تُعرف الأجسام المضادة أحادية النسيلة بالأجسام المضادة أحادية التحديد التي تنتج من استنساخ واحد من الخلايا الليمفاوية B والأجسام المضادة أحادية التكافؤ التي ترتبط بنفس النوبة. في الآونة الأخيرة، أصبحت ELISA أحادية النسيلة القائمة على الأجسام المضادة منصتنا الناشئة للتحليل النوعي أو الكمي للأغذية أو المنتجات الطبيعية. هذا الأسلوب هو أسلوب دقيق وحساسة وفعالة دون خطوات المعالجة المسبقة المملة.
لذلك هذا هو ضروري للعينات البيولوجية والتطبيقات السريرية في المستقبل. يعد إعداد mABs من TCM خطوة حيوية في الدراسات حول خصائص النظام المعقدة لصيغة TCM. لقد قمنا بتطوير بروتوكول لتوليد ماب ضد المركبات الجزيئية الصغيرة ، بما في ذلك تخليق المستضد الاصطناعي ، وتحصين الماوس ، والانصهار الخلية.
ويرتبط هابتن مع البروتين الناقل لتجميع المستضد الاصطناعي. يتم خلط مستضد اصطناعي وكامل المواد المساعدة ومستحلب. تم تحصين الفأر عن طريق الحقن تحت الجلد.
أخرج طحال الفأر المحصن وجعل تعليق وحيد الخلية. اخلطي خلايا المايلوما. يتم عزل الطحالات وصهرها مع خط خلية المايلوما الماوس الحساسة HAT بواسطة طريقة PEG.
حدد خط خلية قادر على إعداد الأجسام المضادة بواسطة ELISA. يتم استنساخ الهجينة إفراز الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي هي رد الفعل إلى المستضد. إنشاء خط خلية التهين هو cryopreserved.
تم استخدام إجراء أكسدة االفترة تخليق من الخارج BSA ناريجين. أولا، تم حل ناريجين في تركيز نهائي من مليغرام واحد لكل ملليلتر في 100 ميكرولترات من محلول باريودات الصوديوم الطازجة إلى خمسة ملليلتر من محلول ناريجين. يُحرّك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
ثانيا، إضافة ملليلترين من البروتين الناقل لخليط التفاعل بين الصوديوم narigin. ضبط الخليط إلى درجة اله PH تسعة الحل والاستمرار في الرد لمدة ست إلى ثماني ساعات. ثالثا، تم تنقية المستضد الاصطناعي مع طريقة غسيل الكلى في PDS لمدة ثلاثة أيام لابعاد CBS.
تم استخدام مساعد فرويند الكامل وغير المكتمل للتحصين بالماوس. للتطعيم، اخلط 50 ميكروغرام من المترافق مع حجم متساو من مساعد فرويند الكامل و مستحلب تماما. administrate 100 ميكروغرام من هذا الخليط لكل الماوس BALB / ج عن طريق حقن تحت الجلد الظهرية.
تقديم التطعيم الداعم عن طريق الحقن تحت الجلد بعد أسبوعين مع نفس الكمية من اقتران مختلطة مع مساعد غير مكتملة. للتحصين الأولي، تم استخدام مساعد ومناعة من فرويند عن طريق الحقن تحت الجلد. للتحصين المعزز، تم استخدام مساعد فرويند غير المكتمل والمناعة عن طريق الحقن تحت الجلد.
للتحصين من دون تأثير مساعد، تم استخدام مناعة فقط عن طريق الحقن تحت الجلد أو الحقن داخل الجلد. خلايا طبقة التغذية نشأت أساسا من الخلايا الظهارية البطن أو الضامة. تم استخدام RPMI 1640 FBS و HAT لإعداد شاشة هات المتوسطة.
تم حل هات الملحق في 10 ملليلترات 10 10 ملليمترات 10 10 مللي في 10 1000000 100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 و ماوس الـ(آي آر آر) تم تعقيمه بـ 75٪ كحول الإيثيل لمدة خمس دقائق بعد إزالة الفراء من البطن مع ملقط hemostatic، وتطهير المنطقة مع 75٪الإيثانول.
قطع الجلد الخارجي لفضح تجويف البطن. حقن ثلاثة ملليلترات من 1640 معقم في البطن. ثم تدليك البطن لفصل خلايا إضافية في الحل.
استلهم تعليق خلية الجنين إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. بعد الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 10 دقائق في 1, 000g, تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا الجنينية للحصول على تعليق خلية واحدة. بعد هذا الإجراء، قم بإذابة الخلايا باستخدام وسط HAT.
عد الخلايا لجعله 100,000 لكل ملليلتر من أعضاء الخلية. نقل الخلايا إلى 96 جيدا لوحة ثقافة الخلية. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تم تعقيم الفأر المحصن المختار بنسبة 75٪ من الكحول الإيثيلي لمدة خمس دقائق. التعرق 1640 متوسطة مثل الغسيل العازلة. إزالة الجلد والأنسجة العضلية باستخدام مقص لفضح الطحال.
عزل الطحال من قبل ملاقط بعناية. ثم غسل الطحال في 1640 RPMI. عزل الطحال وقطع إلى قطع.
