتر هو أقل من 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من تحييد مؤقت لخمسة أنابيب جمع المسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من مفتش شطف العازلة للبروتين عمود وجمع 1 مل الكسور في كل من الأنابيب التي تحتوي على 100 ميكرولتر من تحييد العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية من كل جزء في 280 نانومتر كسور وتجمع مع الامتصاصية أكبر من 0.5. الحفاظ على الكسور المجمعة على الجليد لتصبح جاهزة للغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجديد العمود بإضافة 8 مل من مفتش الاحتياطي شطف والسماح للحل لتتدفق من خلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العمود مع البروتين A مفتش حل ملزم حتى يعود شاطف الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين العمود عن طريق إضافة 5 مل من محلول التخزين (0.02٪ أزيد الصوديوم في PBS). عندما تبقى حوالي 3 مل في العمود، أسفل الغطاء وتأمين الغطاء العلوي. تخزين العمود في 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد طول سو أنابيب غسيل الكلى حاجة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. باستخدام 16 مم شقة أنابيب استخدام 5.47 سم من طول الأنبوب الواحد مل من محلول أن مدال. قطع الأنابيب وشطف مع PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة 15 إلى 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضعاف ومشبك واحدة من نهاية الأنبوب غسيل الكلى، ونقل مفتش المجمعة التي تحتوي على كسور لغسيل الكلى أنابيب معايرتها في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة وإغلاق الطرف الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze في درجة حرارة الغرفة ضد 200 مجلدا من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير العازلة غسيل الكلى (الطازجة PBS درجة الحموضة 7.4) وdialyze للساعة 2 آخر في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير العازلة غسيل الكلى (الطازجة PBS درجة الحموضة 7.4) وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على حل الضد مدال في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للشروع في اتخاذ مزيد من الخطوات لتنقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم تركيز الأجسام المضادة باستخدام الامتصاصية له عند 280 نانومتر، ومعامل الامتصاص المولي من الأجسام المضادة في 280 نيوتن متر من 210000 M -1 سم -1 12. </li></ol> 2. اقتران من الائتلاف الحزبي البروتينات إلى AminoLink اقتران الراتنج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عمودين، واحدة للNor1 والآخر للNur77. اتبع نفس البروتوكول لكل من البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد البروتين إلى أن يقترن إلى الراتنج على الجليد. تحديد تركيز البروتين باستخدام لها معامل الانقراض المولي والامتصاصية لها عند 280 نانومتر 12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، استخدم فحص تقرير البروتين مثل فحص الحمض bicinchoninic 13. إذا تم حل البروتين في تبادل المحتوية على أمين المخزن dialyze أو رادع ضد العازلة اقتران. إذا كان البروتين هو في منطقة عازلة مناسبة (لا الأمينات الحرة) تمييع 4 أضعاف في اقتران العازلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 2 مل من الراتنج ل2 ملغ من البروتين. جميع الخطوات التي تتبع هي لراتنج 2 مل في العمود 10 مل. ما يصل إلى 10 ملغ من البروتين يمكن أن تكون مرتبطة لكل 1 مل من الراتنج (2 مل 1: 1 الطين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد العمود 10 مل عن طريق دفع فريت الى الاسفل، وتشغيل PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 من خلال ذلك. كاب ركان الجزء السفلي من العمود وإضافة 2 مل من اقتران العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم المطلوب من الطين (4 مل من الحصول على 2 مل من الراتنج) إلى العمود، وإزالة الغطاء السفلي والسماح للاستنزاف العمود. شطف العمود مع ما مجموعه 6 مل (حجم 3 الراتنج سرير) من اقتران العازلة والسماح العمود إلى استنزاف. بعد أن استنزفت المخزن المؤقت اقتران، استبدال الغطاء السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2-4 مل من البروتين معلقة في مخزن توصيلات إلى العمود (الحفاظ على قسامة من الحل البروتين لتقييم كفاءة اقتران بمقارنة تركيز البروتين من شطافة في الخطوة 2.11 باستخدام إما الامتصاصية في 280 نانومتر أو مقايسة bicinchoninic) . سقف وتخلط نهاية على نهاية لدينا حل متجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن فارغة 1.8 مل أنبوب microcentrifuge والانتقال إلى غطاء الدخان. نقل بعناية NaCNBH 3 (حوالي 0.05 غ) في أنبوب