The evolution of the device started with somewhat different cutting prototype demonstrated at the Imperial Cancer Research Fund (ICRF) mouse club by Bass Hassan, following this there were several discussions with Rob Rudling and Nikki Mandir in the containment facility at ICRF Clare Hall. Jo Kitau of the mechanical workshop at ICRF constructed the initial versions and Andy Lucas designed and perfected the final model in the CRUK workshop in Oxford.

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المختلفة والقتل الرحيم إنسانية من قبل لجنة أخلاقية المؤسسات المضيفة والهيئات التنظيمية المناسبة. ويتحقق القتل الرحيم عادة باستخدام CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. 1. جهاز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آلة الجزء الرئيسي للقاعدة الجهاز من خارج كتلة صلبة عالية الكثافة الراتنج الاسيتيل، كما هو موضح في هذه المخطوطة. في نهاية كل إنشاء 3 مم عالية ارتقى الشرائط، وآلة جزء من هذه 2.5 ملم بساتين لاتخاذ قضبان (انظر الشكل 2 والشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل قضبان من 2.4 مم الفولاذ المقاوم للصدأ مع نهايات مدورة حالا. تم تشكيله الإطار الرئيسي للغطاء من لوحة الدوراليومين مزيج من ألمونيوم و نحاس: ملاحظة. كما يتوفر عدد محدود من أجهزة الانتهاء من الدكتور Goodlad. </li></ol> 2. استخدام الجهاز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج الأمعاء الدقيقة والقولون من تجويف البطن باستخدام مقصوأصابع القفاز. إزالة مساريق من خلال عقد مع ملقط المنحنية وبلطف سحبه بعيدا من الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأمعاء مع الفوسفات الباردة مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) باستخدام نوع جيلسون ماصة، الذي كان قد خفض في نهاية الأوسع بحيث يمكن أن يصلح على 10 أو 20 مل بالتركيبة حقنة بلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأمعاء الدقيقة (SB) إلى ورقة منشفة ورقية وتقسم إلى ثلاثة أقسام متساوية في الطول (الداني، منتصف، والقاصي - SB1، SB2 وSB3) باستخدام المقص. إزالة الأعور ووضع القولون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العديد من الجروح الصغيرة جدا في قطاعات المعوية مع مقص لتسمح للسائل للهروب ووضع ورقة منشفة ورقية على الأمعاء وبلطف تشغيل الاصبع على التحضيرات للضغط على السائل وصمة عار الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع المقاطع وإدخال قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ التي تم المبللة مسبقا عن طريق نقع في كوب من الفوسفات مخزنة المالحة. ملاحظة: الأمعاء يمكن أن يكون فيverted إذا رغبت في ذلك (تحولت الداخل الى الخارج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية قطعة من بطاقة أو تصفية قطع الورق إلى حجم لتناسب قاعدة الجهاز. قلم رصاص هو أفضل، لأنه لا يتأثر كل الحلول تقريبا. واقترح تاريخ التشريح، رمز التجريبية ورقم هوية الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بطاقة أو ورقة مرشح في قاعدة الجهاز. إدراج قضبان والأمعاء في الفتحات الموجودة في قاعدة الجهاز. تأكد من وضع نهاية القريبة من القطاعات بطريقة موحدة. يجب أن تكون نهايات القريبة بالقرب من التسميات البطاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة العلوي من الجهاز على قاعدة. استخدام أشرطة الزاوية لتوجيه شفرة مشرط لقطع طولي الأقسام. ملاحظة: كما أنه يساعد إذا كان النسيج هو بلطف وعناية عقدت مع ساكنا لضمان أن لا يتحرك مع السكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطعة العلوي من الجهاز. إزالة بعناية ورقة والأنسجة مرشح (لا يزال على عصيهم). ملاحظة: قطعة من بطاقة شديدة وضعت تحت سن الفيلوتستعرض ورقة ثالثا مساعدة الرفع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب قليلا (مع الإصبع القفاز مغموسة في PBS) قطاعات. لفة قضيب، جنبا إلى جنب لفتح القناة الهضمية وينتشر بشكل مسطح. سوف الأنسجة ثم الانضمام إلى ورقة الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص البصر الاستعدادات لأي الآفات الجسيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة الالتزام بها ورقة الترشيح إلى حمام ضحل (أو شطيرة مربع) تحتوي على مثبت. ملاحظة: بعد تتمسك الأنسجة إلى ورقة الترشيح أو بطاقة سيبقى تعلق بحزم. وهناك مجموعة واسعة من المثبتات يمكن استخدامها للحفاظ على التحضير. فمن المستحسن أن السائل Carnoy ينبغي أن تستخدم لدراسة انتشار الاسلحة الخلايا المعوية 6، وهو تثبيت المثالي لأفضل الطرق تكاثر الخلايا. ومع ذلك الفورمالين أو يمكن أن تستخدم أيضا العديد من مثبتات أخرى إذا كانت هناك حاجة النهاية الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تثبيت (عادة 3 ساعات)، ونقل التحضيرات إلى 70٪ من الإيثانول. ويمكن بعد ذلك يتم تخزين العينات حتى المطلوبة. التحضيرات