The authors have nothing to disclose.

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للسياسات المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH) التي وافقت عليها لجنة الأخلاق من جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران). 1. الحيوانات والجراحة وعينة الاستعدادات ملاحظة: إعداد أنسجة المخ ل3D التحليل المجهري متحد البؤر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات الانقسام عشوائيا إلى مجموعتين: Aβ 1-40 -injection (ن = 8)، وAβ 1-40 -injection مع العلاج جينيستين (ن = 8)؛ إدارة جينيستين (10 ملغ / كغ المخفف في سيارة مثل polyethoxylated زيت الخروع) بواسطة التغذية الأنبوبية 1 ساعة قبل الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير المناسبة بسبب عدم الانسحاب لا ارادي بعد معسر أخمص قدميه. استخدام مرهم على العينين أثناء الجراحة لمنع جفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوانات في جهاز التجسيمي ورئيس الحلاقة. تطبيق IODالحل المعهد الوطني للإحصاء لتنظيف فروة الرأس قبل شق والحفاظ على موقع عملية عقيمة أثناء الجراحة لتقليل خطر العدوى. حقن Aβ 1-40 stereotaxically (4 ميكرولتر) في قرن آمون في -3.5 ملم الخلفي إلى bregma، ± 2 مم الوحشي على خط الوسط، و-2.8 مم تحت الجافية، وفقا لالفئران أطلس الدماغ 8. لطريقة التجسيمي يرجى الاطلاع على المنشور السابق 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توفير ما بعد الجراحة المراقبة / رعاية حتى الحيوانات واعية تماما لضمان راحة الحيوانات. الحفاظ على الحيوانات دافئة أثناء الانتعاش، وعدم إعادتها إلى قفص مع غيرها من الحيوانات حتى الشفاء التام. إيلاء الاهتمام لأي علامة على الإصابة في الحيوانات بعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات بشدة من الكيتامين (150 ملغ / كلغ) بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة. أداء تثبيت transcardial التي كتبها perfusing الحيوانات مع المياه المالحة 0.9٪ تليها بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 M PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)، ثم إزالة وإصلاح الدماغ كما هو موضح في 10 &lt;/ سوب&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصلاح العقول في 4٪ امتصاص العرق لمدة 2-3 أيام في 4 ج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الأنسجة في كتل البارافين عن طريق استخدام معدات الأنسجة التضمين، وتجنب تحت الحشوة أو الإفراط في ملء الكاسيت لأنها قد تتداخل مع المحاذاة الصحيحة أو التقطيع. إيلاء الاهتمام لاتجاه النسيج في كتلة البارافين. ملاحظة: الحصين الفئران، على سبيل المثال، على مقربة من الخلفية جزء من نصف الكرة المخية. وبالتالي، يجب أن تكون جزءا لا يتجزأ من النسيج بطريقة باجتزاء يبدأ في الخلفية جزء من الدماغ. استخدام الأطلس Paxinos 8 كدليل للوصول إلى التركيب التشريحي المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مشراح بعيدا عن المسودات الهواء أو المداخل منذ التحركات الجوية تجعل التعامل مع أقسام صعبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقاطع بسمك ≥20 ميكرون حيث أن هذا العمق مع تكون ضرورية لإنتاج صور Z-كومة من الخلايا النجمية كاملة. لا تستخدم المقاطع القليلة الأولى، كما قد تكون لديهم سمك غير مرغوب فيه بسبب ه الحراريxpansion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المقاطع على سطح الماء الدافئ (5 ± 2 ج، تحت درجة حرارة انصهار لالبارافين) فترة طويلة بما يكفي لشد الأجزاء. ملاحظة: أكثر من التوسع في القسم يمكن أن يعكر التشكل للهيكل. استخدام الفرشاة الصغيرة لنقل بعناية أقسام. جمع 2-3 أقسام على كل شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر الشرائح في رفوف في وضع مستقيم والسماح لهم الجافة في 37 مئوية لعدة ساعة أو O / N. </li></ol> 2. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize المقاطع في زيلين، 2 × 10 دقيقة، وترطيب من خلال التدرج الكحول (99.8٪، 95٪، و 70٪ و 10 دقيقة لكل منهما) وبرنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة ضد ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) المخفف 1: 1500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.25٪ تريتون X-100 و المصل العادي 3.5٪ (O / N عند 4 ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الفوسفات القلوية مترافق antibodie الثانويالصورة ل1H (1: 100، 21 ج، مخففة في PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق. ملاحظة: من المهم أن يغسل المقاطع بشكل صحيح بعد الأجسام المضادة الثانوية للحد من تلوين الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع في الظلام مع السائل الأحمر الدائم مولد اللون (15-20 دقيقة). ملاحظة: إعداد الحل لا يزيد عن 30 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، وصمة عار على النوى مع 4-6-diamidino-2-phenylindole (دابي؛ 1: 500، مخففة في PBS) قبل الانزلاق تغطية. تخزين الشرائح في الثلاجة 24-48 ساعة قبل الفحص المجهري. </li></ol> 3. متحد البؤر المجهر ملاحظة: للحصول على التقييم الكمي (انظر أدناه)، حدد نجمية مع نواة ملطخة دابي واضحة للعيان مع حد أدنى من تداخل فروع للحد من مخاطر الأخطاء. إنتاج الصور Z-ستاك هو مضيعة للوقت. التحلي بالصبر وعدم التوقف أثناء معالجة. متحد البؤر تستقيم الليزر مجهر المسح هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لخلق صور 3D من الخلايا النجمية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على مرحلة المجهر، وحدد الهدف 63X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برامج التصوير وانقر على نظام ابدأ. انقر فوق علامة التبويب موقع. الذهاب إلى تعيين وتحديد GFP لضبط الضوء المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مصراع لتعكس الضوء. العثور على مسدس العاكس على الجانب الأيمن من مصراع واختيار اللون الذي يجب أن ينعكس النجمية (الأخضر والأحمر أو البنفسجي)؛ وقد استخدم اللون الأحمر (FSet20 WF) هنا. ملاحظة: لا تنس أن التركيز على صورة مباشرة في بصري المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للعثور على أفضل التركيز، انقر على جميع مغلقة، ووضع دبوس المجهر في وضع ملء الشاشة، وانقر فوق علامة التبويب الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على الإعداد الذكي تحت علامة التبويب اكتساب؛ يفتح نافذة. حدد fluorophore المناسب (أي دابي واليكسا فلور 555، في المشروع الحالي) من القائمة. يتم تحديد اللون تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على أفضل إشارة، وتطبيق، ثم انقر على تعيين التعرض؛ وبعد ذلك تعيين الكمبيوتر تلقائيا المعلمات التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحسين الصورة، انتقل إلى إطار القنوات. عدم تحديد Track2، وتسليط الضوء Track1 وانقر على لايف. تركيز الصورة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في إطار القنوات ضبط المفاتيح التالية. انقر على 1AU لتحسين تلقائيا الثقب. من المهم جدا للقيام بهذه الخطوة وإلا الصور مبائر يكون غير الأمثل. ضبط كسب الحصول على أفضل كثافة (الحفاظ على هذا الإعداد دون 800 للحد من الضوضاء إضافية). وأخيرا، تعيين كسب الرقمية بين 2 و 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم تحديد Track1، انقر على Track2 وكرر الخطوة 3.8 لTrack2. ثم توقف لايف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى إطار الوضع الاستحواذ. تحسين صورة عن طريق تحسين الإطار الحجم ومتوسط. من أجل تغيير حجم الإطار يذهب إلى X * Y وحدد 1024 X 1024. اختيار سرعة بطيئة لخلق صورة أفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذهاب إلى المتوسطات وحدد عدد ≥4. هذه القيمة المتوسط ​​يشير إلى عدد المسحات التي سيتم متوسط ​​إلى المنتجالبريد الصورة المكتسبة. الآن انقر على زر المفاجئة، وحفظ الصورة 2D القبض عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصوير 3D، نحتفل في هذا البند Z-المكدس في إطار الإعداد الذكي مما تسبب في نافذة Z-المكدس لفتح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المراكز الأولى والأخيرة لZ-ستاك، أي عمق الخلية. أولا انقر على لايف. ثم استخدم محرك تركيز المجهر التركيز على موقف العلوي من نجمية في الأنسجة، حيث Z-ستاك هو أن تبدأ. انقر على المجموعة الأولى. ثم التركيز وصولا الى أدنى موقف نجمية في الأنسجة، حيث يجب أن يتوقف المسح الضوئي Z-المكدس. انقر على تعيين آخر. ثم توقف لايف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الفاصل. 1.01 ميكرون يستخدم في الدراسة الحالية. ويمكن أن يتم اختيار الفاصل الزمني عن طريق النقر على الأمثل لتعيين عدد من شرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق ابدأ التجربة. حفظ الصور مرة واحدة اكتمال التفحص. وسوف تستخدم هذه الصورة لقياس المعلمات التالية: مساحة وحجم الأراضي نجمية، ونجمية بأكملها بما في ذلك حمالة الصدرnches، خلايا الجسم، والنواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة 2D باستخدام الهدف 10X 20X أو كما هو موضح في خطوات 3،6-3،11. هذه الصورة يمكن أن تستخدم لقياس كثافة مناعية مضان من الأجسام المضادة، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). </li></ol> 4. كثافة نجمية وGFAP + شدة الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصورة 20X 2D. انقر على HISTO (Hisogram) على الجانب الأيسر من نافذة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب كثافة نجمية، حدد ثلاثة حقول بصرية متتالية تحت الهدف 20X. حساب عدد الخلايا النجمية التي تظهر على سوما واضح مع الحد الأدنى، وتداخل فروع في الحقول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس كثافة مضان، حدد أداة مناسبة (مستطيل أو دائرة) على تذييل إطار الصورة، واختيار منطقة لقياس. ملاحظة تظهر قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري تلقائيا تحت الصورة. في الدراسة الحالية، وهو 0.7 مم 2 مساحة مستطيلة بين شارعوقد استخدم iatum وشفرة وسطي من التلفيف المسنن. </li></ol> 5. الفروع نجمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد طول وعدد الفروع، واستخدام الصور 3D (المكتسبة مع 20X) في البرنامج صورة تحليل. رسم خط يدويا على طول كل فرع من فروع نجمية المحدد. ثم حدد قياس أداة متخصصة لقياس خط طول. من أجل تحديد عدد من الفروع، وتحديد عدد أداة لحساب عدد من البنود ملحوظ. </li></ol> 6. حجم ومساحة المبنى ملاحظة: علامات بنية يدويا في 3D تحليل الصور برامج تتطلب التركيز والتدريب. ممارسة عدة مرات قبل بدء التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية النواة، سوما، خلايا الجسم والأرض، ونقل صور 3D (المكتسبة في خطوات 3،1 حتي 3،16) إلى صورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج وخلق جديدمكتبة. سحب جميع الصور إلى العمود الرمادي اليسار في مكتبة جديدة. ثم، حدد صورة واحدة 3D. على اليمين، وهناك قنوات مختلفة بألوان مختلفة. تشغيل قناة واحدة من الفائدة؛ على سبيل المثال القناة الزرقاء للدابي عند قياس النواة. تغيير سطوع يدويا للحصول على النقيض الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر من القائمة أدوات، انتقل إلى جعل حجم وإنتاج صورة 3D واحدة من الصور Z-المكدس. انقر على خصائص في القائمة تحرير ومما لا شك فيه أن X، Y وترد Z خصائص. وإلا فإنه من المستحيل إجراء تحليل 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على أيقونة الأداة حر RIO في شريط الأدوات. لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية نواة رسم خط حول النواة المسمى دابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية خلايا الجسم رسم خط حول سوما باستثناء الفروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية كامل (خلايا الجسم بما في ذلك فروع) رسم خط حول سوما بعدسطح كل الفروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم حجم والمساحة السطحية للأراضي نجمية رسم الخط الفاصل بين نصائح من الفروع. ملاحظة: اضغط حذف على لوحة المفاتيح لمحو رسومات غير المرغوب فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على قائمة القياسات في الجزء العلوي من الصورة نافذة لإنشاء بروتوكول القياس؛ يفتح نافذة تحتوي على أدوات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السحب إيجاد الكائنات إلى أعلى النافذة (جزء). إعطاء اسم وصفي للسكان 1، حدد اللون المرتبطة بها، وانقر على التدبير. يفتح نافذة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المنطقة أي معلمة، وحجم أو السطح. انقر على OK. سوف تظهر البيانات في الجدول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ النقر البيانات في القائمة قياس وتحديد إجراء القياس البند. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عنصر قياس جديد يسمى من نافذة فتحها. ثم إعطاء اسم للبيانات وانقر على OK. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، تصدير البيانات إلى برنامج إحصاءات مثل لوحة الرسم البياني أو برنامج اكسل. استخدام اختبار (ت) لتحليل البيانات، ثم رسم 2D غرامaphs. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مجلس مقاطعة Östergötland، (السويد) والخلوية ومركز الأبحاث الجزيئية في جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران).

في البروتوكول الحالي، نحن العاملين 3D قياس الأشكال متحد البؤر لتقييم 12 المعلمات المختلفة التي ارتبطت نجمية التشكل. لهذا الغرض، والأنسجة قرن آمون من الفئران مع Aβ 1-40 - استخدمت دباق النجمي التي يسببها، مع أو بدون المعالجة جينيستين كعامل مضاد للالتهابات. باستخدام ?...

في صحي الجهاز العصبي المركزي (CNS)، النجمية تلعب دورا هاما في تنظيم تدفق الدم، واستقلاب الطاقة، وظيفة متشابك واللدونة، والأيونات خارج الخلية والعصبي التوازن 1-3. بالإضافة إلى ذلك، النجمية تستجيب للمؤثرات الضارة المختلفة وظروف غير طبيعية مثل الصدمات النفسية، والعدوى، ونقص التروية أو التنكس العصبي عن طريق رد الفعل دباق النجمي الذي يتميز تضخم وانتشارها وإعادة عرض وظيفي من الخلايا النجمية 4،5. دباق النجمي رد الفعل يمكن أن مهندس الاستجابة الالتهابية وعملية الإصلاح في الأنسجة، وبالتالي، يمكن أن تؤثر على النتائج السريرية من التدخلات العلاجية. وفقا لذلك، وتلقى اهتماما من الخلايا النجمية الأعصاب خلال العقود الماضية كأهداف محتملة للتدخلات العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. الخلايا النجمية وعادة ما يكون شكل النجمية مع د جيدافروع efined التي تنتشر في جميع أنحاء سوما 6. في حالة المريضة في الدماغ، وفروع نجمية تصبح معقدة وتظهر نهايات منتفخة 7، على سبيل المثال في وجود بيتا اميلويد (Aβ). تقدم هذه المقالة بروتوكول لتحليل الصور 3D من الخلايا النجمية التي حصل عليها المجهر متحد البؤر. تم قياس اثني عشر المعلمات كمية مختلفة لكل نجمية: المناطق السطحية ومجلدات من الأراضي نجمية (الأنسجة من قبل نجمية المغطاة)، الخلية بأكملها (بما في ذلك فروع)، خلايا الجسم، والنواة. ويبلغ طول وعدد من الفروع؛ كثافة مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية. وكثافة الخلايا النجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض، وكنا أقسام الدماغ من الفئران التي عرضت لintrahippocampal حقن Aβ 1-40 مع أو بدون العلاج جينيستين باعتباره مادة مضادة للالتهابات. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لالمورفومترية لalysis من أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي في ظروف مختلفة.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

كما الخلايا الدبقية في الدماغ، الخلايا النجمية لها أدوار وظيفية متنوعة في الجهاز العصبي المركزي. في ظل وجود مؤثرات الضارة، النجمية تعديل خصائصها الوظيفية والهيكلية، وهي حالة تسمى دباق النجمي رد الفعل. هنا، يتم تقديم بروتوكول للتقييم الخصائص المورفولوجية من الخلايا النجمية. ويشمل هذا البروتوكول الكمي من 12 معلمات مختلفة أي مساحة وحجم الأنسجة من قبل (إقليم نجمية) نجمية المشمولة، ونجمية بأكملها بما في ذلك الفروع، وخلايا الجسم، والنواة، وكذلك الطول الإجمالي وعدد من الفروع، وشدة من مناعية مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض تم إنشاء ثلاثية الأبعاد (3D) الصور المجهرية مبائر، وصورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.3 كان يستخدم لقياس. أنسجة المخ الفئران المعرضة للاميلويد بيتا 1-40 </واستخدمت الفرعية&gt; (Aβ 1-40) مع أو بدون تدخل علاجي لتقديم الأسلوب. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها ل3D تحليل المورفومترية من الخلايا الأخرى في الجسم الحي من أي أو في ظروف المختبر.

يعرض هذا القسم بعض الأمثلة من الملاحظات النوعية والكمية التي تنتجها تحليل المورفومترية 3D. للحصول على نتائج كاملة لجميع المعلمات 12 المذكورة سابقا، يرجى الاطلاع على المنشور السابق 10. ملاحظات النوعية <p class="jove_content" style=";text-ali...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Video: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

المورفومترية التحليلات من أقسام الشبكية

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

تشريح والثقافة من الدوبامين والفأر Explants العقدة المخططة في ثلاثي الأبعاد فحوصات مصفوفة الكولاجين

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

بروتوكول الحليمات دنفر للتحليل الموضوعي لكمئي الحليمات

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

نمذجة الاشكال ثلاثية الابعاد وتحليل هياكل المخ

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.