وزنه قبل. إغلاق الأنبوب وتزن الأنبوب الذي يحتوي NaCNBH 3. لا تقم بفتح أنبوب خارج غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء على وزنNaCNBH 3 نقل في أنبوب، وجعل 5 M حل عن طريق إضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم. الوزن الجزيئي للNaCNBH 3 هو بالتالي 62.84 ز ز 0.05 يساوي (0.05 / 62.84 = 7.96 × 10 -4 الشامات) 7.96 × 10 -4 الشامات. لجعل 5 M حل الاعلان (7.96 × 10 -4/5) 159 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس إجمالي حجم رد الفعل وأخذ حجم الراتنج بعين الاعتبار. إضافة 10 ميكرولتر من 5 M NaCNBH 3 في مل من رد الفعل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبيل المثال: لحجم رد الفعل 4 مل إضافة 40 ميكرولتر من 5 M NaCNBH 3. ل1 مل من الراتنج و 3 مل من البروتين وأضاف، أن إجمالي حجم هو 4 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتويج العمود وتخلط نهاية على نهاية. تأمين عمود على محور دوار أنبوب وترك يستمر التفاعل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الصباح، وجلب العمود إلى غطاء الكيميائية وبعناية إزالة الغطاء عن بعض الغاز قد شكلت. استنزاف العمود في أنبوب نظيفة وحفظ شطافة لقياس البروتين يخدعوحدانية التركيز باستخدام الامتصاصية في 280 نانومتر طريقة 12 أو فحص الحمض bicinchoninic ومقارنتها مع تركيز البروتين بدء في الخطوة 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج مع 4 مل من اقتران العازلة والسماح للاستنزاف العمود. </li></ol> 3. حجب المواقع المتبقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج مع 4 مل من التبريد العازلة. استنزاف واستبدال الغطاء السفلي. إضافة 2 مل من التبريد العازلة ووقف الراتنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم إجمالي حجم رد الفعل من خلال قياس حجم الراتنج وحجم العازلة التبريد ثم إضافة 10 ميكرولتر من 5 M NaCNBH 3 في مل من حجم رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة نهاية الإفراط في نهاية المطاف. بعد 30 دقيقة، وجلب العمود في غطاء الدخان. إزالة بعناية الاعلى و من ثم إزالة الغطاء السفلي والسماح للاستنزاف عمود في أنبوب النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل العمود مع 5 مجلدات الراتنج من غسل الحل. مراقبة يغسل عن وجود البروتينات المتبقية عن طريق قياس abso شطافة لrbance في 280 نانومتر. يتم غسلها البروتينات وفكت بها تركيز عال الملح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج مع 6 مل من نزع الغاز PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 يحتوي على 0.02٪ أزيد الصوديوم. الحفاظ على العمود في 4 ° C لحين الحاجة إليها. </li></ol> 4. تنقية Nurr1 الاجسام المضادة المحددة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جانب العمود Nur77 الائتلاف الحزبي مع 10 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، والسماح للاستنزاف العمود. سقف الجزء السفلي من العمود ووضع Nur77 الائتلاف الحزبي العمود جانب ينضب في جديد 15 مل أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من البروتين وتنقية الأجسام المضادة لمكافحة Nurr1، وكأب العمود ومكان على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تنزع الأغطية العلوية والسفلية وجمع التدفق من خلال. توضع جانبا على الجليد حتى جاهزة للإضافة إلى العمود جانب Nor1 الائتلاف الحزبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف جانب العمود Nor1 الائتلاف الحزبي مع 10 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، والسماح للاستنزاف العمود. سقف الجزء السفلي من العمود ووضع Nor1 الائتلاف الحزبي العمود جانب في أنبوب جمع 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تدفق من خلال من الانقلاب Nur77 الائتلاف الحزبيالعمود أدى، وكأب العمود ومكان على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تنزع الأغطية العلوية والسفلية وجمع التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الأجسام المضادة عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر. </li></ol> التحليل الذي يعتمد ELISA 5. من تنقية مكافحة Nurr1 جسم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من البروتين (2،5 ميكروغرام / مل) إلى الآبار من 96 لوحة جيدا. إذا اختبار 3 البروتينات المختلفة، إضافة 100 ميكرولتر من البروتين 1 إلى الآبار A1 إلى H4، 100 ميكرولتر من البروتين 2، لآبار A5 إلى H8 و 100 ميكرولتر من البروتين 3 إلى الآبار A9 إلى H12. تغطية لوحة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار المغلفة مرتين مع 300 ميكرولتر لكل بئر من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وإضافة 