The authors have nothing to disclose.

מחקר זה בוצע בהתאם למדיניות שנקבעה במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH) שאושרה על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת איראן למדעי רפואה (טהרן, איראן). 1. בעלי חיים, תכשירי ניתוח ודגימה הערה: הכן רקמת מוח לניתוח מיקרוסקופי confocal 3D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים הפרד באופן אקראי לשתי קבוצות: Aβ 1-40 -injection (n = 8), וAβ 1-40 -injection עם טיפול האיזופלוונים (n = 8); לנהל האיזופלוונים (10 מ&quot;ג / קילוגרם בדילול מלא ברכב כגון שמן קיק polyethoxylated) על ידי HR gavage 1 לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיות עם קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם). אשר הרדמה תקינה על ידי חוסר רפלקס נסיגה לאחר צובט את הבוהן. השתמש במשחה על עיניים במהלך הניתוח כדי למנוע יובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעלי חיים במנגנון stereotaxic וראש הגילוח. החל iodפתרון ine לנקות את הקרקפת לפני החתך ולשמור על אתר המבצע סטרילי במהלך הניתוח כדי להקטין את הסיכון לזיהום. הזרק Aβ 1-40 stereotaxically (4 μl) בהיפוקמפוס ב-3.5 מ&quot;מ אחורי לגבחת, ± 2 מ&quot;מ לרוחב קו האמצע, ו-2.8 מ&quot;מ מתחת דורה, על פי אטלס מוח חולדה 8. לשיטת stereotaxic עיין פרסום קודם 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק תצפית / טיפול שלאחר ניתוח עד לבעלי החיים הם בהכרה מלאה כדי להבטיח את נוחותם של בעלי החיים. שמור את החיות חמות במהלך התאוששות, ולא להחזיר אותם לכלוב עם חיות אחרות עד להחלמה מלאה. שים לב לכל סימן של זיהום בבעלי החיים לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את בעלי החיים לעומק על ידי קטמין (150 מ&quot;ג / קילוגרם) שלושה שבועות לאחר הניתוח. לבצע קיבוע transcardial ידי מרוססי חיות עם מי מלח 0.9% ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PBS (pH = 7.4), ולאחר מכן להסיר ולתקן מוח כפי שתואר ב 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את המוח paraformaldehyde 4% במשך 2-3 ימים על 4 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הרקמה בלוקים פרפין על ידי שימוש בציוד רקמות הטבעה, ולהימנע מתחת מילוי או קלטת מילוי מעל שכן הוא עלול להפריע ליישור או חתך נכון. שים לב לכיוון של הרקמות בבלוק פרפין. הערה: היפוקמפוס החולדה, למשל, קרוב לחלק אחורי של האונה המוחית. לפיכך, הרקמה צריכה להיות מוטבעת באופן שמתחיל חתך בחלק אחורי של המוח. השתמש באטלס פקסינוס 8 כמדריך כדי להגיע למבנה האנטומי הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microtome מטיוטות אוויר או פתחים מאז תנועות אוויר להפוך את הטיפול בחלקים קשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלקים עם מיקרומטר עובי ≥20 כעומק זה עם יהיה צורך להפיק תמונות Z-Stack של האסטרוציטים מלאים. אל תשתמשו בכמה הסעיפים הראשונים, כפי שיש להם עובי רצוי בשל תרמית דוארxpansion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החלקים על פני השטח של מים חמים (5 ± 2 C, מתחת לטמפרטורת ההיתוך לפרפין) רק מספיק זמן כדי לשטח את החלקים. הערה: מעל הרחבת הסעיף יכולה להפריע את המורפולוגיה של המבנה. השתמש במכחול זעיר להעביר בזהירות חלקים. לאסוף 02:58 סעיפים על כל שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות חנות במעמד בתנוחה זקופה ולתת להם להתייבש על 37 C למשך מספר שעות או O / N. </li></ol> 2. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize בקסילן, 2 x 10 דקות, ורעננותם דרך שיפוע אלכוהול (99.8%, 95%, ו -70%, 10 דקות כל אחד) וPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים כנגד חלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) בדילול 1: 1,500 בPBS המכיל 0.25% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.25% Triton X-100 ו -3.5% בסרום נורמלי (O / N ב 4 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם antibodie פוספט מצומדות- אלקליין המשניים ל1H (1: 100, 21 C, מדולל PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות. הערה: חשוב לשטוף את החלקים כראוי לאחר נוגדנים משני למזער מכתים רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה בחושך עם נוזלים קבועים האדום אַב צֶבַע (15-20 דקות). הערה: הכן את הפתרון לא יותר מ 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להכתים את הגרעינים עם 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 500, בדילול מלא PBS) לפני-מחליק לכסות. אחסן את השקופיות בשעתי 24-48 המקרר לפני מיקרוסקופיה. </li></ol> 3. Confocal מיקרוסקופית הערה: להערכה כמותית (ראה בהמשך), בחר astrocyte עם גרעין מוכתם DAPI נראה בבירור עם מינימום של חופף סניפים כדי להפחית את הסיכון לטעויות. הפקת תמונות Z-סטאק היא זמן רב. היה סבלני ולא מפסיק במהלך עיבוד. מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הזקוף הוא used כדי ליצור תמונות 3D מהאסטרוציטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופיות במיקרוסקופ השלבים, ובחר את מטרת 63X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ על מערכת התחל. לחץ על כרטיסיית אתר. עבור להקצאה, ובחר GFP להתאים את האור הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התריס כדי לשקף את האור. מצא Revolver רפלקטור בצד ימין של תריס ולבחור את הצבע שצריך לבוא לידי ביטוי על ידי האסטרוציטים (ירוק, אדום או סגול); צבע אדום (WF FSet20) שימש כאן. הערה: אל תשכח להתמקד התמונה ישירות בעיניים של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא את המיקוד הטוב ביותר, לחץ על כל סגור, לשים סיכת מיקרוסקופ במצב מסך, ולחץ על כרטיסיית הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חכמה התקנה תחת לשונית הרכישה; נפתח חלון. בחר fluorophore הנכון (כלומר DAPI ואלקסה פלואוריד 555, בפרויקט הנוכחי) מהרשימה. הצבע שנבחר באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על האות הטובה ביותר, והחל, ואז ללחוץ על חשיפה הגדר; המחשב יהיה אז באופן אוטומטי להגדיר את הפרמטרים החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעול התמונה, ללכת לחלון הערוצים. ביטול סימון Track2, להדגיש Track1 ולחץ על חיים. למקד את התמונה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון הערוצים להתאים את המקשים הבאים; לחץ על 1AU כדי לייעל את חריר באופן אוטומטי. זה מאוד חשוב לעשות את הצעד הזה אחרת תמונות confocal יהיו לא-אופטימליות. התאם רווח ליש העצמה הטובה ביותר (לשמור הגדרה זו להלן 800 כדי להפחית את רעש נוסף). לבסוף, קבע את רווח הדיגיטלי בין 2 ו -3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטול סימון Track1, לחץ על Track2 וחזור על שלב 3.8 לTrack2. אז להפסיק חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לחלון רכישת מצב. לשפר את התמונה על ידי אופטימיזציה של גודל מסגרת והמיצוע. כדי לשנות את גודל המסגרת ללכת לX * Y ובחר 1,024 x 1,024. בחר מהירות איטית כדי ליצור תמונה טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור למיצוע ובחר מספר ≥4. ערך מיצוע זה מציין את מספר הסריקות שיהיה בממוצע לproducדואר התמונה שנרכשה. כעת לחץ על כפתור הצמד, ולשמור את תמונת 2D נתפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה 3D, לסמן את פריט Z-סטאק תחת הגדרה חכמה גורם לחלון Z-סטאק לפתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את העמדות הראשונות ואחרונה לZ-סטאק, כלומר העומק של התא. לחץ על ראשית חיים. לאחר מכן השתמשתי בכונן המוקד של המיקרוסקופ להתמקד בעמדה העליונה של astrocyte ברקמות, שבו Z-סטאק הוא להתחיל. לחץ על הסט הראשון. לאחר מכן להתמקד למטה למצב הנמוך ביותר של astrocyte ברקמות, שבו סריקת Z-סטאק יש להפסיק. לחץ על Set האחרון. אז להפסיק חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המרווח; 1.01 מיקרומטר משמש במחקר הנוכחי; מרווח בחירה יכול להיעשות על ידי לחיצה על אופטימלי כדי להגדיר את מספר פרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התחל ניסוי. שמור את התמונות פעם אחת לסיום הסריקה. תמונה זו תשמש למדידה של הפרמטרים הבאים: פני שטח ונפח של שטח astrocyte, חזייה כל astrocyte כוללnches, גוף תא, וגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונת 2D באמצעות מטרת 10X או 20X כפי שמתואר בשלבים 3.6-3.11. תמונה זו יכולה לשמש למדידה עוצמת הקרינה immunoreactivity של נוגדנים, וצפיפות astrocyte (מספר / 1000 מיקרומטר 2). </li></ol> 4. צפיפות astrocyte וGFAP + עוצמת הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונת 20X 2D. לחץ על HISTO (Hisogram) בצד השמאל של חלון תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את צפיפות astrocyte, בחר שלושה שדות ראייה ברציפות תחת מטרת 20X. לספור את מספר האסטרוציטים כי התערוכה סומה ברורה עם מינימום, חופפות סניפים בשדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את עוצמת הקרינה, בחר כלי מתאים (מלבן או עיגול) בכותרת התחתונה של חלון תמונה, ולבחור אזור למדידה. שים לב לערך הממוצע וסטיית תקן יופיעו באופן אוטומטי מתחת לתמונה. במחקר הנוכחי, שטח מלבני 0.7 מ&quot;מ 2 בין רחiatum ולהב המדיאלי של רכס המשונן היה בשימוש. </li></ol> 5. סניפי astrocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את האורך ומספר כולל של סניפים, להשתמש בתמונות 3D (שנרכשו עם 20X) בתוכנה לניתוח תמונה. צייר קו באופן ידני לאורכו של כל סניף של astrocyte נבחר. לאחר מכן בחר את מדידת הכלי שמתמחה למדידת קו-אורך. על מנת לכמת את מספר הסניפים, בחר את ספירת הכלי לספור את מספר הפריטים מסומנים. </li></ol> 6. נפח ושטח פנים הערה: סימון מבנה ידני בתוכנת ניתוח תמונת 3D דורשת התמקדות ואימון. תרגל מספר פעמים לפני שמתחיל ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את אזור הנפח והשטח של גרעין astrocyte, סומה, גוף תא ושטח, להעביר את תמונות 3D (שנרכשו בשלבי 3.1-3.16) לתוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Volocity 6.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה וליצור חדשסִפְרִיָה. גרור את כל התמונות לעמודה האפורה שנשארה בספרייה החדשה. לאחר מכן, בחר אחד תמונת 3D. מימין, יש ערוצים שונים בצבעים שונים. הפעל ערוץ אחד של עניין; למשל הערוץ הכחול לDAPI כאשר מודד את הגרעין. לשנות את הבהירות באופן ידני כדי לקבל ניגוד אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בתפריט כלים, ללכת להפוך נפח ולייצר תמונת 3D אחת מתמונות Z-ערימה. לחץ על מאפיינים בתפריט העריכה ולהיות בטוח שX, Y ו- Z נכסים מוצגים; אחרת אי אפשר לבצע את ניתוח 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על סמל כלי RIO Freehand בסרגל הכלים. כדי למדוד את שטח הנפח ושטח של גרעין astrocyte לצייר קו סביב הגרעין שכותרתו DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את שטח הנפח ופני שטח של גוף תא astrocyte לצייר קו סביב סומה למעט סניפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את שטח הנפח ושטח של astrocyte השלם (גוף תא כוללים סניפים) למתוח קו סביב סומה הבאהפני השטח של כל הסניפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את אזור הנפח והשטח של שטח astrocyte למתוח קו בין קצות הענפים. הערה: לחצו על מחק במקלדת כדי למחוק ציורים לא רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תפריט המדידות בחלק העליון של חלון התמונה כדי ליצור פרוטוקול מדידה; חלון המכיל כלים שונים פותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרור מצא אובייקטים לחלק העליון של החלון (חלונית). תן שם תיאורים לאוכלוסייה 1, לבחור את הצבע קשור, ולחצו על מדד. חלון אחר נפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור כלומר פרמטר, נפח או משטח. לחץ על אישור. הנתונים יופיעו בטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את הנתונים בלחיצה על תפריט המדידה ובחר הפוך פריט מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריט מדידה חדש בשם מהחלון נפתח. ואז לתת שם לנתונים ולחצו על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לייצא את הנתונים לתוכנת סטטיסטיקה כגון כרית גרף או להצטיין תכנית. השתמש במבחן t כדי לנתח את הנתונים, אז עלילה 2D גרaphs. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממועצת המחוז של Östergötland, (שבדיה) והתאית ומולקולרי המרכז למחקר באוניברסיטת איראן למדעי רפואה (טהרן, איראן).

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מועסקים morphometry confocal 3D להעריך 12 פרמטרים שונים שהיו קשורים עם מורפולוגיה astrocyte. לצורך כך, הרקמה בהיפוקמפוס של חולדות עם 1-40 Aβ - astrogliosis המושרה, עם או בלי טיפול מקדים האיזופלוונים כסוכן אנטי דלקתי היו בשימוש. על ידי שימוש בתמונות 3D ותוכנת mor...

במערכת עצבים מרכזית בריאה (CNS), האסטרוציטים לשחק תפקיד חשוב בויסות זרימת דם, חילוף חומרים של אנרגיה, תפקוד הסינפטי וגמישות, ויון תאי ועצביים הומאוסטזיס 1-3. בנוסף, האסטרוציטים להגיב לגירויים מזיקים שונים ותנאים חריגים כגון טראומה, זיהום, איסכמיה או ניוון מוחיים באמצעות astrogliosis תגובתי אשר מאופיין על ידי יתר, הפצה ושיפוץ פונקציונלי של האסטרוציטים 4,5. astrogliosis תגובתי יכול להנדס את התגובה הדלקתית ותהליך תיקון ברקמה, ולכן יכול להשפיע על התוצאות הקליניות של התערבויות טיפוליות. בהתאם לכך, האסטרוציטים קיבלו את תשומת לב ממדען המוח בעשורים האחרונים כיעדים פוטנציאליים להתערבויות טיפוליות עבור מגוון רחב של מחלות התוקפות את מערכת העצבים המרכזית. בדרך כלל יש לי האסטרוציטים צורת stellate עם ד היטבסניפי efined שהתפשטו ברחבי סומה 6. במצב חולה במוח, סניפי astrocyte להיות מפותלים ולהראות קצוות נפוחים 7, למשל בנוכחות של בטא עמילואיד (Aβ). מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח תמונות 3D של האסטרוציטים נרכשו על ידי מיקרוסקופיה confocal. שנים עשר פרמטרים כמותיים שונים עבור כל astrocyte נמדדו: השטח הפנים ואמצעי אחסון של שטח astrocyte (הרקמה מכוסה על ידי astrocyte), תא כולו (כולל סניפים), גוף תא, וגרעין; האורך הכולל ומספר הסניפים; עוצמת הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte; והצפיפות של האסטרוציטים (מספר / 1000 מיקרומטר 2). לשם כך, השתמשנו חלקים במוח מחולדות שנחשפו לintrahippocampal הזרקה של Aβ 1-40 עם או בלי טיפול האיזופלוונים כחומר אנטי דלקתי. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לmorphometricalysis סוגי תאים שונים במבחנה או בvivo בתנאים שונים.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

כמו תאי גלייה במוח, יש לי האסטרוציטים תפקידים פונקציונליים מגוונים במערכת העצבים המרכזית. בנוכחות גירויים מזיקים, האסטרוציטים לשנות את המאפיינים הפונקציונליים ומבניים שלהם, מצב הנקרא astrogliosis תגובתי. כאן, פרוטוקול להערכה של תכונות מורפולוגיות של האסטרוציטים מוצג. פרוטוקול זה כולל כימות של 12 פרמטרים שונים כלומר את פני השטח והנפח של הרקמה מכוסה על ידי astrocyte (שטח astrocyte), כל astrocyte כולל סניפים, גוף תא, וגרעין, כמו גם אורך כולל ומספר הסניפים, העצמה של immunoreactivity הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte, וצפיפות astrocyte (מספר / 1000 מיקרומטר 2). למטרה זו תמונות מיקרוסקופיות confocal (3D) תלת ממדים נוצרו, ותוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Volocity 6.3 שימש למדידות. רקמת מוח חולדה נחשפה לביתא עמילואיד 1-40 </תת&gt; (Aβ 1-40) עם או בלי התערבות טיפולית שימש להציג את השיטה. גם פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח morphometric 3D של תאים אחרים משני in vivo או בתנאי מבחנה.

חלק זה מציג כמה דוגמאות של התצפיות איכותיות וכמותיים המיוצרות על ידי ניתוח morphometric 3D. לקבלת תוצאות של כל 12 הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן מלאים, עיין הפרסום הקודם שלנו 10. תצפיות איכותיות האסט?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Video: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

דנבר גבשושיות פרוטוקול לניתוח אובייקטיבי של Fungiform גבשושיות

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

מידול צורה תלת מימדי וניתוח מבני המוח

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video