We thank the laboratory of Dr. Stephen Moss for providing embryonic rat brain tissues. M.D.T. designed the original protocol. This work was funded by National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. was supported with Postdoctoral Fellowship from German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

פרוטוקול בידוד רקמת המוח אושר על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית אוניברסיטת טאפטס הטיפול ושימוש ועומד במכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת השימוש B2011-45). 1. משי פיגום הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון משי מפקעות טוואי משי כפי שתוארה לעיל 19,20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל גולם לתוך 8 חתיכות שווים באמצעות מספריים. השתמש בכ -11 פקעות ל5 גרם של פקעות מקוטעות. (15 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 ליטר של 0.02 M Na 2 CO 3 פתרון ולהביא אותו לרתיחה תוך שימוש בצלחת חמה. (15 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 5 גרם של פקעות מקוטעות ולהרתיח אותם בNa 2 CO 3 פתרון למשך 30 דקות. מערבבים את המשי הרותח כל כמה דקות עם מרית. צעד זה, הנקרא גם דה-קאמינג, מטהר fibroin משי מחלבונים, sericins הידרופילי. (30 דקות) </li><li&gt; סחטו את fibroin ביד ולשטוף אותו במים מזוקקים לפחות שלוש פעמים כדי לשטוף את כל sericin וכימיקלים שנותר. (5 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את fibroin הרטוב בצלחת פטרי ולייבש את תמצית fibroin בO זרימת מכסה המנוע / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לשקול את מסת fibroin היבשה ומניח fibroin בכוס זכוכית. (15 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לפזר את fibroin בפתרון 9.3 M LiBr, לחשב את הנפח הנדרש (במ&quot;ל) של LiBr על ידי הכפלת המסה של fibroin היבש על ידי 4. יוצקים לאט פתרון LiBr על fibroin המשי ולטבול את כל סיבי fibroin באמצעות מרית. מכסה את הכוס כדי למנוע אידוי ומניח אותו על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לסיבים לפזר. (15 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במזרק, לאסוף את פתרון fibroin מהכוס ולטעון אותו לתוך קלטות הדיאליזה MWCO 3500. לבצע דיאליזה נגד מים מזוקקים למשך 48 שעות. להחליף את המים כל כמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במזרק, לאסוף את פתרון fibroin מהקלטות לצינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות חרוטי פעמיים ב9,000 סל&quot;ד (~ 12,700 XG) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. יוצקים את supernatant לתוך צינור טרי אחרי כל צעד צנטריפוגה וזורקים את הכדור. (40 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של fibroin ידי אומדן המשקל היבש. יוצקים 1 מיליליטר של תמיסת משי לתוך סירה לשקול. ייבש את המדגם בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לשקול את fibroin המשי היבש ולחשב את הריכוז של פתרון fibroin משי על ידי הכפלת המשקל שהושג על ידי 100. הריכוז הצפוי של פתרון משי הוא 6-9% (w / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוז המשי עד 6% (w / v) על ידי דילולו במים מזוקקים. נקודת עצירה: fibroin המשי הנוזלי יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש בכלי סגור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פיגומים נקבוביים מפתרון משי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננת NaCl גרגירים להפריד את הגרגרים בגודל 500-600 מיקרומטר, אשר ישמש בשלבים מאוחר יותר. מחק את גרגירשל הגודל להלן 500 מיקרומטר ומעל 600 מיקרומטר. (15 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 30 מיליליטר של 6% פתרון משי לתוך תבנית polytetrafluoroethylene (PTFE) (איור 1). בעדינות לפזר 60 גרם של NaCl הסתנן על המשי. הקש המכל להשיג שכבה אחידה של מלח. דגירה 48 שעות ב RT לפלמר המשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבנית PTFE המכיל פיגום בתנור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לסיים את פילמור ולהתאדות כל נוזל שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התוכן של עובש PTFE בכוס המכילה 2 ליטר של מים מזוקקים למשך 48 שעות לסנן את המלח. להחליף את המים 2-3 פעמים ביום. הסר את פיגומי ספוג מהתבניות כאשר מלח דלף החוצה לחלוטין עצירת נקודה:. ניתן לאחסן ספוגים שקועים במים ב 4 מעלות צלזיוס במכל סגור כדי למנוע את הפיגומים מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן, לחתוך את הפיגומים עם ביופסית קוטר 5 מ&quot;מ. לחתוך מראש הפיגומים להגיע לכ 2 מ&quot;מ הגובה. פוNCH ​​את מרכז הפיגום עם אגרוף 2 מ&quot;מ ביופסית קוטר (איור 2 א). (1 