300 ميكرولتر من ELISA عازلة عرقلة للمستضد كامل الآبار المغلفة واحتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن لوحة يتم حظر إعداد التخفيف بدءا المطلوب من تنقية مكافحة Nurr1 الأجسام المضادة (تتراوح بين 10 و 100 ميكروغرام / مل) في ELISA عازلة حظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة من حظر، استبدال كتلة عازلة ELISA مع 100 ميكرولتر من الطازجة كتلة عازلة ELISA لجميع الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من المخفف تنقية مكافحة Nurr1 أجسام مضادة لجميع الآبار في الصف A. مخفف تسلسليا الأجسام المضادة عن طريق نقل 100 ميكرولتر من محلول من الصف ألف من الآبار في الصف B يليه نقل 100 ميكرولتر من محلول من صف إلى صف B C مواصلة السير إلى صف G. بعد خلط الحلول في الآبار في الصف G تجاهل الإضافية 100 ميكرولتر. الآبار في الصف H يحصلون إلا على 100 ميكرولتر الأولية من عرقلة العازلة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة ثلاث (3) مرات مع 300 ميكرولتر لكل بئر من توين 20 بنسبة 0.05٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وصمة عار لوحة لإزالة غسل العازلة الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الفجل البيروكسيد (HRP) مترافق الماعز مفتش المضادة للأرنب الواحد في ELISA كتلة عازلة (1: 8000 تخفيف، ومدى محدد من 1: 5000 إلى 1: 25000). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل عشر لوحةري (3) مرات كما هو موضح في 5.6. شطف جميع الآبار عن طريق ملء لهم مع 300 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. وصمة عار الماء الزائد عن طريق لوحة للقلب على امتصاص الورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 3، 3، 5، 5 &#39;tetramethylbenzidine (تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة) لجميع الآبار واحتضان 15-30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد الفعل من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 2 NH 2 SO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الامتصاصية في 450 نانومتر طرح الخلفية في 650 نانومتر. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation.">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li><li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor,+NURR1.">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice.">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li><li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons.">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li><li>Decressac, M., Volakakis, N., Bj&#246;rklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential.">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li><li>Pe&#241;a de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3/nurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning.">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li><li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB:CBP-dependent+transcriptional+activation.">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li><li>Col&#243;n-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus:+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory.">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li><li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation.">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li><li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors.">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li><li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity.">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li><li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data.">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Zetterstr&#246;m, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system.">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li><li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+(NGFI-B)+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization.">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نجاح هذا البروتوكول يعتمد على توافر البروتينات النقية لتوصيف الأجسام المضادة التي أثيرت ضد عضو محدد من عائلة البروتينات المثيرة للاهتمام. ليست هناك حاجة لتنقية الأجسام المضادة باستخدام بروتين A / G حتى ثبت بوضوح أن هناك نشاطية عبر الكبيرة التي ELISA والنشاف الغربي. <p ...