ببطء الجنيه الطحال. ثم تم التعامل مع RMPI 1640 المتوسطة إلى حل الخلايا لإعداد تعليق خلية الطحال. بعد ذلك، تمت تصفية الخلايا من قبل 800 مصفاة خلية شبكة.
مسمار الطحال بعناية لإزالة الأنسجة الكبيرة. تجنب الأنسجة الكبيرة تؤثر على الانصهار من الخلايا. كان تعليق خلية الطحال مع 1640 1640 متوسطة.
ثم تم إضافة تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي. حصاد خلايا الطحال عن طريق الطرد المركزي في 1، 000g لمدة 10 دقائق. ثم تجاهل المُندفع.
كان من المفترض أن تكون خلايا الطحال في ما بين مليار إلى 10 مليارات. إزالة المزروعة وتضخيم خلايا المايلوما من الحاضنة وتهز بلطف قارورة للحصول على تعليق الخلية. كان التعليق مع RPMI مرتين.
اخلطي تعليق خلايا الطحال وخلايا الورم النخاعي. عد الخلايا وضبط التركيز. وينبغي أن تكون الحصة الأخيرة من خلايا الطحال إلى خلايا المايلوما من واحد إلى خمسة إلى واحد إلى 10.
الطرد المركزي خليط الخلية ثم إزالة فائقة. إضافة ملليلتر واحد من 50٪ البولي اثيلين محلول جلايكول للخلايا ويحرك بلطف في 37 درجة لمدة دقيقة واحدة. يقف لمدة 30 ثانية، إضافة ملليلتر اثنين من 1640 1640 متوسطة و 1640 حضن في 37 درجة لمدة دقيقتين لإنهاء التفاعل.
إضافة إلى اثنين ملليلتر RPMI لمدة دقيقة واحدة أخرى. ثم، إضافة إلى 10 ملليلترات RPMI 1640. جهاز طرد مركزي في 800g لمدة 10 دقائق.
التخلص من المابير، إضافة حل HAT والاستمرار في زراعة الخلايا لمدة سبعة أيام في 37 درجة 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد سبعة أيام، تم شتيئة سراويل الخلايا في 96 لوحة بئر بعد الانصهار الخلية وأضاف إلى لوحات ELISA المغلفة مسبقا مع مستضد الطلاء. يزرع في 37 درجة لمدة ساعة واحدة، وأضاف الأجسام المضادة الثانوية وزرعت لمدة نصف ساعة.
بعد إضافة 100 ميكرولترات من محلول الركيزة. أوقف رد الفعل إلى لوحات ELISA في قارئ microplate، تم استخدام طريقة نقطة النهاية قراءة البيانات في 450 نانومتر.
امتصاص قياس في 450 نانومتر وشاشة التهجينية الإيجابية. استخدم طريقة التخفيف الحدية لإعداد الأورام الهجينة أحادية النسيلة. بعد إزالة الوسيلة عالية الدقة من التهجين المحدد، أعد تعليق الخلايا في RPMI 1640 ثم عدها.
تمييع الخلايا من تركيز خلية واحدة، وخليتين، وأربع خلايا في بئر من قبل RPMI 1640 في لوحة 96 جيدا والثقافة. نقل الخلايا من التهجين التي هي إيجابية إلى 24 لوحات جيدا، 25 و 75 قارورة سنتيمتر مربع للزراعة. تخزين myodomas في مربع التبريد التدرج في ناقص 80 درجة لمدة 24 ساعة.
ثم نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. تم تحديد تتر من مضادات الضد من قبل ELISA غير المباشرة. تم تحصين الفأرة من خلال أربعة مع narigin BSA conjugate كان أعلى بكثير من الماوس التحكم دون تحصين.
التكّر من واحد إلى 5, 000 انتشار كاف. وقد أكد تحليل MALDI-TOF الوزن الجزيئي للمكون الهابتن. كما هو مبين في الشكل الثاني، كما كان من المعروف الوزن الجزيئي للمعايير BSA وnarigin، يمكننا حساب وتحديد أن جزيئات من ناريجين كانت مترافقة مع BSA.
فقط يمكن أن تستمر الورم الهجين وتنمو في وسائل الإعلام اختيار HAT. بعد سبعة أيام من النمو، يمكن اختبار ثقافة الخلية من قبل ELISA. تم إعادة استنساخ و توسيع الوما الهجينة الإيجابية.
هذه الصور تظهر النتيجة التقليدية لخطوط خلايا هجينة أحادية النسيلة والبوليكلونال ثابتة. النقطة الحرجة من هذه التجربة هي فحص mAbs محددة للهابتن، ولكن ليس البروتين الناقل. ثم تم فحص خصوصية ماب في وجود مركبات أخرى ذات صلة هيكليا.
تم حساب التفاعل عبر لتقييم خصوصية mAb إلى المستضد. تم الحصول على منحنى المعايرة من نارينجين ومجموعة بطانة. تم توسيع الوما الهجينة أحادية النسيلة الخاصة بالمستضد وتم تقديمها في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، وآمل أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد المركبات الجزيئية الصغيرة. هذا كل شيء شكراً على مشاهدتك وحظاً طيباً لتجاربك.
