بروتوكولنا مهم لأنه يمكن من خلق المرض في الهلاميات المائية التي تشبه إلى حد كبير طبيعة أنسجة الغضاريف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على إنتاج المرض في الهلاميات المائية مع نشاط بيولوجي واضح في البنية المكانية ، وانخفاض المناعة ، والوظيفة الصناعية البيولوجية. للبدء ، قم بقطع الغضروف الذي تم جمعه باستخدام مشرط إلى قطع بحجم واحد إلى ملليمترين مكعبين.
في أنبوب طرد مركزي 50 ملم ، اغمر 20 جراما من الغضروف المفروم في 20 ملليلتر من المخزن المؤقت Tris-hydrochloride منخفض التوتر. ضع الأنبوب على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، ثم في الفرن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. دوامة أنبوب الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة.
ثم قم بتصفية الغضروف المنزوع الخلايا باستخدام غربال بلاستيكي يوضع على أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. اغسل الغضروف ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم قبل جمعه. أضف 10 ملليلتر من محلول التربسين إلى الغضروف الذي تم جمعه واحتضانه على شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، ليحل محل التربسين كل أربع ساعات.
بعد تصفية التعليق ، اغسل الغضروف التربسيني بمحلول مفرط التوتر. بمجرد الحفاظ على الغضروف ، أضف 10 ملليلتر من محلول النيوكلياز وضعه على شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، أضف محلول Tris-hydrochloride مفرط التوتر إلى الغضروف وضعه على شاكر كما هو موضح.
بمجرد غسلها باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، اغمر الأنسجة في محلول Triton X-100 بنسبة 1٪ لمدة 24 ساعة. بعد إزالة Triton X-100 ، شطف الغضروف المنزوع الخلايا بالماء المقطر لمدة ثلاثة أيام ، وتغيير الماء كل 12 ساعة. بعد ثلاثة أيام ، أضف محلول حمض البيراسيتيك إلى الغضروف وانقعه لمدة أربع ساعات.
بمجرد غسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ، اجمع الغضروف باستخدام غربال بلاستيكي كما هو موضح سابقا. باستخدام النيتروجين السائل ، وإعداد مسحوق الغضروف decellularized. أضف 80 ملليلترا من 0.5 مولار حمض الأسيتيك و20 ملليجراما من البيبسين إلى جرامين من مسحوق الغضاريف ، واهضم الخليط لمدة 24 ساعة عند 37 درجة سلزية.
بعد الهضم ، قم بالطرد المركزي التعليق عند 400 جرام لمدة 10 دقائق وجمع المادة الطافية ، والتي تسمى الآن حل DC-ECM لتخزين محلول DC-ECM ، أضف ملليلتر واحد من المحلول إلى كل بئر من صفيحة من ستة آبار وضعها في مجفف بالتجميد. بمجرد تجفيف المحلول بالتجميد ، قم بنقله إلى أنبوب طرد مركزي. لتشكيل هيدروجيل ، قم بإذابة 20 ملليغرام من محلول DC-ECM المجفف بالتجميد في ملليلتر واحد من الماء المقطر المعقم.
بمجرد الدوامة ، أضف ملليغرام واحد من فيتامين B2 إلى محلول DC-ECM. بعد الحضانة ، قم بتشعيعها بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاث دقائق. أضف المخزن المؤقت GTL و proteinase K إلى 20 ملليغرام من مسحوق الغضروف DC-ECM ، واخلطه جيدا باستخدام تذبذب الدوامة.
لإذابة الغضروف بالكامل ، احتضن الخليط عند 56 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بمجرد الدوامة ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحويل الغاز إلى سوائل متبوعا بالإيثانول اللامائي. بعد الدوامة ، قم بطرد العينة عند 6000 جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.
ثم جمع وقياس الحمض النووي كما هو موضح في المخطوطة. لتحليل الكولاجين ، قم بتحمض خمسة ملليغرام من مسحوق DC-ECM في حمض الهيدروكلوريك عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتحييده بخمسة ملليلتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم الستة.
احسب محتوى هيدروكسي برولين للعينة المتعادلة باستخدام الامتصاص عند 570 نانومتر مقابل معيار هيدروكسي برولين. أضف 500 ميكرولتر من الكاشف A إلى 200 ملليغرام من مسحوق DC-ECM بعد الخلط. احتضان العينة عند أربع درجات سلزية لمدة 16 ساعة.
بمجرد الطرد المركزي ، اجمع 50 ميكرولترا من محلول العينة وأضف 50 ميكرولترا من الكاشف B ، متبوعا بالكاشف C.بعد احتضان العينة لمدة 10 دقائق ، أضف 750 ميكرولترا من الكاشف D واحتضانها لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الطرد المركزي ، أضف ميكرولترا واحدا من الكاشف E إلى الحبيبات واخلطه جيدا قبل الطرد المركزي. ثم افصل العينة قبل قياس محتوى GAG.
في غضروف DC-ECM المحضر ، تم التخلص من محتوى الحمض النووي بشكل كبير. ومع ذلك ، تم الاحتفاظ بمحتوى الكولاجين و GAG مقارنة بالغضروف الأصلي. أظهر تحليل SEM و TEM الهيكل الفائق ل DC-ECM المحضر.
لم يتدفق الهيدروجيل المحضر في الأنبوب المقلوب إلى القاع ، مما يدل على الهلام. علاوة على ذلك ، مقارنة بمحلول DC-ECM فقط ، فإن إضافة فيتامين B2 قلل من وقت الهلام بسبب التشابك المستحث أثناء تكوين هيدروجيل DC-ECM. كانت لزوجة هيدروجيل DC-ECM أعلى من لزوجة المحلول وأدت زيادة معدلات القص إلى تقليل لزوجة المحلول.
علاوة على ذلك ، أشار معامل التخزين العالي لمحلول DC-ECM والهيدروجيل إلى أن كلاهما له خصائص هلام بدلا من خصائص سائلة. أظهر تحليل SEM أن حجم المسام لمحلول DC-ECM قد انخفض بشكل ملحوظ في شكل هيدروجيل بعد التشابك والتجفيف بالتجميد. يتضمن البروتوكول مزيجا من الاضطراب الفيزيائي والكيميائي والهضم الأنزيمي لإزالة المواد الخلوية مع الحفاظ على بنية ومحادثة ECM.