عامل النسخ Nurr1 وhomologs لها (Nur77 وNor1) تنتمي إلى فصيلة 4A مستقبلات النووي (NR4A) 1. بل هي أيضا مستقبلات اليتيمة لأنه لم يتم التعرف على بروابط الذاتية حتى الآن. تم استنساخ Nurr1 لأول مرة في عام 1992، وعلى الرغم من أن المعروف أن أعرب في الدماغ 2، تم الكشف عن دورها الأساسي للتنمية وصيانة الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​من الدراسات الماوس خروج المغلوب 3. بالإضافة إلى ذلك، دورها المهم في الحفاظ على الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​وقد تجلى مؤخرا دراسة خروج المغلوب الشرطية 4. ونتيجة لهذه الدراسات أنيقة تظهر الأدوار Nurr1 الحاسمة لالخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط، وركزت العديد من الدراسات اللاحقة إلى حد كبير على الخلايا العصبية الدوبامين والمرتبطة الدوبامين اضطراب الاعصاب الدماغ المتوسط، ومرض باركنسون (PD) 5. والجدير بالذكر، وأعرب عن Nurr1 ليس فقط في الدماغ المتوسط ​​الدوبامين (MDA) الخلايا العصبية، ولكن أيضا في ديمناطق الدماغ الآية 2، مما يشير إلى أنه قد يكون الأدوار الوظيفية في كثير من المجالات غير DA، الذي يحظى بدعم قوي من الدراسات الحديثة تبين أن Nurr1 يلعب دورا هاما في وظائف المخ المختلفة. فعلى سبيل المثال، تبين أن الأنشطة يحفز الذاكرة مثل التعلم، أو غيرها من المهام التابعة الحصين، يؤدي إلى ما يصل تنظيم Nurr1 التعبير في الحصين 6،7. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من Nurr1 التعبير في قرن آمون كانت كافية ليضعف الذاكرة على المدى الطويل و / أو اللدونة متشابك 11/08، مما يوحي بقوة بأن Nurr1 تلعب أدوارا متنوعة في العديد من مناطق الدماغ. وبالتالي، إلى زيادة فهم التعبير خلية من نوع معين والتحت خلوية من Nurr1، فمن المستحسن استخدام الأجسام المضادة Nurr1 محددة، الذي لا يحمل أي-التفاعل عبر لhomologs لها Nur77 أو Nor1. وتصف هذه الورقة بروتوكول قبل الامتزاز لتوليد الأجسام المضادة Nurr1 محددة وبيانات إضافية الحالية تظهر خصوصيته.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Column Storage solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AminoLink Coupling Resin and Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A spin column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330&#956;L</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-675-69</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk Diluent/ Blocking Concentrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-82-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Elution Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15567-&#173;&#8208;027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;, 5, 5&#39; Tetramethylbenzydine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N H2SO4</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>H381 05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A IgG Binding Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Elution Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M Tris-&#173;&#8208;HCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Storage solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>29924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AminoLink Coupling Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quenching buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 
			7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M NaCl, 0.05% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes: 10 &#956;l; 20 &#956;l; 200 &#956;l; 1000 &#956;l</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of nurr-1 specific polyclonal antibodies free of cross-reactivity against its close homologs, nor1 and nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1 or NR4A2) plays a key role in the maintenance of the dopaminergic system. Dopamine dysfunctions associated with the Nurr1 gene include Parkinson&#8217;s disease, schizophrenia and manic depression among others. Furthermore, recent evidence indicates that Nurr1 is also expressed in other brain areas such as the hippocampus and plays critical roles for learning and memory. The other members of the family are nerve growth factor IB (Nur77 or NR4A1) and neuron-derived orphan receptor 1 (NOR1 or NR4A3). To help investigate the precise functional roles of Nurr1 in dopaminergic and other brain region-related neuronal dysfunctions antibodies devoid of cross-reactivities against Nur77 and NOR1 were needed. Since the proteins are more divergent in their LBDs than in their DNA binding domains immunization with purified LBDs should yield antibodies specific for Nurr1 with minimal reactivities against Nur77 and/or NOR1. Although anti-Nurr1 antibodies were successfully generated these showed significant immunoreactivity against the other members of the family. Affinity chromatography over immobilized Protein A followed by pre-adsorption against immobilized Nur77 and NOR1 LBDs yielded Nurr1 specific antibodies free of cross-reactivity. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption. The goal of the protocol is to increase polyclonal antibodies specificity through pre-adsorption against cross-reactive antigens.