שעה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי הפיגומים שקועים במים לעקרם (מחזור רטוב, 121 ° C, 20 דקות) עצירת נקודה:. ניתן לאחסן ספוגים שקועים במים ב 4 מעלות צלזיוס במכל סגור כדי למנוע את הפיגומים מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני זריעת התאים המתוכננת, לטבול את הפיגומים ב0.1 מ&quot;ג פתרון סטרילי / פולי-D ליזין מיליליטר (PDL). דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הפיגומים 3x עם מי מלח פוספט (PBS) כדי להסיר PDL-מחויב שאינו. (30 דקות) </li></ol></li></ol> 2. בידוד של עכברוש נוירונים קליפתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הקורטקס מיום עוברי 18 חולדות (E18) Sprague-Dawley כפי שתואר בעבר על ידי פצ&#39;יפיצ&#39;י ו -27 Peruzzi לאחר פרוטוקול בעלי חיים אושר מתקבל. (2 שעות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10 הקורטקס ב 5 מיליליטר של טריפסין 0.25% עם DNase 0.3% אני (מלבלב שור) במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין ידי הוספת נפח שווה 1 מ&quot;ג / מיליליטר של חלבון סויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate הקורטקס באמצעות 10 מיליליטר פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה 20 פעמים עד השעיה תא בודדה נוצרה. להיות עדין ולמנוע היווצרות בועת אוויר. (10 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב 127 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (בינוני Neurobasal, תוסף B27 1x, 1x Glutamax, 1% פניצילין / סטרפטומיצין). מחדש להשעות את התא גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום התרבות ספירת התאים. ריכוז התא הצפוי הוא כ 2x10 7 מיליליטר /. (20 דקות) </li></ol> 3. לבנות הרכבה ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעת פיגום עם תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הפיגומים סטריליים וכל כלים הנדרשים בתוך ברדס תרבית תאים. מלקחיים סטריליות שימוש למקם את הפיגומים בצלחת תרבית תאי 96-גם הקצאת פיגום אחד בכל טוב. (10 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הפיגומים במדיום תרבית תאים לאזן אותם לפני תא זרעING. דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. (10 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את עודף הבינוני מהפיגומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהשעית התא / פיגום 100 μl. (10 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות CO / N כדי לאפשר מצורף תא לפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר לשאוב התאים מצורפים שאינו ולהחיל 200 μl / טוב של מדיום תרבות טרי. (10 דקות) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגום הטבעה עם מטריצת קולגן. (2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 10x PBS, מים, 1 N NaOH ועכברוש זנב אני קולגן על קרח. הכן פתרון עבודה של קולגן לפי הוראות היצרן. לשמור על קרח עד בונה-זרע התא מוכנה (עד שעה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מבני משי תא-זרע מהחממה ולשאוב את עודף בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים סטריליות באמצעות העברת הפיגומים לבארות הריקות על הצלחת היטב ולטבול כל פיגום בשל 3 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון קולגן 100 μl. מניחים את צלחת תרבית רקמה בחזרהבחממה במשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור של קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתרבית תאים בינונית מחוממת מראש 100 μl / טוב. תרבות בונה במשך שבוע אחד לשנות את המדיום בכל יום על ידי החלפה רק חצי הנפח של המדיום. </li></ol></li></ol> 4. מיקרוסקופית ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעה חי / מת (1 שעה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של יודיד propidium (PI) 1 מ&quot;ג / מיליליטר (1.5 מ&quot;מ) במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של diacetate והעמסת (FDA) 2 מ&quot;ג / מיליליטר באצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד המכיל 10 מיקרומטר PI ו0.15 מיקרומטר FDA מדולל PBS. טרום חם הפתרון ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם להסיר את esterases הסרום. לשאוב את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישם את הפתרון עובד מראש חימם על התאים למשך 2 דקות ולשטוף אותו עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו במיקרוסקופ epifluorescent לתמונת התאים (לשעבר PI λ = 490 ננומטר, λ = 570 ננומטר; ה- FDA לשעבר λ = 490 nמ &#39;, אותם λ = 514 ננומטר). הכתם נשאר יציב לאורך 40 דקות. צביעה ממושכת עלולה לגרום להכתמה נוקבים כתוצאה מספיגת PI על ידי התאים ושיתוף הלוקליזציה של PI / FDA בתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת הזמן הרצויה של התרבות לתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות ב RT. בשל הרעילות של PFA רותח צעד התיקון צריכה להתבצע במנדף הכימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פיגומים עם 3x PBS נקודת עצירה:. ניתן לאחסן מבנים קבועים PFA PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני שתמשיכו עם צעדים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפיגומים ב0.2% טריטון, 0.25% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS המכילים O נוגדן ראשוני / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לבטל את הפתרון מכתים ולשטוף את הפיגומים 3 x 30 דקות עם PBS להסיר הנוגדן מאוגד העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות עם נוגדנים משני בדילול מלא 0.2% טריטון, BSA 0.25% ב PBS עבור 2שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מכתים ולשטוף את הפיגומים 3 x 30 דקות עם PBS להסיר נוגדנים משני מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 20X על ידי לקיחת 100 מיקרומטר Z-סעיפים של המדגם עם שלב 1 מיקרומטר. כדי להמחיש את neurites דקה רזולוציית התמונה צריכה להיות של 1,024 x 1,024 פיקסלים מינימום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA, DNA ובידוד חלבון הערה: RNA, DNA ובידוד חלבון מתבצע באמצעות ערכת מיני AllPrep DNA / RNA / חלבון מסחרי בהתאם להוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים סטריליות באמצעות העברת הפיגומים מצלחת התרבות לצינור סטרילי 2 מיליליטר. הנח פיגום אחד לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ RLT על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את המבנה על ידי פיצולו עם microscissors סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לhomogenize הרקמה שיבש, להעביר את התוכן של הצינור לעמודת הספין. ספין 2 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge.Lysate הוא הומוגני כשהוא עובר דרך טור הספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הזרימה דרך ולהשתמש בו באופן מיידי כדי לבודד RNA, DNA וחלבונים הבאים הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את התשואה של חומצות גרעין בכל שיטה תואמת אחרת (לדוגמא, NanoDrop). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את תשואת החלבון באמצעות assay חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. למדוד את התוצאה של assay באמצעות microplate קורא באורך גל 562 nm. הערה: התשואה הצפויה של חומצות וחלבון למבנה ביחס לצפיפות תאי גרעין מוצגת באיור 4. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Public+health+principles+and+neurological+disorders.">Chapter 1, Public health principles and neurological disorders.</a> Neurological Disorders. , (2005).</li><li>Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+Quantitative+targeted+proteomics+for+understanding+the+blood-brain+barrier:+towards+pharmacoproteomics.">T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics.</a> Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).</li><li>Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+energy+demands+of+signaling+and+nonsignaling+components+in+brain+are+conserved+across+mammalian+species+and+activity+levels.">Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).</li><li>Wesseling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+metabonomic+and+proteomic+approach+identifies+frontal+cortex+changes+in+a+chronic+phencyclidine+rat+model+in+relation+to+human+schizophrenia+brain+pathology.">A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology.</a> Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).</li><li>Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+axons+in+three-dimensional+astrocyte+cultures.">The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures.</a> Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).</li><li>Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+rate-dependent+induction+of+reactive+astrogliosis+and+cell+death+in+three-dimensional+neuronal-astrocytic+co-cultures.">Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures.</a> Brain Res. 1158, 103-115 (2007).</li><li>East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+astrocytes+increases+neuronal+growth+in+three-dimensional+collagen+gels+and+is+maintained+following+plastic+compression+to+form+a+spinal+cord+repair+conduit.">Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).