The evolution of the device started with somewhat different cutting prototype demonstrated at the Imperial Cancer Research Fund (ICRF) mouse club by Bass Hassan, following this there were several discussions with Rob Rudling and Nikki Mandir in the containment facility at ICRF Clare Hall. Jo Kitau of the mechanical workshop at ICRF constructed the initial versions and Andy Lucas designed and perfected the final model in the CRUK workshop in Oxford.

Die verschiedenen experimentellen Verfahren und die humane Sterbehilfe werden von der gastgebenden Einrichtungen Ethikkommission und von den zuständigen Aufsichtsbehörden genehmigt. Sterbehilfe ist in der Regel unter Verwendung von CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte erreicht. 1. Vorrichtung <ol><li> Maschine der Hauptteil des Bodens der Vorrichtung von aus einem festen Block aus hochdichtem Acetyl-Harz, wie in diesem Manuskript beschrieben. An jedem Ende zu erstellen 3 mm hoch erhöhten Streifen, und ein Teil Maschine aus diesen 2,5 mm Haine, um die Stangen zu nehmen (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). </li><li> Machen Stangen aus einem 2,4 mm Durchmesser aus Edelstahl mit abgerundeten Enden. HINWEIS: Der Hauptrahmen des Deckels wurde aus Duralumin Platte gefräst. Eine begrenzte Anzahl von fertigen Vorrichtungen sind von Dr. Goodlad erhältlich. </li></ol> 2. Verwendung des Geräts <ol><li> Sezieren den Dünndarm und Dickdarm aus der Bauchhöhle mit einer Schereund behandschuhten Fingern. Entfernen Sie das Mesenterium, indem Sie sie mit einer gebogenen Pinzette und leichtes Ziehen sie weg aus dem Darm. </li><li> Spülen Sie den Darm mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) mit einer Pipettenspitze Gilson-Typ, der sich an seinem breiteren Ende geschnitten worden war, so dass er auf ein 10 oder 20 ml Luer-Fitting-Kunststoffspritze passen. </li><li> Legen Sie den Dünndarm (SB) auf einem Blatt Papier Handtuch und teilen sich in drei gleiche Abschnitte in der Länge (proximalen, mittleren und distalen - SB1, SB2 und SB3) mit einer Schere. Entfernen Sie den Blinddarm und legen Sie den Doppelpunkt. </li><li> Machen Sie mehrere sehr kleine Schnitte in das Darmsegmente mit einer Schere, damit die Flüssigkeit entweichen und legen Sie ein Blatt Papier Handtuch über den Darm und sanft laufen mit dem Finger über die Vorbereitungen zu verdrängen die Flüssigkeit und trocken tupfen. </li><li> Heben Sie die Abschnitte und legen Sie die Edelstahlstäbe, die zuvor durch Eintauchen in ein Becherglas mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung benetzt wurden. HINWEIS: Der Darm kann sein,umgewandelt, wenn dies gewünscht (innen nach außen gedreht). </li><li> Beschriften Sie ein Stück Karton oder Filterpapier auf Maß geschnitten, um in die Basis des Geräts passen. Bleistift ist am besten, da sie unbeeinflusst von nahezu allen Lösungen ist. Autopsy Datum, experimentellen Code und Tieridentifikationsnummer vorgeschlagen. </li><li> Legen Sie die Karte oder Filterpapier in die Basis des Geräts. Setzen Sie die Stangen und Darm in die Schlitze in der Basis des Gerätes. Sicherzustellen, dass das proximale Ende der Segmente in einer standardisierten Weise positioniert. Die proximalen Enden sollten in der Nähe der Karte Etiketten sein. </li><li> Legen Sie das Oberteil des Gerätes über die Basis. Mit den abgewinkelten Bars, ein Skalpell zu führen, um die Abschnitte längs geschnitten. HINWEIS: Es ist hilfreich, wenn das Gewebe vorsichtig und mit einem Finger gehalten werden, um sicherzustellen, dass sie nicht mit dem Messer zu bewegen. </li><li> Entfernen Sie das Oberteil des Gerätes. Das Filterpapier und Gewebe vorsichtig entfernen (immer noch auf ihre Stäbe). HINWEIS: Ein Stück steifen Karte unter dem fil platziertter Papier Hebehilfe. </li><li> Leicht feucht (mit einer behandschuhten Fingerspitze in PBS getaucht) der Segmente. Rollen Sie die Stange, von Seite zu Seite zu öffnen, die gut und breitete sie flach. Das Gewebe wird dann auf das Filterpapier haftet. </li><li> Visuell untersuchen die Vorbereitungen für alle makroskopischen Veränderungen. </li><li> Übertragen des Gewebes auf das Filterpapier haftet in eine flache Wanne (oder Sandwichbox) enthaltenden Fixiermittels. HINWEIS: Nachdem das Gewebe hält sich an das Filterpapier oder auf die Karte wird es bleiben, fest angebracht. Eine Vielzahl von Fixierungsmitteln kann verwendet werden, um die Herstellung zu bewahren. Es wird empfohlen, Carnoy-Flüssigkeit sollte für die Untersuchung von Darmzellwucherungen 6, die die ideale Fixierung für den besten Zellproliferation Verfahren verwendet wird; jedoch Formalin oder viele andere Fixierungsmittel verwendet werden, wenn andere Endpunkte erforderlich sind. </li><li> Nach der Fixierung (in der Regel 3 h), übertragen Sie die Präparate in 70% Ethanol. Die Proben können dann gelagert, bis sie benötigt werden. Die Vorbereitungen cen face eine untersucht und / oder für die Herstellung von histologischen Proben für H &amp; E oder andere histologische Färbetechniken Immunhistochemie und / oder in situ-Hybridisierung verwendet werden. HINWEIS: Längerer Fixierung kann immunhistochemische Reaktivität und / oder in situ Hybridisierung Reaktivität zu reduzieren. Polypropylen-Sandwich-Boxen sind ideal für die Speicherung einer großen Anzahl der Zubereitungen. </li><li> Bei Bedarf die fixierten Gewebe aus den verschiedenen Darmabschnitten kann in &quot;Rouladen&quot; gemacht und mit dem gesamten Bereich der histologischen Methoden 6 einschließlich der oben beschriebenen gefärbt werden. Um einen &quot;Swiss roll&quot; machen die Darmsegmente werden aus dem Filterpapier gerollt um einen Cocktail-Stick oder einem Zahnstocher, mit einer entomologischen Stift gesichert und für Wachs Einbetten 6 verarbeitet entfernt. </li><li> Falls erforderlich, beflecken den Großgewebe mit Methylenblau zu abweichenden Kryptenherden 7 visualisieren. </li><li> Note die festen Zubereitungen, die aufFreizeit. </li></ol>