مقارنة بين البروتين عمود تنقية الأجسام المضادة Nurr1 محددة مع البروتين المنقى أضداد Nurr1 تليها المرور عبر Nur77 الائتلاف الحزبي والأعمدة Nor1 الائتلاف الحزبي هو مبين في الشكل 1. كما يمكن أن يرى، البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة أظهرت ملزم قوية لNurr1 الائتلاف الحز...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77 at JoVE.com

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

إنتاج Nurr-1 بولكلونل محددة الأجسام المضادة الحرة عبر التفاعل مقابل نظرائه Homologs إغلاق Nor1 وNur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K Views.  McLean Hospital. Here, we selectively target antibodies against a specific member of a highly conserved family of proteins by immunizing animals with their most divergent regions followed by removing cross reactive antibodies by pre-adsorption.

Video: Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

مبادئ في مواقع محددة التكنولوجيا (SSR) Recombinase

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Operant Learning of Drosophila at the Torque Meter

For experiments at the torque meter, flies are kept on standard fly medium at 25&deg;C and 60% humidity with a 12hr light/12hr dark regime. A standardized breeding regime assures proper larval density and age-matched cohorts. Cold-anesthetized flies are glued with head and thorax to a triangle-shaped hook the day before the experiment. Attached to the torque meter via a clamp, the fly's intended flight maneuvers are measured as the angular momentum around its vertical body axis. The fly is placed in the center of a cylindrical panorama to accomplish stationary flight. An analog to digital converter card feeds the yaw torque signal into a computer which stores the trace for later analysis. The computer also controls a variety of stimuli which can be brought under the fly's control by closing the feedback loop between these stimuli and the yaw torque trace. Punishment is achieved by applying heat from an adjustable infrared laser.

Measuring the yaw torque of tethered Drosophila with the torque meter allows the neuroscientist exquisite control of the stimulus situation of the experimental animal. Together with the unique genetic tools available in the fruit fly, this paradigm is used for a wide variety of neurobiological research.

استثابي التعلم من ذبابة الفاكهة في عداد عزم الدوران

For experiments at the torque meter, flies are kept on standard fly medium at 25&deg;C and 60% humidity with a 12hr light/12hr dark regime. A standardized ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

الكالسيوم في الجسم الحي 2 + -- التصوير من الخلايا العصبية بالجسم فطر خلال التعلم الشم في عسل النحل

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

تصميم وتحليل سلوك تفضيل درجة الحرارة وإيقاعها Circadian في Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

التأسيس-بقايا محددة من Noncanonical الأحماض الأمينية في البروتينات نموذج باستخدام<em&gt; كولاي</em&gt; نظام النسخ، ترجمة خالية من خلية

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

استخدام الأجسام المضادة-والرمات-جيردين لتصور الخلايا خصل المعوية في الماوس التعويم الحر صائم كريوسيكشنز

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

البكتيريا الزراعية-بوساطة التحول الجيني، وإنتاج تحويل الجينات، وتطبيقها لدراسة التنمية الإنجابية للذكور في الأرز

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

طريقة بسيطة للقطع الجاف للحصول على قسم الراتنج الكامل الحجم للبذر وتطبيقاته

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, most are quite expensive to buy and/or require special equipment and finely honed expertise to produce effectively. This protocol describes a method to produce bacterial cell-free lysate that supports high levels of gene expression, using only standard laboratory equipment and requiring minimal processing. The method uses an Escherichia coli strain producing an endolysin that does not affect growth, but which efficiently lyses a harvested cell pellet following a simple freeze-thaw cycle. The only further processing required is a brief incubation followed by centrifugation to clear the autolysate of cellular debris. Dynamic gene circuits can be achieved through heterologous expression of the ClpX protease in the cells before harvesting. An E. coli strain lacking the lacZ gene can be used for high-sensitivity, cell-free biosensing applications using a colorimetric or fluorescent readout. The entire protocol requires as few as 8-9 hours, with only 1-2 hours of hands-on labor from inoculation to completion. By reducing the cost and time to obtain cell-free lysate, this method should increase the affordability of cell-free gene expression for various applications.

This protocol describes a rapid and simple method to produce bacterial lysate for cell-free gene expression, using an engineered strain of Escherichia coli and requiring only standard laboratory equipment.

إنتاج سريع وبأسعار معقولة وغير معقد من ليسات خالية من الخلايا البكتيرية

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...