Name: protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

The authors have nothing to disclose.

מחקר זה בוצע בהתאם למדיניות שנקבעה במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH) שאושרה על ידי ועדת אתיקה של אוניברסיטת איראן למדעי רפואה (טהרן, איראן). 1. בעלי חיים, תכשירי ניתוח ודגימה הערה: הכן רקמת מוח לניתוח מיקרוסקופי confocal 3D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים הפרד באופן אקראי לשתי קבוצות: Aβ 1-40 -injection (n = 8), וAβ 1-40 -injection עם טיפול האיזופלוונים (n = 8); לנהל האיזופלוונים (10 מ&quot;ג / קילוגרם בדילול מלא ברכב כגון שמן קיק polyethoxylated) על ידי HR gavage 1 לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיות עם קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם). אשר הרדמה תקינה על ידי חוסר רפלקס נסיגה לאחר צובט את הבוהן. השתמש במשחה על עיניים במהלך הניתוח כדי למנוע יובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בעלי חיים במנגנון stereotaxic וראש הגילוח. החל iodפתרון ine לנקות את הקרקפת לפני החתך ולשמור על אתר המבצע סטרילי במהלך הניתוח כדי להקטין את הסיכון לזיהום. הזרק Aβ 1-40 stereotaxically (4 μl) בהיפוקמפוס ב-3.5 מ&quot;מ אחורי לגבחת, ± 2 מ&quot;מ לרוחב קו האמצע, ו-2.8 מ&quot;מ מתחת דורה, על פי אטלס מוח חולדה 8. לשיטת stereotaxic עיין פרסום קודם 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק תצפית / טיפול שלאחר ניתוח עד לבעלי החיים הם בהכרה מלאה כדי להבטיח את נוחותם של בעלי החיים. שמור את החיות חמות במהלך התאוששות, ולא להחזיר אותם לכלוב עם חיות אחרות עד להחלמה מלאה. שים לב לכל סימן של זיהום בבעלי החיים לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את בעלי החיים לעומק על ידי קטמין (150 מ&quot;ג / קילוגרם) שלושה שבועות לאחר הניתוח. לבצע קיבוע transcardial ידי מרוססי חיות עם מי מלח 0.9% ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PBS (pH = 7.4), ולאחר מכן להסיר ולתקן מוח כפי שתואר ב 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את המוח paraformaldehyde 4% במשך 2-3 ימים על 4 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הרקמה בלוקים פרפין על ידי שימוש בציוד רקמות הטבעה, ולהימנע מתחת מילוי או קלטת מילוי מעל שכן הוא עלול להפריע ליישור או חתך נכון. שים לב לכיוון של הרקמות בבלוק פרפין. הערה: היפוקמפוס החולדה, למשל, קרוב לחלק אחורי של האונה המוחית. לפיכך, הרקמה צריכה להיות מוטבעת באופן שמתחיל חתך בחלק אחורי של המוח. השתמש באטלס פקסינוס 8 כמדריך כדי להגיע למבנה האנטומי הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microtome מטיוטות אוויר או פתחים מאז תנועות אוויר להפוך את הטיפול בחלקים קשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלקים עם מיקרומטר עובי ≥20 כעומק זה עם יהיה צורך להפיק תמונות Z-Stack של האסטרוציטים מלאים. אל תשתמשו בכמה הסעיפים הראשונים, כפי שיש להם עובי רצוי בשל תרמית דוארxpansion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החלקים על פני השטח של מים חמים (5 ± 2 C, מתחת לטמפרטורת ההיתוך לפרפין) רק מספיק זמן כדי לשטח את החלקים. הערה: מעל הרחבת הסעיף יכולה להפריע את המורפולוגיה של המבנה. השתמש במכחול זעיר להעביר בזהירות חלקים. לאסוף 02:58 סעיפים על כל שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות חנות במעמד בתנוחה זקופה ולתת להם להתייבש על 37 C למשך מספר שעות או O / N. </li></ol> 2. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize בקסילן, 2 x 10 דקות, ורעננותם דרך שיפוע אלכוהול (99.8%, 95%, ו -70%, 10 דקות כל אחד) וPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים כנגד חלבון חומצי גליה fibrillary (GFAP) בדילול 1: 1,500 בPBS המכיל 0.25% אלבומין בסרום שור (BSA), 0.25% Triton X-100 ו -3.5% בסרום נורמלי (O / N ב 4 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם antibodie פוספט מצומדות- אלקליין המשניים ל1H (1: 100, 21 C, מדולל PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות. הערה: חשוב לשטוף את החלקים כראוי לאחר נוגדנים משני למזער מכתים רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה בחושך עם נוזלים קבועים האדום אַב צֶבַע (15-20 דקות). הערה: הכן את הפתרון לא יותר מ 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים בPBS למשך 3 x 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להכתים את הגרעינים עם 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 500, בדילול מלא PBS) לפני-מחליק לכסות. אחסן את השקופיות בשעתי 24-48 המקרר לפני מיקרוסקופיה. </li></ol> 3. Confocal מיקרוסקופית הערה: להערכה כמותית (ראה בהמשך), בחר astrocyte עם גרעין מוכתם DAPI נראה בבירור עם מינימום של חופף סניפים כדי להפחית את הסיכון לטעויות. הפקת תמונות Z-סטאק היא זמן רב. היה סבלני ולא מפסיק במהלך עיבוד. מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הזקוף הוא used כדי ליצור תמונות 3D מהאסטרוציטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופיות במיקרוסקופ השלבים, ובחר את מטרת 63X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ על מערכת התחל. לחץ על כרטיסיית אתר. עבור להקצאה, ובחר GFP להתאים את האור הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התריס כדי לשקף את האור. מצא Revolver רפלקטור בצד ימין של תריס ולבחור את הצבע שצריך לבוא לידי ביטוי על ידי האסטרוציטים (ירוק, אדום או סגול); צבע אדום (WF FSet20) שימש כאן. הערה: אל תשכח להתמקד התמונה ישירות בעיניים של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא את המיקוד הטוב ביותר, לחץ על כל סגור, לשים סיכת מיקרוסקופ במצב מסך, ולחץ על כרטיסיית הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חכמה התקנה תחת לשונית הרכישה; נפתח חלון. בחר fluorophore הנכון (כלומר DAPI ואלקסה פלואוריד 555, בפרויקט הנוכחי) מהרשימה. הצבע שנבחר באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על האות הטובה ביותר, והחל, ואז ללחוץ על חשיפה הגדר; המחשב יהיה אז באופן אוטומטי להגדיר את הפרמטרים החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעול התמונה, ללכת לחלון הערוצים. ביטול סימון Track2, להדגיש Track1 ולחץ על חיים. למקד את התמונה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון הערוצים להתאים את המקשים הבאים; לחץ על 1AU כדי לייעל את חריר באופן אוטומטי. זה מאוד חשוב לעשות את הצעד הזה אחרת תמונות confocal יהיו לא-אופטימליות. התאם רווח ליש העצמה הטובה ביותר (לשמור הגדרה זו להלן 800 כדי להפחית את רעש נוסף). לבסוף, קבע את רווח הדיגיטלי בין 2 ו -3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטול סימון Track1, לחץ על Track2 וחזור על שלב 3.8 לTrack2. אז להפסיק חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לחלון רכישת מצב. לשפר את התמונה על ידי אופטימיזציה של גודל מסגרת והמיצוע. כדי לשנות את גודל המסגרת ללכת לX * Y ובחר 1,024 x 1,024. בחר מהירות איטית כדי ליצור תמונה טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור למיצוע ובחר מספר ≥4. ערך מיצוע זה מציין את מספר הסריקות שיהיה בממוצע לproducדואר התמונה שנרכשה. כעת לחץ על כפתור הצמד, ולשמור את תמונת 2D נתפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה 3D, לסמן את פריט Z-סטאק תחת הגדרה חכמה גורם לחלון Z-סטאק לפתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את העמדות הראשונות ואחרונה לZ-סטאק, כלומר העומק של התא. לחץ על ראשית חיים. לאחר מכן השתמשתי בכונן המוקד של המיקרוסקופ להתמקד בעמדה העליונה של astrocyte ברקמות, שבו Z-סטאק הוא להתחיל. לחץ על הסט הראשון. לאחר מכן להתמקד למטה למצב הנמוך ביותר של astrocyte ברקמות, שבו סריקת Z-סטאק יש להפסיק. לחץ על Set האחרון. אז להפסיק חי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המרווח; 1.01 מיקרומטר משמש במחקר הנוכחי; מרווח בחירה יכול להיעשות על ידי לחיצה על אופטימלי כדי להגדיר את מספר פרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התחל ניסוי. שמור את התמונות פעם אחת לסיום הסריקה. תמונה זו תשמש למדידה של הפרמטרים הבאים: פני שטח ונפח של שטח astrocyte, חזייה כל astrocyte כוללnches, גוף תא, וגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונת 2D באמצעות מטרת 10X או 20X כפי שמתואר בשלבים 3.6-3.11. תמונה זו יכולה לשמש למדידה עוצמת הקרינה immunoreactivity של נוגדנים, וצפיפות astrocyte (מספר / 1000 מיקרומטר 2). </li></ol> 4. צפיפות astrocyte וGFAP + עוצמת הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תמונת 20X 2D. לחץ על HISTO (Hisogram) בצד השמאל של חלון תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את צפיפות astrocyte, בחר שלושה שדות ראייה ברציפות תחת מטרת 20X. לספור את מספר האסטרוציטים כי התערוכה סומה ברורה עם מינימום, חופפות סניפים בשדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את עוצמת הקרינה, בחר כלי מתאים (מלבן או עיגול) בכותרת התחתונה של חלון תמונה, ולבחור אזור למדידה. שים לב לערך הממוצע וסטיית תקן יופיעו באופן אוטומטי מתחת לתמונה. במחקר הנוכחי, שטח מלבני 0.7 מ&quot;מ 2 בין רחiatum ולהב המדיאלי של רכס המשונן היה בשימוש. </li></ol> 5. סניפי astrocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את האורך ומספר כולל של סניפים, להשתמש בתמונות 3D (שנרכשו עם 20X) בתוכנה לניתוח תמונה. צייר קו באופן ידני לאורכו של כל סניף של astrocyte נבחר. לאחר מכן בחר את מדידת הכלי שמתמחה למדידת קו-אורך. על מנת לכמת את מספר הסניפים, בחר את ספירת הכלי לספור את מספר הפריטים מסומנים. </li></ol> 6. נפח ושטח פנים הערה: סימון מבנה ידני בתוכנת ניתוח תמונת 3D דורשת התמקדות ואימון. תרגל מספר פעמים לפני שמתחיל ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את אזור הנפח והשטח של גרעין astrocyte, סומה, גוף תא ושטח, להעביר את תמונות 3D (שנרכשו בשלבי 3.1-3.16) לתוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Volocity 6.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה וליצור חדשסִפְרִיָה. גרור את כל התמונות לעמודה האפורה שנשארה בספרייה החדשה. לאחר מכן, בחר אחד תמונת 3D. מימין, יש ערוצים שונים בצבעים שונים. הפעל ערוץ אחד של עניין; למשל הערוץ הכחול לDAPI כאשר מודד את הגרעין. לשנות את הבהירות באופן ידני כדי לקבל ניגוד אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בתפריט כלים, ללכת להפוך נפח ולייצר תמונת 3D אחת מתמונות Z-ערימה. לחץ על מאפיינים בתפריט העריכה ולהיות בטוח שX, Y ו- Z נכסים מוצגים; אחרת אי אפשר לבצע את ניתוח 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על סמל כלי RIO Freehand בסרגל הכלים. כדי למדוד את שטח הנפח ושטח של גרעין astrocyte לצייר קו סביב הגרעין שכותרתו DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את שטח הנפח ופני שטח של גוף תא astrocyte לצייר קו סביב סומה למעט סניפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את שטח הנפח ושטח של astrocyte השלם (גוף תא כוללים סניפים) למתוח קו סביב סומה הבאהפני השטח של כל הסניפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את אזור הנפח והשטח של שטח astrocyte למתוח קו בין קצות הענפים. הערה: לחצו על מחק במקלדת כדי למחוק ציורים לא רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תפריט המדידות בחלק העליון של חלון התמונה כדי ליצור פרוטוקול מדידה; חלון המכיל כלים שונים פותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרור מצא אובייקטים לחלק העליון של החלון (חלונית). תן שם תיאורים לאוכלוסייה 1, לבחור את הצבע קשור, ולחצו על מדד. חלון אחר נפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור כלומר פרמטר, נפח או משטח. לחץ על אישור. הנתונים יופיעו בטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את הנתונים בלחיצה על תפריט המדידה ובחר הפוך פריט מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פריט מדידה חדש בשם מהחלון נפתח. ואז לתת שם לנתונים ולחצו על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לייצא את הנתונים לתוכנת סטטיסטיקה כגון כרית גרף או להצטיין תכנית. השתמש במבחן t כדי לנתח את הנתונים, אז עלילה 2D גרaphs. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממועצת המחוז של Östergötland, (שבדיה) והתאית ומולקולרי המרכז למחקר באוניברסיטת איראן למדעי רפואה (טהרן, איראן).

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מועסקים morphometry confocal 3D להעריך 12 פרמטרים שונים שהיו קשורים עם מורפולוגיה astrocyte. לצורך כך, הרקמה בהיפוקמפוס של חולדות עם 1-40 Aβ - astrogliosis המושרה, עם או בלי טיפול מקדים האיזופלוונים כסוכן אנטי דלקתי היו בשימוש. על ידי שימוש בתמונות 3D ותוכנת mor...

במערכת עצבים מרכזית בריאה (CNS), האסטרוציטים לשחק תפקיד חשוב בויסות זרימת דם, חילוף חומרים של אנרגיה, תפקוד הסינפטי וגמישות, ויון תאי ועצביים הומאוסטזיס 1-3. בנוסף, האסטרוציטים להגיב לגירויים מזיקים שונים ותנאים חריגים כגון טראומה, זיהום, איסכמיה או ניוון מוחיים באמצעות astrogliosis תגובתי אשר מאופיין על ידי יתר, הפצה ושיפוץ פונקציונלי של האסטרוציטים 4,5. astrogliosis תגובתי יכול להנדס את התגובה הדלקתית ותהליך תיקון ברקמה, ולכן יכול להשפיע על התוצאות הקליניות של התערבויות טיפוליות. בהתאם לכך, האסטרוציטים קיבלו את תשומת לב ממדען המוח בעשורים האחרונים כיעדים פוטנציאליים להתערבויות טיפוליות עבור מגוון רחב של מחלות התוקפות את מערכת העצבים המרכזית. בדרך כלל יש לי האסטרוציטים צורת stellate עם ד היטבסניפי efined שהתפשטו ברחבי סומה 6. במצב חולה במוח, סניפי astrocyte להיות מפותלים ולהראות קצוות נפוחים 7, למשל בנוכחות של בטא עמילואיד (Aβ). מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח תמונות 3D של האסטרוציטים נרכשו על ידי מיקרוסקופיה confocal. שנים עשר פרמטרים כמותיים שונים עבור כל astrocyte נמדדו: השטח הפנים ואמצעי אחסון של שטח astrocyte (הרקמה מכוסה על ידי astrocyte), תא כולו (כולל סניפים), גוף תא, וגרעין; האורך הכולל ומספר הסניפים; עוצמת הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte; והצפיפות של האסטרוציטים (מספר / 1000 מיקרומטר 2). לשם כך, השתמשנו חלקים במוח מחולדות שנחשפו לintrahippocampal הזרקה של Aβ 1-40 עם או בלי טיפול האיזופלוונים כחומר אנטי דלקתי. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לmorphometricalysis סוגי תאים שונים במבחנה או בvivo בתנאים שונים.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

כמו תאי גלייה במוח, יש לי האסטרוציטים תפקידים פונקציונליים מגוונים במערכת העצבים המרכזית. בנוכחות גירויים מזיקים, האסטרוציטים לשנות את המאפיינים הפונקציונליים ומבניים שלהם, מצב הנקרא astrogliosis תגובתי. כאן, פרוטוקול להערכה של תכונות מורפולוגיות של האסטרוציטים מוצג. פרוטוקול זה כולל כימות של 12 פרמטרים שונים כלומר את פני השטח והנפח של הרקמה מכוסה על ידי astrocyte (שטח astrocyte), כל astrocyte כולל סניפים, גוף תא, וגרעין, כמו גם אורך כולל ומספר הסניפים, העצמה של immunoreactivity הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte, וצפיפות astrocyte (מספר / 1000 מיקרומטר 2). למטרה זו תמונות מיקרוסקופיות confocal (3D) תלת ממדים נוצרו, ותוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Volocity 6.3 שימש למדידות. רקמת מוח חולדה נחשפה לביתא עמילואיד 1-40 </תת&gt; (Aβ 1-40) עם או בלי התערבות טיפולית שימש להציג את השיטה. גם פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח morphometric 3D של תאים אחרים משני in vivo או בתנאי מבחנה.

חלק זה מציג כמה דוגמאות של התצפיות איכותיות וכמותיים המיוצרות על ידי ניתוח morphometric 3D. לקבלת תוצאות של כל 12 הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן מלאים, עיין הפרסום הקודם שלנו 10. תצפיות איכותיות האסט?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Video: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biology

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

שיטה לניתוח שחזור תלת מימד ומציאות וירטואלית של תאים גליאל ונוירוונאליות

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
This video ...