<ol><li>Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).</li>
<li>Ward, J. M., Treuting, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+intestinal+epithelial+carcinogenesis%3A+pathology+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models.</a> Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).</li>
<li>Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Training+mouse+pathologists%3A+ten+years+of+workshops+on+the+Pathology+of+Mouse+Models+of+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease.</a> Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).</li>
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<li>Park, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+epidermal+growth+factor+and+dimethylhydrazine+on+crypt+size%2C+cell+proliferation%2C+and+crypt+fission+in+the+rat+colon.+Cell+proliferation+and+crypt+fission+are+controlled+independently%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently.</a> Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).</li>
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<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Goodlad, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+signaling+reduces+tumor+burden+in+the+ApcMin%2F%2B+mouse+model+of+early+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer.</a> Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).</li>
<li>Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistant+carbohydrates+stimulate+cell+proliferation+and+crypt+fission+in+wild-type+mice+and+in+the+Apc%28Min%2F%2B%29+mouse+model+of+intestinal+cancer%2C+association+with+enhanced+polyp+development%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development.</a> Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Das Gerät erheblich beschleunigt den Prozess, so daß zwei Bediener kann vollständig eine Maus Autopsie innerhalb von 6 min. Dazu gehört auch eine Sichtkontrolle auf offensichtliche makroskopischen Veränderungen und einem Gewicht von und zur Festsetzung der wichtigsten Organe. Es ermöglicht auch die Betreiber zu spülen, trocknen und wiegen den Magen, Blinddarm, Dünndarm und Dickdarm und bereiten die gesamte Reittiere. Der abgeflachte Gewebe sehr schnell behoben werden und somit zu vermeiden Abbau Artefakte. <...

