The authors have nothing to disclose.

この研究は、医学のイラン大学（テヘラン、イラン）の倫理委員会によって承認された実験動物の管理と使用（NIH）のためのガイドに記載されたポリシーに準じて行きました。 1.動物、手術検体の準備注：3D共焦点顕微鏡分析のために、脳組織を準備します。 <ol><li>二つのグループに無作為に動物を分割：Aβ1-40 -injection（N = 8）、およびゲニステイン治療（N = 8）と、Aβ1-40 -injection。手術前に強制飼養1時間によってゲニステイン（例えばポリエトキシル化ヒマシ油等の車両に希釈した10mg / kgの）を管理。 </li><li>ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）で動物を麻酔。つま先をつまん後引っ込め反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、手術中に目に軟膏を使用してください。 </li><li>定位固定装置と剃りヘッドの動物を配置します。 IODの適用INE溶液を切開前頭皮をきれいにし、感染のリスクを減らすために、手術中に無菌手術部位を維持します。ラット脳アトラス8によれば、ブレグマ-3.5ミリ後方、正中線±2ミリメートル、横方向、および硬膜下の-2.8 mmに海馬におけるAβ1-40定位（4μl）を注入します。定位方法については、以前の出版物9を参照してください 。 </li><li>動物は動物の快適さを確保するために完全に意識されるまで術後観察/ケアを提供します。リカバリ中に暖かい動物を維持し、完全に回復するまで、他の動物とのケージにそれらを返しません。手術後、動物に感染の兆候に注意してください。 </li><li> 3週間手術後（150ミリグラム/ kg）をケタミンにより深く動物を麻酔。 0.1 M PBS（pH値= 7.4）中の4％パラホルムアルデヒドに続いて、0.9％の生理食塩水で動物を灌流することによってtranscardial固定を行い、その後、削除して、10で説明したように、&lt;脳を修正/ SUP&gt;。 </li><li> 4℃で2〜3日、4％パラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。 </li><li>組織包埋装置を使用することにより、パラフィンブロック中の組織を埋め込み、それが正しい位置合わせまたは切片を妨げる可能性があるため、充填アンダーまたはオーバー充填カセットを避けます。パラフィンブロック中の組織の向きに注意してください。 注：ラット海馬は、例えば、大脳半球の後部に近接しています。したがって、組織は、脳の後部で開始を区画する方法に埋め込まれるべきです。目的の解剖学的構造に到達するためのガイドとしてPaxinosアトラス8を使用してください 。 </li><li>空気の動きがセクションの取り扱いが困難になることから離れて空気ドラフトや戸口からミクロトームを置きます。 </li><li>この深さは完全なアストロサイトのZスタック画像を生成するために必要なことのように厚さ≥20ミクロンでセクションを使用してください。彼らは望ましくない厚さを有することができるように熱電子に、最初のカップルのセクションを使用しないでくださいxpansion。 </li><li> （5±2 C、パラフィンの融解温度以下）だけで十分な長さのセクションを平坦化する温水の表面にセクションを配置します。 注：セクションの拡大にわたり構造の形態を乱すことができます。慎重にセクションを転送するために小さな絵筆を使用してください。各スライドの2〜3のセクションを収集します。 </li><li>ストア直立位置にあるラックにスライドし、いくつかの時間またはO / N 37℃でそれらが乾燥してみましょう。 </li></ol> 2.免疫組織化学<ol><li>キシレン、2×10分間で脱パラフィン切片、及びアルコール勾配（99.8％、95％、70％、10分毎）およびPBSを介して再水和します。 </li><li> 0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.25％トリトンX-100および3.5％正常血清（4℃でO / N）を含有するPBSで1,500：グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に対する抗体でインキュベートし、1に希釈しました。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 </li><li>二次アルカリホスファターゼコンジュゲートantibodieでインキュベート1時間のためのS（1：PBSで希釈した100、21℃）。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 注：これは、バックグラウンド染色を最小限にするために、適切な二次抗体の後のセクションを洗浄することが重要です。 </li><li>液体パーマネントレッドクロモゲン（15〜20分）で暗闇の中でのセクションをインキュベートします。注：使用する前に解決策がない以上30分以上を準備します。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 </li><li>最後に、4-6ジアミジノ-2-フェニルと、核染色（DAPI; 1：PBSで希釈した500）の前にカバー・スリップします。顕微鏡の前に冷蔵庫24〜48時間でスライドを保管してください。 </li></ol> 3.共焦点顕微鏡注：定量的評価（下記参照）の場合は、エラーのリスクを減らすために枝を重複を最小限に抑えてはっきりと見えるDAPI染色核とアストロサイトを選択します。 Zスタック画像を生成することは時間がかかります。我慢して、処理中に停止しないでください。直立共焦点レーザー走査型顕微鏡は、Uでありますアストロサイトから3D画像を作成するためのsed。 <ol><li>顕微鏡ステージ上にスライドを入れて、63Xの目的を選択します。 </li><li>イメージングソフトウェアを開き、スタートシステムをクリックします。探しタブをクリックします。割り当てに移動し、適切な光を調整するために、GFPを選択します。 </li><li>光を反射するようにシャッターを開きます。シャッターの右側にリフレクターリボルバーを見つけて、アストロサイト（緑、赤または紫）によって反射されるべき色を選択します。赤色（FSet20 WF）は、ここで使用しました。 注：顕微鏡の接眼レンズに直接絵を集中することを忘れないでください。 </li><li>最適な焦点を見つけるために、すべての閉じをクリックして、画面モードで顕微鏡ピンを入れ、取得]タブをクリックします。 </li><li>取得]タブの下でスマートセットアップをクリックします。ウィンドウが開きます。リストから適切な蛍光団（現在のプロジェクトで、すなわち DAPIおよびAlexaフルーア555、）を選択します。色が自動的に選択されます。 </li><li>最良の信号をクリックして、[適用し、設定された露出をクリックしました;その後、コンピュータは自動的に露光パラメータを設定します。 </li><li>画像を最適化するために、チャンネル・ウィンドウに移動します。マーク解除トラック2は、トラック1を強調表示し、ライブをクリックしてください。必要に応じて画像の焦点を合わせます。 </li><li> Channelsウィンドウで次のキーを調整します。自動的にピンホールを最適化するために、1AUをクリックしてください。それ以外の場合は、共焦点画像を非最適になりますこの手順を実行することは非常に重要です。最高の強度（余分なノイズを低減するために800の下には、この設定を保持する）を持つようにゲインを調整します。最後に、2と3の間のデジタルゲインを設定します。 </li><li>マーク解除トラック1は、トラック2をクリックして、トラック2のためのステップ3.8を繰り返します。そして、ライブを停止します。 </li><li>取得モードのウィンドウに移動します。フレームサイズを最適化し、平均化することによって、画像を改善します。フレームサイズは、X * Yに移動して、1,024×1024を選択変更するには。良好な画像を作成するために遅い速度を選択してください。 </li><li>アベレージに移動し、数≥4を選択します。この平均値はな生産するために平均化されるスキャンの数を示します取得した画像を電子。今スナップボタンをクリックして、キャプチャされた2D画像を保存します。 </li><li> 3Dイメージングの場合は、Z-Stack]ウィンドウを開くには、原因となるスマートセットアップ下のZスタック項目をマークします。 </li><li>セルの深さ、すなわち 、zスタックのための最初と最後の位置を設定します。初のライブを​​クリックしてください。その後、Zスタックが開始する組織でアストロサイトの最上位の位置に集中する顕微鏡のフォーカス駆動を使用しています。設定された最初のをクリックします。その後、Zスタックのスキャンを停止する必要がある組織内のアストロサイトの最も低い位置まで焦点を当てます。最後に設定をクリックします。そして、ライブを停止します。 </li><li>間隔を選択します。 1.01μmのは、現在の研究で使用されています。間隔を選択するスライスの数を設定することが最適でクリックすることによって行うことができます。 </li><li>スタート実験をクリックします。スキャンが完了すると、画像を保存します。この画像は、以下のパラメータの測定に使用されます：アストロサイトの領土の表面積と体積、ブラジャーを含む全体のアストロサイトnches、細胞体および核。 </li><li>ステップ3.6から3.11に記載されているように10倍または20倍対物レンズを使用して二次元画像を取得します。この画像は、測定抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の強度のために使用することができます。 </li></ol> 4.星状細胞密度およびGFAP +蛍光強度<ol><li> 20X 2D画像を開きます。画像ウィンドウの左側にヒスト（Hisogram）をクリックします。 </li><li>アストロサイトの密度を計算するために、20Xの対物レンズの下に三つの連続視野を選択します。フィールドに支店を重ね、最小で明確なソーマを示すアストロサイトの数をカウントします。 </li><li>蛍光強度を定量化するために、画像ウィンドウのフッターに適切なツール（長方形や円）を選択し、測定のための領域を選択します。平均値と標準偏差は、画像の下に自動的に表示されます注意してください。 strの間の現在の研究では、0.7ミリメートル2矩形領域iatumと歯状回の内側ブレードを使用しました。 </li></ol> 5.星状細胞の分岐<ol><li>長さと分枝の総数を定量化するために、画像解析ソフトウェアで（20Xで取得）の3D画像を使用。選択されたアストロサイトの各枝の長さに沿って手動で線を引きます。そして、ラインの長さを測定するために特化された測定ツールを選択します。ブランチの数を定量化するために、マークされた項目の数をカウントするカウントツールを選択します。 </li></ol> 6.ボリュームと表面積注：3D画像解析ソフトウェアで手動で構造をマーキングは、フォーカスと訓練が必要です。実験を開始する前に、何回か練習。 <ol><li>アストロサイトの核、相馬、細胞体と領土の体積と表面積を定量化するために、このようなVolocity 6.1のように3次元画像解析ソフトに（ステップ3.1から3.16で取得された）3D画像を転送します。 </li><li>ソフトウェアを開き、新しいを作成します図書館。新しいライブラリの左側の灰色の列にすべての画像をドラッグします。そして、1 3D画像を選択します。右側には、異なる色の異なるチャネルがあります。興味のある一つのチャネルをオンにします。例えば、DAPI用の青のチャンネルは、核を測定するとき。最適なコントラストを得るために、手動で明るさを変更します。 </li><li> [ツール]メニューを選択し、ボリュームを作成し、Zスタック画像の中から、単一の3D画像を生成するために行きます。 [編集]メニューの[プロパティ]をクリックし、Xは、Y、Zの性質が提示されていることを確認してください。それ以外の場合は、3次元解析を行うことは不可能です。 </li><li>ツールバーのフリーハンドRIOツールアイコンをクリックします。アストロサイトの核の体積と表面積を測定するには、DAPIで標識された核の周りに線を引きます。 </li><li>アストロサイトの細胞体の体積と表面積を測定するには、枝を除く相馬の周りに線を引きます。 </li><li>全体アストロサイト（支店を含む細胞体）の体積および表面積を測定するには、次のソーマの周りに線を引きますすべての枝の表面。 </li><li>アストロサイトの領土の体積と表面積を評価するには、枝の先端との間に線を引きます。 注：押して、不要な図面を消去するには、キーボード上で削除します。 </li><li>測定プロトコルを作成するために、画像ウィンドウの上部にある測定のメニューをクリックします。さまざまなツールを含むウィンドウが開きます。 </li><li>ドラッグすると、ウィンドウ（ウィンドウ枠）の一番上にオブジェクトを検索します。人口1に名前を付け、関連する色を選択し、メジャーをクリックしてください。別のウィンドウが開きます。 </li><li>パラメータすなわち 、ボリュームまたは表面積を選択してください。 [OK]をクリックします。データがテーブルに表示されます。 </li><li>測定メニューのデータをクリックして保存し、測定項目を確認し選択します。 </li><li>開いたウィンドウから呼び出された新しい測定項目を選択します。次に、データに名前を付け、[OK]をクリックします。 </li><li>最後に、グラフパッドまたはプログラムをExcelなどの統計ソフトウェアにデータをエクスポートします。データを分析するためにt検定を使用し、2DグラムをプロットAPHS。 </li></ol>

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この作品は、オスターゴットラントの州議会、（スウェーデン）と医学のイラン大学の細胞および分子研究センター（テヘラン、イラン）からの助成金によってサポートされていました。

現在のプロトコルでは、アストロサイトの形態と関連していた12異なるパラメータを評価するための3次元共焦点形態計測を用いました。この目的のために、Aβ1-40とラットの海馬組織-とまたは抗炎症剤としてのゲニステイン前処理なし誘発性アストログリオーシスは、使用されました。 3D画像と形態計測ソフトウェアを使用することにより、我々は、アストロサイトの形態...

健康な中枢神経系（CNS）において、星状細胞は、血流の調節、エネルギー代謝、シナプス機能と可塑性、および細胞外イオン及び神経伝達物質の恒常性1-3の重要な役割を果たしています。また、アストロサイトは肥大、増殖およびアストロサイト4,5の機能改造することを特徴とする反応性アストログリオーシスを介した別の有害な刺激や、外傷、感染症、虚血または神経変性などの異常な状態に応答します。 反応性アストログリオーシスは、組織に炎症反応と修復プロセスを設計することができ、したがって、治療的介入の臨床転帰に影響を与えることができます。したがって、アストロサイトは、CNSに影響する種々の疾患のための治療的介入のための潜在的なターゲットとして最後の十年の間に神経科学者から注目を集めています。 アストロサイトは、通常、よくdで星状の形状を有しますソーマ6の周囲に広がる枝をefined。脳内の病的状態では、アストロサイトの枝が複雑になり、アミロイドベータ（Aβ）の存在下で、例えば、腫れ終了7を示しています 。 この記事では、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析するためのプロトコルを提示します。各アストロサイトのための12の異なる定量的パラメータを測定した：アストロサイトの領土（アストロサイトで覆われた組織）の表面積と体積を、セル全体、細胞体、および核（支店を含みます）;枝の長さの合計と数。星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光強度。そして、アストロサイトの密度（数/千μm2で）。この目的のために、我々は、抗炎症物質としてゲニステイン処理の有無にかかわらず、Aβ1-40の海馬内注入に暴露されたラットからの脳切片を用いました。記載されているプロトコルは、形態学的ANのために使用することができますインビトロまたはインビボでの異なる条件で異なる細胞型のalysis。

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

脳内のグリア細胞のように、星状細胞は、中枢神経系における多様な機能的な役割を持っています。有害な刺激の存在下では、アストロサイトは、それらの機能的および構造的特性、反応性アストログリオーシスと呼ばれる状態を変更します。ここでは、星状細胞の形態学的特性の評価のためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、星状細胞（アストロサイト領土）で覆われた組織の表面積と体積、支店、細胞体、および核を含む全体のアストロサイトと同様に、枝の長さの合計と数、強度、すなわち12の異なるパラメータの定量化を含み星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の。 Volocity 6.3測定のために使用されたように、この目的のために、三次元（3D）の共焦点顕微鏡画像を作成し、3D画像解析ソフトウェアかかるました。アミロイドベータ1-40に露出ラット脳組織</サブ&gt;（Aβ1-40）治療的介入は、方法を提示するために使用されたの有無にかかわらず。このプロトコルは、 インビボまたはインビトロの条件のいずれかでの他のセルの3次元形態計測分析のために使用することができます。

このセクションでは、3次元形態計測分析によって生成定性的および定量的な観測のいくつかの例を紹介します。前述した全12パラメータの完全な結果を得るために、私たちの以前の出版物10を参照してください 。 定性的観察アストロサイトは、Aβ1-40注射したラット（ 図1）で、通常の長さで細いまたは太い枝を示しまし?...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K ビュー.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

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Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

神経科学

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

生物学

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
This video ...

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

要約

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実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

サイズ、形状、および結合のアストロサイトのネットワークの方向性を分析

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

要約

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実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

サイズ、形状、および結合のアストロ サイトのネットワークの方向性を分析

グリア細胞と神経細胞の3D再構成とバーチャルリアリティ解析の方法

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

厚い自由浮遊組織切片におけるアストロサイトの領域体積とタイリングの解析

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

サイズ、形状、および結合のアストロサイトのネットワークの方向性を分析