جلدراستها أون الوجه و / أو المستخدمة في إعداد العينات النسيجية لH &amp; E أو غيرها من تقنيات تلطيخ النسيجية، المناعية و / أو التهجين في الموقع. ملاحظة: المطول التثبيت يمكن أن تقلل من القابلية للتفاعل المناعى و / أو التهجين الموضعي للتفاعل في. صناديق البولي بروبلين شطيرة مثالية لتخزين عدد كبير من التحضيرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر الأنسجة الثابتة من مختلف شرائح المعوية يمكن أن يتم في &#39;القوائم السويسرية وملطخة مجموعة كاملة من وسائل النسيجية 6 بما في ذلك تلك المذكورة أعلاه. لجعل &#39;لفة السويسرية تتم إزالة أجزاء الأمعاء من ورقة الترشيح، وتوالت حول عصا كوكتيل أو مسواك، المضمون مع دبوس الحشري ومعالجتها للشمع التضمين 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، وصمة عار على النسيج السائبة مع الميثيلين الأزرق إلى تصور الشاذة سرداب البؤر 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل الاستعدادات الثابتة فيأوقات الفراغ. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodlad, R. A., Alison, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Cancer+Handbook."> Cancer Handbook.</a> , 243-262 (2007).</li><li>Ward, J. M., Treuting, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+intestinal+epithelial+carcinogenesis:+pathology+and+preclinical+models.">Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models.</a> Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).</li><li>Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Training+mouse+pathologists:+ten+years+of+workshops+on+the+Pathology+of+Mouse+Models+of+Human+Disease.">Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease.</a> Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).</li><li>Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fat+influences+on+polyp+phenotype+in+multiple+intestinal+neoplasia+mice.">Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice.</a> Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).</li><li>Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+device+to+rapidly+prepare+whole+mounts+of+murine+intestine.">A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine.</a> Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).</li><li>Alferez, D., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+best+measure+cell+proliferation+in+samples+from+the+intestine.">To best measure cell proliferation in samples from the intestine.</a> Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).</li><li>Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+aberrant+crypt+foci+and+colonic+carcinoma+in+dimethylhydrazine-treated+rats+varies+in+a+site-specific+manner+and+depends+on+tumor+histology.">The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology.</a> Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).</li><li>Park, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+epidermal+growth+factor+and+dimethylhydrazine+on+crypt+size,+cell+proliferation,+and+crypt+fission+in+the+rat+colon.+Cell+proliferation+and+crypt+fission+are+controlled+independently.">Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently.</a> Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).</li><li>Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin-depleted+foci+(MDF)+in+the+colon+of+rats+treated+with+azoxymethane+(AOM)+are+useful+biomarkers+for+colon+carcinogenesis.">Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li><li>Goodlad, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+signaling+reduces+tumor+burden+in+the+ApcMin/++mouse+model+of+early+intestinal+cancer.">Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer.</a> Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).</li><li>Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistant+carbohydrates+stimulate+cell+proliferation+and+crypt+fission+in+wild-type+mice+and+in+the+Apc(Min/+)+mouse+model+of+intestinal+cancer,+association+with+enhanced+polyp+development.">Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development.</a> Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الجهاز تسرع كثيرا من عملية بحيث يمكن للمشغلين اثنين تشريح الجثة بالكامل ماوس في غضون 6 دقائق. وسوف يشمل ذلك فحص بصري للآفات جسيمة واضحة وزنها وتحديد الأجهزة الرئيسية. وسوف تسمح أيضا للشركات لشطف، وصمة عار وتزن المعدة، الأعور والأمعاء الدقيقة والقولون واعداد يتصاعد ك...

الماوس والماوس المعدلة وراثيا 1-3 ونموذجا لا تقدر بثمن لدراسة مختلف الأمراض وخاصة سرطان وعلاقته التهاب في الجهاز الهضمي. هذا وغالبا ما يتطلب إعداد يتصاعد كلها من الأمعاء الدقيقة و / أو القولون. إعداد يتصاعد كلها يمكن القيام به مع زوج دقة مقص تعويض ولكن يمكن أن يستغرق حوالي 20 دقيقة في الماوس 4. هذا ليس عملي جدا للدراسات المقارنة، والتي تتطلب قدرا كبيرا من الفئران (ويقول 10 في مجموعة تخضع للتحليل الإحصائي). وبالإضافة إلى ذلك، وطول الوقت الذي يستغرقه يزيد من خطر تدهور الأنسجة. محاولة للتخفيف من حدة هذه المشكلة أدت إلى محاكمة مختلف الوسائل إعداد القطع. واستند الأول في سلسلة من لوحات معدنية، مع بساتين القطع، ولكن حجب لوحات النسيج وكان قطع وبالتالي من الصعب السيطرة عليها. A conventionaل قلم رصاص سداسية قدمت أخيرا إلهام للجهاز القطع، ونحن يمكن بعد ذلك نرى كيف شكل نصف قلم رصاص من شأنه أن يجعل دليلا جيدا لمشرط (الشكل 1). وأدى ذلك إلى تصميم لإطار مع أربعة أدلة قطع 5. كانت فعالية هذا الجهاز دراماتيكية كما الاستعدادات في الشكل (4) تبين الفرق بين إعداد مقص وإعداد الجهاز. شيد قمم الأجهزة الأصلية من عدة قطع من المعدن، ولكن تلك في وقت لاحق، وكان تشكيله النموذج الحالي من قطعة صلبة من الدوراليومين مزيج من ألمونيوم و نحاس. تم تشكيله على قاعدة من أعلى مستويات الجودة الراتنج عالية الكثافة. وقد أثبت الجهاز أن تكون ذات فائدة كبيرة لإعداد يتصاعد كاملة من الماوس الأمعاء لأنها تسرع كثيرا ويحسن من جودة واتساق والاستعدادات، التي لديها مجموعة واسعة من التطبيقات.

<table><tbody><tr><td>Delrin</td><td>Ryan Plastics, Earls Barton, UK</td><td></td><td>High-density acetal resin similar material would suffice</td></tr><tr><td>Duralumin plate</td><td>Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK</td><td></td><td>Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Finished device(s) ready for use</td><td>Contact Dr Goodlad&amp;nbsp; r.goodlad@imperial.ac.uk</td><td></td><td>Contact&amp;nbsp; r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details</td></tr></tbody></table>

a simple device to rapidly prepare whole mounts of the mouse intestine

يمكن إعداد يتصاعد كلها من الأمعاء الدقيقة والقولون الماوس للتحليل الكمي أو لاحقة تكون مضيعة للوقت وصعبا. وصفنا استخدام جهاز بسيط لخفض والأمعاء &quot;لفة&quot; الماوس للتحضير بشكل سريع التحضير جبل كلها ذات جودة عالية وموحدة لتلك التي يمكن تحقيقها عن طريق اليد. ويتألف الجهاز قاعدة أن يحمل 4 قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ وأعلى، والذي يعمل دليلا القطع. يتم إدراج قضبان في تجويف الأمعاء الدقيقة [مقسمة إلى ثلثي] والقولون. ثم توضع قضبان والعينات على قطعة من الورق أو بطاقة مرشح في فتحات عقد في قاعدة الجهاز. ثم يتم وضع الجزء العلوي من الجهاز وبمثابة دليل القطع. وتستخدم الأقسام الزاوية اثنين في وسط قطعة كبار لتوجيه سكين أو مشرط وقطع الأمعاء طوليا على الجزء العلوي من قضبان. مرة واحدة وقد تم قطع الأجزاء المعوية، تتم إزالة الجزء العلوي وبطاقة، TISSرق وقضبان إزالة بلطف من الجهاز ووضعها على مقاعد البدلاء. ثم يتم إرجاع قضبان بلطف جانبية للشد وعصا شرائح المعوية على قطعة الكامن وراء ورقة أو بطاقة مرشح. ويمكن بعد ذلك فحص الإعداد النهائي أو ثابتة وتخزينها لتحليلها لاحقا. الاستعدادات لا تقدر بثمن لدراسة التغيرات المعوية في نماذج الفئران العادية أو المعدلة وراثيا. وقد استخدمت الاستعدادات لدراسة وتقدير حجم آثار التهاب (التهاب القولون)، والضرر، والآفات ما قبل السرطانية (الشاذة سرداب البؤر (ACFs) والميوسين المنضب بؤر (MDFs)) واللحمية أو الأورام.