Die Maus und die genetisch veränderte Maus 1-3 sind eine unschätzbare Modell für die Untersuchung von verschiedenen Pathologien, insbesondere Krebs und seine Beziehung zu Entzündungen im Magen-Darm-Trakt. Dies erfordert oft die Herstellung von Gesamtpräparate des Dünndarms und / oder Dickdarm. Die Herstellung von Gesamtpräparate mit einer Genauigkeit Paar versetzter Schere gemacht werden, aber es kann etwa 20 min pro Maus 4 nehmen. Dies ist nicht sehr praktisch für Vergleichsstudien, die eine erhebliche Menge an Mäusen benötigen (etwa 10 pro Gruppe für die statistische Analyse). Darüber hinaus ist die Länge der Zeit erhöht das Risiko von Gewebeabbau. Ein Versuch, dieses Problem zu lindern führte zu der Studie von verschiedenen Schneidvorbereitung Hilfen. Die erste auf einer Reihe von Metallplatten basiert, mit Schneidhainen, aber die Platten verdeckt das Gewebe und die Schneid war daher schwierig zu kontrollieren. Ein Konventionel sechseckigen Bleistift schließlich Inspiration zur Verfügung gestellt für die Schneideinrichtung, wie wir könnten dann sehen, wie eine halbe Stiftform wäre eine gute Führung für ein Skalpell (Abbildung 1) zu machen. Dies führte zu einem Design für einen Rahmen mit vier Schneidführungen 5. Die Wirksamkeit dieser Vorrichtung war dramatisch wie die Präparate in Figur 4 veranschaulichen den Unterschied zwischen der Scheren Zubereitung und der Vorrichtung Zubereitung. Die Oberseiten der Originalgeräte wurde aus mehreren Metallstücke, aber späteren aufgebaut, und das aktuelle Modell wurde aus einem massiven Stück Duraluminium gefertigt. Die Basis wurde von höchster Qualität mit hoher Dichte Harz bearbeitet. Das Gerät hat sich als von großem Nutzen für die Herstellung von ganzen Bergen von Mausdarm, da es erheblich beschleunigt und verbessert die Qualität und Konsistenz der Präparate, die eine breite Palette von Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>Delrin</td><td>Ryan Plastics, Earls Barton, UK</td><td></td><td>High-density acetal resin similar material would suffice</td></tr><tr><td>Duralumin plate</td><td>Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK</td><td></td><td>Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Finished device(s) ready for use</td><td>Contact Dr Goodlad&amp;nbsp; r.goodlad@imperial.ac.uk</td><td></td><td>Contact&amp;nbsp; r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details</td></tr></tbody></table>

a simple device to rapidly prepare whole mounts of the mouse intestine

Herstellung Gesamtpräparate der Maus-Dünndarm und Dickdarm zur nachfolgenden Analyse oder Quantifizierung kann zeitaufwendig und schwierig sein. Wir beschreiben die Verwendung einer einfachen Vorrichtung zu schneiden und zu &#39;roll&#39; Maus Darm ganze Berg Zubereitungen von Superior und gleichbleibende Qualität zu dem, was von Hand erreicht werden kann schnell vorzubereiten. Die Vorrichtung umfasst eine Basis, die 4 Edelstahlstangen und eine Oberseite, die eine Schneidführung wirkt hält. Die Stäbe werden in das Lumen des Dünndarms [gedrittelt] und den Dickdarm eingelegt. Die Stäbe und die Proben werden dann in einem Stück Filterpapier oder einer Karte in die Halteschlitze in der Basis der Vorrichtung platziert. Die Oberseite des Gerätes wird dann positioniert und dient als Schnittführung. Die beiden Abwinkelungen in der Mitte des Oberteils werden verwendet, um ein Messer oder Skalpell führen und schneiden den Darm in Längsrichtung auf der Oberseite der Stangen. Sobald die Darmabschnitte geschnitten worden sind, wird der Kopf abgetrennt und die Karte, tissue und Stangen leicht aus der Vorrichtung entnommen und auf die Bank gelegt. Die Stäbe werden dann sanft zur Seite gerollt, um zu glätten und kleben die Darmsegmente auf die darunterliegende Stück Filterpapier oder Karte. Die endgültige Präparation kann dann untersucht oder befestigt werden und für eine spätere Analyse gelagert. Die Zubereitungen sind von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von Veränderungen der intestinalen normalen oder genetisch modifizierte Mausmodellen. Die Vorbereitungen für die Untersuchung und Quantifizierung der Auswirkungen der Entzündung (Colitis), Schäden, Krebsvorstufen verwendet (anomale Kryptenherden (ACFs) und Mucin erschöpft Brennpunkten (MDF)) und Polypen oder Tumoren.

Polypen sind einfach, unter einem Stereomikroskop mit einer Kaltlichtquelle zu identifizieren, um die Seite zu beleuchten das Gewebe (Abbildung 4). Es ist hilfreich, um die Karte mit Bleistiftmarkierungen kennzeichnen, wenn ein Polyp, damit Scoring kann später diskutiert und verschiedene Betreiber kann Einigung beobachtet. Das Gewebe kann auch Groß sein befleckt [mit Methylenblau] zu identifizieren anomale Kryptenherden 8 oder Mucin erschöpft Brennpunkten (MDF) 9 durch Beleuchtu...

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A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Eine einfache Vorrichtung, um schnell vorbereiten Whole Mounts des Mausdarm

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

a-simple-device-to-rapidly-prepare-whole-mounts-of-the-mouse-intestine

Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K Aufrufe.  National Institutes of Health. The use of a simple device to cut and ‘roll’ mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Serie: A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Medizin

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Immunologie und Infektion

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Biologie

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mausmodell zur Untersuchung des postoperativen Ileus durch Darmmanipulation

Postoperative Ileus Murine Model

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI is a consequence of mechanical damage during surgery, resulting in disruption of motility in the gastrointestinal tract. The mechanisms of POI are related to aberrant neuronal sensitivity, impaired epithelial barrier function, and increased local inflammation. However, the details remain enigmatic. Therefore, experimental murine models are crucial for elucidating the pathophysiology and mechanism of POI injury and for the development of novel therapies.
Here, we introduce a murine model of POI generated via intestinal manipulation (IM) that is similar to clinical surgery; this is achieved by mechanical damage to the small intestine by massaging the abdomen 1-3 times with a cotton swab. IM delayed gastrointestinal transit 24 h after surgery, as assessed by FITC-dextran gavage and fluorescence detection of the segmental digestive tract. Moreover, tissue swelling of the submucosa and immune cell infiltration were investigated by hematoxylin and eosin staining and flow cytometry. Proper pressure of the IM and a hyperemic effect on the intestine are critical for the procedure. This murine model of POI can be utilized to study the mechanisms of intestinal damage and recovery after abdominal surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Postoperatives Ileus-Mausmodell

We describe a murine model of postoperative ileus generated via intestinal manipulation. Gastrointestinal transit function, pathologic changes, and immune cell activation were assessed 24 h after surgery.

Postoperatives Ileus-Mausmodell

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

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Postoperatives Ileus-Mausmodell

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