</li><li>Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+survival+of+in+vitro+engineered+nervous+tissue+derived+from+the+specific+neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Hogberg, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+3D+model+of+human+brain+development+for+studying+gene/environment+interactions.">Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S4 (2013).</li><li>Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millimeter-sized+neural+building+blocks+for+3D+heterogeneous+neural+network+assembly.">Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly.</a> Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).</li><li>Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+three-dimensional+culture+of+neural+stem/progenitor+cells+in+collagen+type-1+gel.">Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel.</a> Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).</li><li>Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+formulation+determines+cell+fate+of+fetal+and+adult+neural+progenitor+cells.">Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells.</a> Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).</li><li>Gurkan, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al..Simple+precision+creation+of+digitally+specified,+spatially+heterogeneous,+engineered+tissue+architectures.">et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures.</a> Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering.">Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).</li><li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+with+long-distance+axon+tracts+for+determining+functional+connectivity.">Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity.</a> J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).</li><li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue.">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).</li><li>Rockwood, D. N., Preda, R. C., Y&#252;cel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin.">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).</li><li>Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+culture+system+for+in+vitro+analysis+and+biomaterial+design.">Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design.</a> J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).</li><li>Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+framework+for+clustering+and+quantitative+analysis+of+white+matter+fiber+tracts.">A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts.</a> Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).</li><li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt-leached+silk+scaffolds+with+tunable+mechanical+properties.">Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).</li><li>Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+aqueous-derived+biomaterial+scaffolds+from+silk+fibroin.">Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin.</a> Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).</li><li>Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicoidal+multi-lamellar+features+of+RGD-functionalized+silk+biomaterials+for+corneal+tissue+engineering.">Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).</li><li>Hopkins, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+hydrogels+as+soft+substrates+for+neural+tissue+engineering.">Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering.</a> Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).</li><li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells:+A+quick+protocol.">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol.</a> Vis. Exp. (63), e3965 (2012).</li></ol>

הפרסום של מאמר וידאו זה ממומן על ידי קורנינג.

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts21.
The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties22. The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.
The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD25 or fibronectin26. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.
As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model18. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining11. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.
Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

מערכת העצבים המרכזית (CNS) יכולה להיות מושפעת ממגוון רחב של הפרעות מעורבות כלי דם, מבניים, תפקודי, מדבקות או ניוונית. 6.8 מיליון אנשים מתים בכל שנה כתוצאה מהפרעות נוירולוגיות, המייצגת את נטל כלכלי-חברתי גובר בעולם 1. עם זאת, יש לי רק מעטים מן ההפרעות טיפולים זמינים. לכן, יש צורך קריטי לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות לחולים הסובלים מהפרעות נוירולוגיות. למרבה הצער, תרופות ממוקדות במערכת העצבים המרכזית רבות נכשלות במהלך ניסויים קליניים, בין שאר בשל השימוש במודלים לקויים פרה-קליניים מחקר, אשר אינו מאפשרים הערכה של השפעות אקוטיות וכרוניות עם קריאות פונקציונליות מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיות. למרות מאמצי מחקר משמעותיים בעשורים האחרונים, יש כמות עצומה לא ידועה על המבנה והתפקוד של מערכת העצבים המרכזית. על מנת לקבל יותר ידע, מודלים של בעלי החיים הם לעתים קרובותאד מודל מצבים פתולוגיים, כגון פגיעה המוחית טראומטי (TBI) או דמנציה, במיוחד במחקרים פרה-קליניים. עם זאת, בעלי חיים שונים באופן משמעותי מבני אדם הן באנטומיה של מערכת העצבים המרכזית, כמו גם בתפקוד, ביטוי גנים וחילוף חומרים 2-4. מצד השני, תרבויות 2D במבחנה הן השיטה הנפוצה לחקור ביולוגיה של תא ומשמשות באופן שגרתי לגילוי סמים. עם זאת, בתרביות תאי 2D חסרות מורכבות ורלוונטיות פיסיולוגיים לעומת המוח האנושי 5-7. אמנם אין תחליף לעלות הנמוכה ופשטות של לימודי תרבות תא 2D או המורכבות הניתנות על ידי מודלים של בעלי חיים, הנדסת רקמות 3D יכולה ליצור מודלים מחקר משופרים כדי לסגור את הפער שקיים בין 2D במבחנה ובגישות vivo. הנדסת רקמות 3D מספקת תנאי ניסוי יותר מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיים שהושגו על ידי אינטראקציות תא-תא 3D ורמזים תאיים הניתנים על ידי הפיגומים ביולוגי. DespITE הראיות משמעותיות מאחורי הערך של תרבויות 3D, יש כיום רק כמה מודלים 3D במערכת העצבים המרכזית רקמות כגון תרבויות מקורן בתאי גזע organoid 8-10, neurospheroids 11 ופזרו תרבויות הידרוג&#39;ל 12,13. שיטות טכניות מתקדמות, כולל ליתוגרפיה הרבה השכבתית 14, והדפסת 3D 15 כבר נוצלו ללימוד ריאות, כבד, ורקמת כליה. עם זאת, יש חוסר של מודלים 3D של מערכת העצבים המרכזית, המאפשרים לצמיחה עצבית ממודרת, כגון מחקה את האדריכלות וביולוגיה בקליפת המוח. צמיחה של מופרד neurites מגופי תא עצביים כבר הוכיחה בעבר בתרבויות 2D באמצעות microfabrication 16,17 מאפשר המחקר של מעקב מערכת האקסון, זרימת סידן, ארכיטקטורת רשת ופעילויות. רעיון זה נתן לנו השראה לפיתוח רקמה עצבית מקוטבת 3D שבו גופי תא ושטחי axonal נמצאים בתאים שונים מחקה את הארכיטקטורה שכבתית של המוח 18 </sup&gt;. הגישה שלנו מבוססת על השימוש בעיצוב פיגום משי ייחודי אשר מאכלס בצפיפות גבוהה של תאים בנפח מוגבל ומאפשר תולדה של רשת axonal הצפופה לג&#39;ל קולגן. כאן אנו מדגימים את הליך הרכבה המלא של רקמות כמו מוח כוללים ייצור הפיגום והתרבות עצבית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223530</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiBr</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>213225</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MWCO 3500 dialysis cassettes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>66110</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>No. 270, No. 35, No. 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE mold</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71382</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 5mm</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501909</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 2mm</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>501908</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>final concentration 10 ug/ml, dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1283-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>final concentration 0.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522-100MG</td>