الاورام الحميدة هي سهلة لتحديد إطار stereomicroscope مع مصدر ضوء بارد إلى جانب إلقاء الضوء على الأنسجة (الشكل 4). ومن المفيد للاحتفال البطاقة مع علامات قلم رصاص عندما لوحظ ورم من اجل ان يحرز يمكن مناقشتها في وقت لاحق ويمكن لمشغلي مختلفة التوصل إلى اتفاق. الأنسجة يمكن ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine at JoVE.com

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

جهاز بسيط للتحضير السريع الجبال الجامعة للماوس الأمعاء

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

a-simple-device-to-rapidly-prepare-whole-mounts-of-the-mouse-intestine

Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K Views.  National Institutes of Health. The use of a simple device to cut and ‘roll’ mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Video: A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

بروتوكولات لتحليل دور خلايا بانيت في التجديد في الأمعاء الفئران باستخدام شرطي<em&gt; جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن</em&gt; ماوس نماذج

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Developmental Biology

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

وظيفية تقييم الحركة المعوية والتهاب الأمعاء الجدار في القوارض: التحليلات في نموذج موحد من التلاعب المعوية

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunology and Infection

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

تصور من خلايا خلالية لشبكة (ICC) في الفئران كاجال

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Biology

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج الفئران لدراسة العلوص بعد الجراحة من خلال التلاعب المعوي

Postoperative Ileus Murine Model

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI is a consequence of mechanical damage during surgery, resulting in disruption of motility in the gastrointestinal tract. The mechanisms of POI are related to aberrant neuronal sensitivity, impaired epithelial barrier function, and increased local inflammation. However, the details remain enigmatic. Therefore, experimental murine models are crucial for elucidating the pathophysiology and mechanism of POI injury and for the development of novel therapies.
Here, we introduce a murine model of POI generated via intestinal manipulation (IM) that is similar to clinical surgery; this is achieved by mechanical damage to the small intestine by massaging the abdomen 1-3 times with a cotton swab. IM delayed gastrointestinal transit 24 h after surgery, as assessed by FITC-dextran gavage and fluorescence detection of the segmental digestive tract. Moreover, tissue swelling of the submucosa and immune cell infiltration were investigated by hematoxylin and eosin staining and flow cytometry. Proper pressure of the IM and a hyperemic effect on the intestine are critical for the procedure. This murine model of POI can be utilized to study the mechanisms of intestinal damage and recovery after abdominal surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج العنقوص بعد الجراحة

We describe a murine model of postoperative ileus generated via intestinal manipulation. Gastrointestinal transit function, pathologic changes, and immune cell activation were assessed 24 h after surgery.

نموذج العنقوص بعد الجراحة

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

جهاز بسيط للتحضير السريع الجبال الجامعة للماوس الأمعاء

Summary

Explore More Videos

بروتوكولات لتحليل دور خلايا بانيت في التجديد في الأمعاء الفئران باستخدام شرطي

وظيفية تقييم الحركة المعوية والتهاب الأمعاء الجدار في القوارض: التحليلات في نموذج موحد من التلاعب المعوية

وسم المناعية-فلوري Microtubules والبروتينات سينتروسومال في 3D في المختبر أورجانويدس الأمعاء والأنسجة المعوية السابقين فيفو

ال

تصور من خلايا خلالية لشبكة (ICC) في الفئران كاجال

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل

نموذج العنقوص بعد الجراحة

نموذج العنقوص بعد الجراحة

نموذج العنقوص بعد الجراحة

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي