The authors have nothing to disclose.

Questo studio è stato condotto in conformità con le politiche contenute nel Manuale per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (NIH) approvate dal Comitato Etico dell&#39;Iran dell&#39;Università di Scienze Mediche (Teheran, Iran). 1. Gli animali, Chirurgia e campioni preparati NOTA: Preparare il tessuto cerebrale per il 3D confocale analisi microscopica. <ol><li> Animali Dividere casualmente in due gruppi: Ap 1-40 -injection (n = 8), e Ap 1-40 -injection con trattamento genisteina (n = 8); amministrare genisteina (10 mg / kg diluito in un veicolo come olio di ricino polietossilato) mediante sonda gastrica 1 ora prima dell&#39;intervento chirurgico. </li><li> Anestetizzare gli animali con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Verificare il corretto anestesia dalla mancanza di recesso reflex dopo la presa la punta. Usare pomata sugli occhi durante l&#39;intervento chirurgico per prevenire la secchezza. </li><li> Mettere animali in apparato stereotassico e la testa rasatura. Applicare iodsoluzione ine per pulire il cuoio capelluto prima incisione e mantenere il sito dell&#39;operazione sterile durante l&#39;intervento chirurgico per ridurre il rischio di infezione. Iniettare Ap 1-40 stereotassica (4 pl) nell&#39;ippocampo a -3.5 mm posteriormente al bregma, ± 2 mm lateralmente alla linea mediana, e -2.8 mm al di sotto dura, secondo ratto cervello atlante 8. Per il metodo stereotassico consultare pubblicazione precedente 9. </li><li> Fornire post-operatorio di osservazione / cura fino a quando gli animali sono pienamente consapevoli per garantire il comfort degli animali. Tenere gli animali al caldo durante il recupero, e non li tornare a una gabbia con altri animali fino al pieno recupero. Prestare attenzione a eventuali segni di infezione negli animali dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Anestetizzare gli animali profondamente da ketamina (150 mg / kg) tre settimane dopo l&#39;intervento. Eseguire la fissazione transcardial mediante perfusione degli animali con soluzione fisiologica 0,9% seguito dal 4% paraformaldeide in 0,1 M PBS (pH = 7,4), quindi rimuovere e riparare il cervello come descritto in 10 &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fissare i cervelli in paraformaldeide al 4% per 2-3 giorni a 4 ° C. </li><li> Incorpora il tessuto in blocchi di paraffina mediante l&#39;uso di apparecchiature tessuti embedding, ed evitare di sotto-riempimento o over-riempire la cassetta in quanto potrebbe interferire con il corretto allineamento o sezionamento. Fare attenzione all&#39;orientamento del tessuto nel blocco di paraffina. NOTA: L&#39;ippocampo di ratto, per esempio, si trova vicino al posteriore parte dell&#39;emisfero cerebrale. Pertanto, il tessuto deve essere incorporato in modo che inizia il sezionamento a posteriori parte del cervello. Utilizzare l&#39;atlante Paxinos 8 come guida per raggiungere la struttura anatomica desiderata. </li><li> Posizionare il microtomo lontano da correnti d&#39;aria o porte da movimenti d&#39;aria rendono la gestione delle sezioni difficili. </li><li> Utilizzare le sezioni con uno spessore ≥20 micron a questo fondo con essere necessario per produrre immagini Z-Stack di astrociti complete. Non utilizzare i primi due sezioni, in quanto potrebbero avere spessore indesiderata causa e termicoXpansion. </li><li> Posizionare le sezioni sulla superficie di acqua calda (5 ± 2 C, al di sotto della temperatura di fusione per paraffina) il tempo sufficiente per appiattire sezioni. NOTA: Oltre espansione della sezione può disturbare la morfologia della struttura. Utilizzare piccolo pennello per trasferire accuratamente sezioni. Raccogliere due o tre sezioni su ogni diapositiva. </li><li> Conservare i vetrini in un rack in posizione verticale e lasciarle asciugare a 37 ° C per diverse ore o O / N. </li></ol> 2. immunoistochimica <ol><li> Deparaffinare sezioni in xilene, 2 x 10 min, e reidratare attraverso gradiente alcol (99,8%, 95% e 70%, 10 minuti ciascuna) e PBS. </li><li> Incubare con anticorpi contro la proteina gliale fibrillare acida (GFAP) diluito 1: 1500 in PBS contenente 0,25% di albumina di siero bovino (BSA), 0,25% Triton X-100 e siero normale 3,5% (O / N a 4 ° C). </li><li> Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min. </li><li> Incubare con alcaline antibodie fosfato-coniugato secondarios per 1h (1: 100, 21 C, diluito in PBS). </li><li> Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min. NOTA: E &#39;importante lavare sezioni correttamente dopo anticorpi secondari per ridurre al minimo la colorazione di fondo. </li><li> Incubare sezioni in oscurità con Liquid Permanent Red Cromogeno (15-20 minuti). Nota: Preparare la soluzione non più di 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min. </li><li> Infine, macchiare i nuclei con 4-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1: 500, diluito in PBS) prima di coprire antiscivolo. Conservare i vetrini in frigorifero 24-48 ore prima di microscopia. </li></ol> 3. Microscopia confocale NOTA: Per la valutazione quantitativa (vedi sotto), selezionare un astrociti con un nucleo DAPI tinto chiaramente visibile con un minimo di sovrapposizione rami per ridurre il rischio di errori. Producendo immagini Z-Stack è molto tempo. Siate pazienti e non si fermano durante la lavorazione. Laser confocale microscopio a scansione verticale è used per creare immagini 3D da astrociti. <ol><li> Mettere il vetrino sul microscopio palco, e selezionare l&#39;obiettivo 63x. </li><li> Aprire il software di imaging e fare clic sul sistema Start. Fare clic sulla scheda Locate. Vai a assegnare e selezionare GFP per regolare la giusta luce. </li><li> Aprire l&#39;otturatore per riflettere la luce. Trova il riflettore Revolver sul lato destro di Shutter e scegliere il colore che dovrebbe essere riflessa da astrociti (verde, rosso o viola); colore rosso (FSet20 wf) è stato utilizzato qui. NOTA: Non dimenticate di mettere a fuoco l&#39;immagine direttamente nel oculare del microscopio. </li><li> Per trovare la migliore messa a fuoco, fare clic su All chiuso, mettere il perno microscopio in modalità a schermo, e fare clic sulla scheda di acquisizione. </li><li> Clicca su Smart Setup nella scheda di acquisizione; apre una finestra. Selezionare il fluoroforo corretto (cioè DAPI e Alexa Fluor 555, nel progetto attuale) dalla lista. Il colore viene selezionato automaticamente. </li><li> Clicca su Best segnale, e su Applica, quindi fare clic su Imposta Esposizione; il computer sarà quindi impostare automaticamente i parametri di esposizione. </li><li> Per ottimizzare l&#39;immagine, passare alla finestra Canali. Deselez Track2, evidenziare Track1 e fare clic su Live. Mettere a fuoco l&#39;immagine, se necessario. </li><li> Nella finestra Canali regolare le seguenti chiavi; cliccare su 1AU per ottimizzare automaticamente il foro stenopeico. E &#39;molto importante fare questo passo altrimenti le immagini confocale saranno non ottimale. Regolare il guadagno di avere la migliore intensità (mantenere questa impostazione non superiore a 800 per ridurre il rumore extra). Infine, impostare il guadagno digitale tra 2 e 3. </li><li> Deselez Track1, cliccare su Track2 e ripetere il punto 3.8 per Track2. Poi fermare Live. </li><li> Andare alla finestra Modalità di acquisizione. Migliorare l&#39;immagine ottimizzando Frame Size e una media di. Per cambiare dimensione del frame andare a X * Y e selezionare 1.024 x 1.024. Scegli una bassa velocità per creare una migliore immagine. </li><li> Vai a della media e selezionare un numero di ≥4. Questo valore indica la media del numero di scansioni che saranno mediati per PRODUCvia e l&#39;immagine acquisita. Ora cliccate sul pulsante di scatto, e salvare l&#39;immagine 2D catturata. </li><li> Per l&#39;imaging 3D, contrassegnare l&#39;elemento Z-Stack sotto Smart Setup causando la finestra di Z-Stack per aprire. </li><li> Impostare la prima e l&#39;ultima di Z-Stack, cioè la profondità della cella. Prima clicca su Live. Quindi utilizzare l&#39;unità di messa a fuoco del microscopio di concentrarsi sulla posizione più alta di astrociti nel tessuto, dove la Z-Stack è quello di iniziare. Clicca su Imposta prima. Poi fuoco fino alla posizione più bassa del astrociti nel tessuto, dove scansione Z-Stack deve essere interrotto. Clicca su Imposta Ultimo. Poi fermare Live. </li><li> Scegliere l&#39;intervallo; 1.01 micron viene utilizzato in questo studio; Intervallo di scelta può essere fatta cliccando su ottimale per impostare il numero di fette. </li><li> Fare clic su Start Experiment. Salvare le immagini una volta che la scansione è completata. Questa immagine verrà utilizzata per la misura dei seguenti parametri: area superficiale e volume del territorio astrociti, il reggiseno intera astrociti compresonches, corpo cellulare, e il nucleo. </li><li> Acquisire un&#39;immagine 2D utilizzando un obiettivo 10X o 20X come descritto nei passaggi 3.6-3.11. Questa immagine può essere usata per la misura l&#39;intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron 2). </li></ol> 4. astrociti Densità e GFAP + fluorescenza intensità <ol><li> Aprite l&#39;immagine 20X 2D. Clicca su Histo (Hisogram) sul lato sinistro della finestra dell&#39;immagine. </li><li> Per calcolare la densità astrociti, selezionare tre campi visivi consecutivi sotto obiettivo 20X. Contare il numero di astrociti che presentano un chiaro soma con un minimo, filiali nei campi si sovrappongono. </li><li> Per quantificare l&#39;intensità di fluorescenza, selezionare uno strumento adeguato (rettangolo o un cerchio) sul footer della finestra dell&#39;immagine, e scegliere una zona per la misurazione. Nota il valore medio e la deviazione standard vengono visualizzati automaticamente sotto l&#39;immagine. In questo studio, un&#39;area rettangolare 0,7 millimetri 2 tra strè stato utilizzato iatum e lama mediale del giro dentato. </li></ol> 5. Filiali astrociti <ol><li> Per quantificare la lunghezza e il numero complessivo delle filiali, utilizzare le immagini 3D (acquisite con 20X) nel software di analisi dell&#39;immagine. Tracciare una linea manualmente lungo la lunghezza di ogni ramo del astrociti selezionato. Quindi selezionare la misura, strumento che è specializzata per misurare la linea di lunghezza. Al fine di quantificare il numero di rami, selezionare il numero di utensili per contare il numero di elementi selezionati. </li></ol> 6. Volume e Superficie NOTA: Marcatura una struttura manualmente in software di analisi dell&#39;immagine 3D richiede concentrazione e la formazione. Pratica più volte prima di iniziare un esperimento. <ol><li> Per quantificare il volume e la superficie del astrociti nucleo, soma, corpo cellulare e territorio, trasferire le immagini 3D (acquisite nei passaggi 3.1-3.16) per una immagine software di analisi 3D come Volocity 6.1. </li><li> Aprire il software e creare un nuovobiblioteca. Trascinare tutte le immagini alla colonna grigia a sinistra nella nuova libreria. Quindi, selezionare un&#39;immagine 3D. Sulla destra, esistono diversi canali con colori diversi. Attivare un canale di interesse; per esempio, il canale blu per DAPI quando si misura il nucleo. Modificare la luminosità manualmente per ottenere un contrasto ottimale. </li><li> Selezionare il menu Strumenti, andare a fare Volume e produrre una singola immagine 3D di immagini Z-stack. Fare clic su Proprietà nel menu Modifica e assicurarsi che X, Y e Z proprietà sono presentati; altrimenti è impossibile effettuare analisi 3D. </li><li> Clicca su Freehand sull&#39;icona strumento RIO nella barra degli strumenti. Per misurare il volume e la superficie di astrociti nucleo tracciare una linea intorno al nucleo DAPI marcato. </li><li> Per misurare il volume e la superficie del corpo cellulare astrociti tracciare una linea intorno alla soma escluso rami. </li><li> Per misurare il volume e la superficie di tutto il astrociti (corpo cellulare incluse le filiali) tracciare una linea intorno alla soma in seguito allala superficie di tutte le filiali. </li><li> Per valutare il volume e la superficie di territorio astrociti tracciare una linea tra le punte dei rami. NOTA: Premere il tasto Canc sulla tastiera per cancellare disegni indesiderati. </li><li> Fare clic sul menu Misurazioni nella parte superiore della finestra dell&#39;immagine per creare un protocollo di misura; Si apre una finestra contenente diversi strumenti. </li><li> Trascinare Trova oggetti alla parte superiore della finestra (riquadro). Dare un nome descrittivo per la popolazione 1, selezionare il colore associato e fare clic su Misura. Si apre un&#39;altra finestra. </li><li> Scegliere una zona parametro vale a dire, il volume o di superficie. Fare clic su OK. I dati vengono visualizzati in una tabella. </li><li> Per salvare i dati, fare clic sul menu di misura e selezionare Rendi Misura dell&#39;articolo. </li><li> Selezionare un nuovo elemento di misura chiamato dalla finestra aperta. Poi dare un nome ai dati e fare clic su OK. </li><li> Infine, esportare i dati al software statistiche come pad grafico o excel programma. Usa t-test per analizzare i dati, quindi tracciare 2D grAPHS. </li></ol>

<ol>
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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Consiglio della Contea di Östergötland, (Svezia) e il cellulare e molecolare Research Center presso l&#39;Iran Università degli Studi di Scienze Mediche (Teheran, Iran).

Nel protocollo corrente, abbiamo impiegato 3D morfometria confocale per valutare 12 parametri diversi che sono stati associati con astrociti morfologia. A questo scopo, tessuti ippocampali di ratto con Ap 1-40 - stati usati astrogliosis indotta, con o senza pretrattamento genisteina come agente anti-infiammatorio. Utilizzando le immagini 3D e software morfometriche, siamo stati in grado di mostrare l&#39;effetto di genisteina sulla astrogliosi cioè morfologia degli astrociti. <p class="jove_cont...

Nel sano il sistema nervoso centrale (SNC), astrociti svolgono un ruolo importante nella regolazione del flusso di sangue, metabolismo energetico, la funzione sinaptica e plasticità, e ionico extracellulare e neurotrasmettitore omeostasi 1-3. Inoltre, astrociti rispondono a stimoli diversi nocive e condizioni anomale, come traumi, infezioni, ischemia o neurodegenerazione con astrogliosi reattiva che è caratterizzata da ipertrofia, la proliferazione e rimodellamento funzionale degli astrociti 4,5. Astrogliosis reattiva può progettare la risposta infiammatoria e processo di riparazione del tessuto e, quindi, può influenzare l&#39;esito clinico di interventi terapeutici. Di conseguenza, gli astrociti hanno ricevuto attenzione da neuroscienziato nel corso degli ultimi decenni come potenziali bersagli per interventi terapeutici per una varietà di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale. Astrociti normalmente hanno una forma stellata con ben-drami efined che si diffondono in tutto il soma 6. In una condizione di malato nel cervello, rami astrociti diventare aggrovigliata e mostrano estremità gonfie 7, ad esempio in presenza di beta amiloide (Ap). Questo articolo presenta un protocollo per l&#39;analisi di immagini 3D di astrociti acquisite al microscopio confocale. Dodici diversi parametri quantitativi per ogni astrociti sono stati misurati: delle superfici e dei volumi del territorio astrociti (il tessuto coperto da un astrociti), intera cella (incluse le filiali), corpo cellulare, e nel nucleo; la lunghezza totale e il numero di sportelli; l&#39;intensità di fluorescenza di anticorpi utilizzati per la rilevazione astrociti; e la densità degli astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo, abbiamo usato sezioni di cervello di ratti esposti a intrahippocampal iniezione di Ap 1-40 con o senza trattamento genisteina come sostanza anti-infiammatoria. Il protocollo descritto può essere utilizzato per un morfometricaANALISI DELLA diversi tipi di cellule in vitro o in vivo in condizioni diverse.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Mentre le cellule gliali del cervello, astrociti hanno diversi ruoli funzionali nel sistema nervoso centrale. In presenza di stimoli nocivi, astrociti modificano le loro proprietà funzionali e strutturali, una condizione chiamata astrogliosis reattiva. Qui, un protocollo per la valutazione delle proprietà morfologiche di astrociti è presentato. Questo protocollo include quantificazione dei 12 parametri diversi cioè la superficie e il volume del tessuto coperto da una astrociti (territorio astrociti), l&#39;intero astrociti compresi rami, corpo cellulare, e nucleo, così come la lunghezza totale e il numero di rami, l&#39;intensità della fluorescenza immunoreattività di anticorpi utilizzati per il rilevamento astrociti, e la densità astrociti (numero / 1.000 micron 2). A questo scopo tridimensionali (3D) immagini microscopiche confocale sono stati creati, e immagini 3D software di analisi come Volocity 6.3 è stato utilizzato per le misurazioni. Tessuto cerebrale di ratto esposti a beta amiloide 1-40 </sub&gt; (Ap 1-40), con o senza un intervento terapeutico è stato utilizzato per presentare il metodo. Questo protocollo può essere utilizzato anche per l&#39;analisi morfometrica 3D di altre cellule da in vivo o in vitro condizioni.

Questa sezione presenta alcuni esempi delle osservazioni qualitativi e quantitativi prodotti da analisi morfometrica 3D. Per i risultati completi di tutti i 12 parametri menzionati in precedenza, si prega di consultare la nostra precedente pubblicazione 10. Osservazioni qualitative Gli astrociti esposti rami sottili o spessi che erano solitamente lunghi in Ap 1-40 ratti iniettati (Figura 1). Alcuni piccoli astrociti a forma ...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

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Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Le analisi morfometriche delle sezioni della retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

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Neuroscienze

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Tridimensionale confocale Analisi dei marcatori microglia / macrofagi di polarizzazione in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Denver Papille protocollo per l&#39;analisi Obiettivo papille fungiformi

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modellazione tridimensionale delle forme e analisi delle strutture cerebrali

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi