The authors have nothing to disclose.

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للسياسات المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH) التي وافقت عليها لجنة الأخلاق من جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران). 1. الحيوانات والجراحة وعينة الاستعدادات ملاحظة: إعداد أنسجة المخ ل3D التحليل المجهري متحد البؤر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات الانقسام عشوائيا إلى مجموعتين: Aβ 1-40 -injection (ن = 8)، وAβ 1-40 -injection مع العلاج جينيستين (ن = 8)؛ إدارة جينيستين (10 ملغ / كغ المخفف في سيارة مثل polyethoxylated زيت الخروع) بواسطة التغذية الأنبوبية 1 ساعة قبل الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير المناسبة بسبب عدم الانسحاب لا ارادي بعد معسر أخمص قدميه. استخدام مرهم على العينين أثناء الجراحة لمنع جفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوانات في جهاز التجسيمي ورئيس الحلاقة. تطبيق IODالحل المعهد الوطني للإحصاء لتنظيف فروة الرأس قبل شق والحفاظ على موقع عملية عقيمة أثناء الجراحة لتقليل خطر العدوى. حقن Aβ 1-40 stereotaxically (4 ميكرولتر) في قرن آمون في -3.5 ملم الخلفي إلى bregma، ± 2 مم الوحشي على خط الوسط، و-2.8 مم تحت الجافية، وفقا لالفئران أطلس الدماغ 8. لطريقة التجسيمي يرجى الاطلاع على المنشور السابق 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توفير ما بعد الجراحة المراقبة / رعاية حتى الحيوانات واعية تماما لضمان راحة الحيوانات. الحفاظ على الحيوانات دافئة أثناء الانتعاش، وعدم إعادتها إلى قفص مع غيرها من الحيوانات حتى الشفاء التام. إيلاء الاهتمام لأي علامة على الإصابة في الحيوانات بعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات بشدة من الكيتامين (150 ملغ / كلغ) بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة. أداء تثبيت transcardial التي كتبها perfusing الحيوانات مع المياه المالحة 0.9٪ تليها بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 M PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4)، ثم إزالة وإصلاح الدماغ كما هو موضح في 10 &lt;/ سوب&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصلاح العقول في 4٪ امتصاص العرق لمدة 2-3 أيام في 4 ج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الأنسجة في كتل البارافين عن طريق استخدام معدات الأنسجة التضمين، وتجنب تحت الحشوة أو الإفراط في ملء الكاسيت لأنها قد تتداخل مع المحاذاة الصحيحة أو التقطيع. إيلاء الاهتمام لاتجاه النسيج في كتلة البارافين. ملاحظة: الحصين الفئران، على سبيل المثال، على مقربة من الخلفية جزء من نصف الكرة المخية. وبالتالي، يجب أن تكون جزءا لا يتجزأ من النسيج بطريقة باجتزاء يبدأ في الخلفية جزء من الدماغ. استخدام الأطلس Paxinos 8 كدليل للوصول إلى التركيب التشريحي المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مشراح بعيدا عن المسودات الهواء أو المداخل منذ التحركات الجوية تجعل التعامل مع أقسام صعبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقاطع بسمك ≥20 ميكرون حيث أن هذا العمق مع تكون ضرورية لإنتاج صور Z-كومة من الخلايا النجمية كاملة. لا تستخدم المقاطع القليلة الأولى، كما قد تكون لديهم سمك غير مرغوب فيه بسبب ه الحراريxpansion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المقاطع على سطح الماء الدافئ (5 ± 2 ج، تحت درجة حرارة انصهار لالبارافين) فترة طويلة بما يكفي لشد الأجزاء. ملاحظة: أكثر من التوسع في القسم يمكن أن يعكر التشكل للهيكل. استخدام الفرشاة الصغيرة لنقل بعناية أقسام. جمع 2-3 أقسام على كل شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر الشرائح في رفوف في وضع مستقيم والسماح لهم الجافة في 37 مئوية لعدة ساعة أو O / N. </li></ol> 2. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize المقاطع في زيلين، 2 × 10 دقيقة، وترطيب من خلال التدرج الكحول (99.8٪، 95٪، و 70٪ و 10 دقيقة لكل منهما) وبرنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة ضد ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) المخفف 1: 1500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.25٪ تريتون X-100 و المصل العادي 3.5٪ (O / N عند 4 ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الفوسفات القلوية مترافق antibodie الثانويالصورة ل1H (1: 100، 21 ج، مخففة في PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق. ملاحظة: من المهم أن يغسل المقاطع بشكل صحيح بعد الأجسام المضادة الثانوية للحد من تلوين الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقاطع في الظلام مع السائل الأحمر الدائم مولد اللون (15-20 دقيقة). ملاحظة: إعداد الحل لا يزيد عن 30 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 3 × 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، وصمة عار على النوى مع 4-6-diamidino-2-phenylindole (دابي؛ 1: 500، مخففة في PBS) قبل الانزلاق تغطية. تخزين الشرائح في الثلاجة 24-48 ساعة قبل الفحص المجهري. </li></ol> 3. متحد البؤر المجهر ملاحظة: للحصول على التقييم الكمي (انظر أدناه)، حدد نجمية مع نواة ملطخة دابي واضحة للعيان مع حد أدنى من تداخل فروع للحد من مخاطر الأخطاء. إنتاج الصور Z-ستاك هو مضيعة للوقت. التحلي بالصبر وعدم التوقف أثناء معالجة. متحد البؤر تستقيم الليزر مجهر المسح هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لخلق صور 3D من الخلايا النجمية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على مرحلة المجهر، وحدد الهدف 63X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح برامج التصوير وانقر على نظام ابدأ. انقر فوق علامة التبويب موقع. الذهاب إلى تعيين وتحديد GFP لضبط الضوء المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مصراع لتعكس الضوء. العثور على مسدس العاكس على الجانب الأيمن من مصراع واختيار اللون الذي يجب أن ينعكس النجمية (الأخضر والأحمر أو البنفسجي)؛ وقد استخدم اللون الأحمر (FSet20 WF) هنا. ملاحظة: لا تنس أن التركيز على صورة مباشرة في بصري المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للعثور على أفضل التركيز، انقر على جميع مغلقة، ووضع دبوس المجهر في وضع ملء الشاشة، وانقر فوق علامة التبويب الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على الإعداد الذكي تحت علامة التبويب اكتساب؛ يفتح نافذة. حدد fluorophore المناسب (أي دابي واليكسا فلور 555، في المشروع الحالي) من القائمة. يتم تحديد اللون تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على أفضل إشارة، وتطبيق، ثم انقر على تعيين التعرض؛ وبعد ذلك تعيين الكمبيوتر تلقائيا المعلمات التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحسين الصورة، انتقل إلى إطار القنوات. عدم تحديد Track2، وتسليط الضوء Track1 وانقر على لايف. تركيز الصورة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في إطار القنوات ضبط المفاتيح التالية. انقر على 1AU لتحسين تلقائيا الثقب. من المهم جدا للقيام بهذه الخطوة وإلا الصور مبائر يكون غير الأمثل. ضبط كسب الحصول على أفضل كثافة (الحفاظ على هذا الإعداد دون 800 للحد من الضوضاء إضافية). وأخيرا، تعيين كسب الرقمية بين 2 و 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم تحديد Track1، انقر على Track2 وكرر الخطوة 3.8 لTrack2. ثم توقف لايف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى إطار الوضع الاستحواذ. تحسين صورة عن طريق تحسين الإطار الحجم ومتوسط. من أجل تغيير حجم الإطار يذهب إلى X * Y وحدد 1024 X 1024. اختيار سرعة بطيئة لخلق صورة أفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذهاب إلى المتوسطات وحدد عدد ≥4. هذه القيمة المتوسط ​​يشير إلى عدد المسحات التي سيتم متوسط ​​إلى المنتجالبريد الصورة المكتسبة. الآن انقر على زر المفاجئة، وحفظ الصورة 2D القبض عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصوير 3D، نحتفل في هذا البند Z-المكدس في إطار الإعداد الذكي مما تسبب في نافذة Z-المكدس لفتح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المراكز الأولى والأخيرة لZ-ستاك، أي عمق الخلية. أولا انقر على لايف. ثم استخدم محرك تركيز المجهر التركيز على موقف العلوي من نجمية في الأنسجة، حيث Z-ستاك هو أن تبدأ. انقر على المجموعة الأولى. ثم التركيز وصولا الى أدنى موقف نجمية في الأنسجة، حيث يجب أن يتوقف المسح الضوئي Z-المكدس. انقر على تعيين آخر. ثم توقف لايف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الفاصل. 1.01 ميكرون يستخدم في الدراسة الحالية. ويمكن أن يتم اختيار الفاصل الزمني عن طريق النقر على الأمثل لتعيين عدد من شرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق ابدأ التجربة. حفظ الصور مرة واحدة اكتمال التفحص. وسوف تستخدم هذه الصورة لقياس المعلمات التالية: مساحة وحجم الأراضي نجمية، ونجمية بأكملها بما في ذلك حمالة الصدرnches، خلايا الجسم، والنواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة 2D باستخدام الهدف 10X 20X أو كما هو موضح في خطوات 3،6-3،11. هذه الصورة يمكن أن تستخدم لقياس كثافة مناعية مضان من الأجسام المضادة، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). </li></ol> 4. كثافة نجمية وGFAP + شدة الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصورة 20X 2D. انقر على HISTO (Hisogram) على الجانب الأيسر من نافذة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب كثافة نجمية، حدد ثلاثة حقول بصرية متتالية تحت الهدف 20X. حساب عدد الخلايا النجمية التي تظهر على سوما واضح مع الحد الأدنى، وتداخل فروع في الحقول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس كثافة مضان، حدد أداة مناسبة (مستطيل أو دائرة) على تذييل إطار الصورة، واختيار منطقة لقياس. ملاحظة تظهر قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري تلقائيا تحت الصورة. في الدراسة الحالية، وهو 0.7 مم 2 مساحة مستطيلة بين شارعوقد استخدم iatum وشفرة وسطي من التلفيف المسنن. </li></ol> 5. الفروع نجمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد طول وعدد الفروع، واستخدام الصور 3D (المكتسبة مع 20X) في البرنامج صورة تحليل. رسم خط يدويا على طول كل فرع من فروع نجمية المحدد. ثم حدد قياس أداة متخصصة لقياس خط طول. من أجل تحديد عدد من الفروع، وتحديد عدد أداة لحساب عدد من البنود ملحوظ. </li></ol> 6. حجم ومساحة المبنى ملاحظة: علامات بنية يدويا في 3D تحليل الصور برامج تتطلب التركيز والتدريب. ممارسة عدة مرات قبل بدء التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية النواة، سوما، خلايا الجسم والأرض، ونقل صور 3D (المكتسبة في خطوات 3،1 حتي 3،16) إلى صورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج وخلق جديدمكتبة. سحب جميع الصور إلى العمود الرمادي اليسار في مكتبة جديدة. ثم، حدد صورة واحدة 3D. على اليمين، وهناك قنوات مختلفة بألوان مختلفة. تشغيل قناة واحدة من الفائدة؛ على سبيل المثال القناة الزرقاء للدابي عند قياس النواة. تغيير سطوع يدويا للحصول على النقيض الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر من القائمة أدوات، انتقل إلى جعل حجم وإنتاج صورة 3D واحدة من الصور Z-المكدس. انقر على خصائص في القائمة تحرير ومما لا شك فيه أن X، Y وترد Z خصائص. وإلا فإنه من المستحيل إجراء تحليل 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على أيقونة الأداة حر RIO في شريط الأدوات. لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية نواة رسم خط حول النواة المسمى دابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية خلايا الجسم رسم خط حول سوما باستثناء الفروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حجم والمساحة السطحية للنجمية كامل (خلايا الجسم بما في ذلك فروع) رسم خط حول سوما بعدسطح كل الفروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم حجم والمساحة السطحية للأراضي نجمية رسم الخط الفاصل بين نصائح من الفروع. ملاحظة: اضغط حذف على لوحة المفاتيح لمحو رسومات غير المرغوب فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على قائمة القياسات في الجزء العلوي من الصورة نافذة لإنشاء بروتوكول القياس؛ يفتح نافذة تحتوي على أدوات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السحب إيجاد الكائنات إلى أعلى النافذة (جزء). إعطاء اسم وصفي للسكان 1، حدد اللون المرتبطة بها، وانقر على التدبير. يفتح نافذة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المنطقة أي معلمة، وحجم أو السطح. انقر على OK. سوف تظهر البيانات في الجدول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ النقر البيانات في القائمة قياس وتحديد إجراء القياس البند. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عنصر قياس جديد يسمى من نافذة فتحها. ثم إعطاء اسم للبيانات وانقر على OK. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، تصدير البيانات إلى برنامج إحصاءات مثل لوحة الرسم البياني أو برنامج اكسل. استخدام اختبار (ت) لتحليل البيانات، ثم رسم 2D غرامaphs. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مجلس مقاطعة Östergötland، (السويد) والخلوية ومركز الأبحاث الجزيئية في جامعة ايران للعلوم الطبية (طهران، إيران).

في البروتوكول الحالي، نحن العاملين 3D قياس الأشكال متحد البؤر لتقييم 12 المعلمات المختلفة التي ارتبطت نجمية التشكل. لهذا الغرض، والأنسجة قرن آمون من الفئران مع Aβ 1-40 - استخدمت دباق النجمي التي يسببها، مع أو بدون المعالجة جينيستين كعامل مضاد للالتهابات. باستخدام ?...

في صحي الجهاز العصبي المركزي (CNS)، النجمية تلعب دورا هاما في تنظيم تدفق الدم، واستقلاب الطاقة، وظيفة متشابك واللدونة، والأيونات خارج الخلية والعصبي التوازن 1-3. بالإضافة إلى ذلك، النجمية تستجيب للمؤثرات الضارة المختلفة وظروف غير طبيعية مثل الصدمات النفسية، والعدوى، ونقص التروية أو التنكس العصبي عن طريق رد الفعل دباق النجمي الذي يتميز تضخم وانتشارها وإعادة عرض وظيفي من الخلايا النجمية 4،5. دباق النجمي رد الفعل يمكن أن مهندس الاستجابة الالتهابية وعملية الإصلاح في الأنسجة، وبالتالي، يمكن أن تؤثر على النتائج السريرية من التدخلات العلاجية. وفقا لذلك، وتلقى اهتماما من الخلايا النجمية الأعصاب خلال العقود الماضية كأهداف محتملة للتدخلات العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. الخلايا النجمية وعادة ما يكون شكل النجمية مع د جيدافروع efined التي تنتشر في جميع أنحاء سوما 6. في حالة المريضة في الدماغ، وفروع نجمية تصبح معقدة وتظهر نهايات منتفخة 7، على سبيل المثال في وجود بيتا اميلويد (Aβ). تقدم هذه المقالة بروتوكول لتحليل الصور 3D من الخلايا النجمية التي حصل عليها المجهر متحد البؤر. تم قياس اثني عشر المعلمات كمية مختلفة لكل نجمية: المناطق السطحية ومجلدات من الأراضي نجمية (الأنسجة من قبل نجمية المغطاة)، الخلية بأكملها (بما في ذلك فروع)، خلايا الجسم، والنواة. ويبلغ طول وعدد من الفروع؛ كثافة مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية. وكثافة الخلايا النجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض، وكنا أقسام الدماغ من الفئران التي عرضت لintrahippocampal حقن Aβ 1-40 مع أو بدون العلاج جينيستين باعتباره مادة مضادة للالتهابات. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لالمورفومترية لalysis من أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي في ظروف مختلفة.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

كما الخلايا الدبقية في الدماغ، الخلايا النجمية لها أدوار وظيفية متنوعة في الجهاز العصبي المركزي. في ظل وجود مؤثرات الضارة، النجمية تعديل خصائصها الوظيفية والهيكلية، وهي حالة تسمى دباق النجمي رد الفعل. هنا، يتم تقديم بروتوكول للتقييم الخصائص المورفولوجية من الخلايا النجمية. ويشمل هذا البروتوكول الكمي من 12 معلمات مختلفة أي مساحة وحجم الأنسجة من قبل (إقليم نجمية) نجمية المشمولة، ونجمية بأكملها بما في ذلك الفروع، وخلايا الجسم، والنواة، وكذلك الطول الإجمالي وعدد من الفروع، وشدة من مناعية مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض تم إنشاء ثلاثية الأبعاد (3D) الصور المجهرية مبائر، وصورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.3 كان يستخدم لقياس. أنسجة المخ الفئران المعرضة للاميلويد بيتا 1-40 </واستخدمت الفرعية&gt; (Aβ 1-40) مع أو بدون تدخل علاجي لتقديم الأسلوب. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها ل3D تحليل المورفومترية من الخلايا الأخرى في الجسم الحي من أي أو في ظروف المختبر.

يعرض هذا القسم بعض الأمثلة من الملاحظات النوعية والكمية التي تنتجها تحليل المورفومترية 3D. للحصول على نتائج كاملة لجميع المعلمات 12 المذكورة سابقا، يرجى الاطلاع على المنشور السابق 10. ملاحظات النوعية <p class="jove_content" style=";text-ali...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Video: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biology

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

تحليل في الحجم والشكل واتجاهية شبكات من أستروسيتيس إلى جانب

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

في Electroporation الرحمية من متعدد الجينوم التكامل اللون (السحر) علامات لفردية استروقراط الماوس القشرية

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة الواضحة

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
This video ...