			<td>final concentration 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement 50x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>final concentration 3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7378-5G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX10</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, final concentration 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;IIITubulin antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td>rabbit 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit Alexa-546</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010</td>
			<td>goat 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023-5ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP2 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>objective 20x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023&#160;</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader Spectramax M2</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td>absorbance 562 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors, Economy, Vannas-type</td>
			<td>TedPella</td>
			<td>1346</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered 3d silk-collagen-based model of polarized neural tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

חתוכי ספוגים משי מוצקים לצורת הסופגנייה מייצג רעיון ייחודי ופשוט להשגת ארכיטקטורה ממודרת דומות רקמה (איור 2 א) העצביים. המבנה הנקבובי ביותר של הפיגום עם הגודל הנקבובית של כ -500 מיקרומטר תוצאות בשטח גבוה במיוחד ומאפשרות זריעה וצמיחה של צפיפות גבוהות תאים בתוך נפח קטן (2x10 7 / מיליליטר) (איור 2). בנוסף, הנקבוביות הגבוהה של הפיגום מאפשר דיפוזיה בלתי מוגבלת של חומרים מזינים ופסולת וכתוצאה מכך כדאיות מעולה של תרביות תאים צפופות על מסגרות זמן ממושכות. על זריעת תאי העצב במהירות אחידה ולצרף אל פני השטח של נקבוביות הפיגום. לאחר מצורף תא שלם ותאי equilibrated על מצע המשי, פיגום ספוג מלא במטריצת קולגן הרכה על מנת לספק סביבת 3D להיווצרות רשת axonal (איור 3 </strong&gt;). בהעדר מטריצת קולגן המידור של אקסונים וגופי תא אינו אפשרי כתאי עצב לגדול הרחבות רק על פני השטח של הנקבוביות וכתוצאה מכך מעורבות רשתות כפי שנמצא עם משטחי 2D (איור 3). לעומת זאת, ג&#39;ל קולגן מספק meshwork התומך בתוצאת axonal נרחבת ב3D, בעוד גופי תא עצביים נשארים צמודים לפיגום המשי (איור 3 ג). דפוס צמיחה זה מוביל למידור של גופי תא ורשתות axonal טהורים (איור 3D), שדומה לחומר האפור ולבן של קליפת המוח במוח. מלבד מיקרוסקופיה, ניתן להעריך את המבנים עם מגוון רחב של שיטות אחרות 18, בהתאם לשאלה מאחורי הניסוי. לדוגמא, הבידוד של DNA, RNA וחלבון מהבונה יכול להיות בקלות בוצע באמצעות ערכות מסחריות (איור 4). התשואה של חומצות גרעין והחלבונים PEמבנה r תלוי במספר תאי זרע בתחילה על פיגומי משי. יותר תאי זרע גבוה יותר התשואה של ה- DNA, RNA וחלבון. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> עובש איור 1. PTFE משמש להכנת פיגום ספוגי משי הממדים:.. 10 סנטימטרים קוטר, 2 סנטימטרים גובה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> איור 2. מודל 3D רקמות כמו מוח. () פיגום ספוגי משי נקבובי. הכתמה (ב) בשידור חי / המתה של תאי עצב ביום 1 על זריעה על פיגום משי לפני קולגן הטבעה (תאים ירוקים-חיים, תאים אדומים-מתים). פנלים בצד ימין מראים magnification של האזור שנתפס במסגרות אדומות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> איור 3. עצבי תולדה ממודרת במודל הרקמות כמו המוח-3D () תאי פיגום:. תא גוף אדום-תא, תא הכחול-axonal. דפוס צמיחה עצבי ביום 1 על זריעה לפני הטבעת קולגן (ב &#39;). (ג). תולדה עצבית ביום 7 על זריעה בתא גוף תא. תולדה עצבית ביום 7 על זריעה בתא axonal (ד &#39;). ירוק -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה</a>דמות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> תשואת איור 4. צפוי של RNA () ו- DNA, וחלבון (ב) למבנה ביחס לכמות תאי זרע לפיגום (± סטיית תקן, n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue at JoVE.com

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

engineered-3d-silk-collagen-based-model-of-polarized-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Views.  Tufts University. Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Video: Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

תהודה מגנטית elastography מתודולוגיה להערכת של רקמות מהונדסות צמיחה Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...