The authors have nothing to disclose.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH) eingestellt Politik von Ethic Ausschuss der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) zugelassen wurde. 1. Tiere, Chirurgie und Probenvorbereitungen HINWEIS: Bereiten Hirngewebe für 3D-konfokale mikroskopische Analyse. <ol><li> Divide Tiere zufällig in zwei Gruppen: 1-40 -Injektion (n = 8) und 1-40 -Injektion mit Genistein Behandlung (n = 8); verabreichen Genistein (10 mg / kg in einem Vehikel verdünnt wie polyethoxyliertes Rizinusöl) per Schlundsonde 1 Stunde vor der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch einen Mangel an Ziehreflex nach dem Einklemmen des Zehe. Verwenden Salbe auf die Augen während der Operation bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Zeigen Tiere in stereotaktischen Apparat und rasieren Kopf. Bewerben iodine Lösung, um die Kopfhaut vor dem Schnitt säubern und zu halten, das den Betrieb vor Ort sterile während der Operation, um das Infektionsrisiko zu verringern. Injizieren 1-40 stereotaktisch (4 ul) im Hippocampus bei -3,5 mm hinter Bregma, ± 2 mm lateral zur Mittellinie, und -2,8 mm unterhalb dura nach Rattenhirnatlas 8. Für stereotaktischen Verfahren finden Sie in früheren Veröffentlichung 9. </li><li> Geben Sie postoperative Beobachtungs / Pflege, bis die Tiere bei vollem Bewusstsein, um den Komfort der Tiere zu gewährleisten. Halten Sie die Tiere warmen während der Wiederherstellung, und schützen Sie sie vor einem Käfig mit anderen Tieren zurück, bis vollständige Genesung. Achten Sie auf Anzeichen von Infektionen bei den Tieren nach der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere tief von Ketamin (150 mg / kg) drei Wochen nach der Operation. Führen transkardialer Fixierung durch Perfusion die Tiere mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH = 7,4), dann entfernen und zu beheben Gehirn wie in 10 beschrieben &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd für 2-3 Tage bei 4 ° C. </li><li> Betten Sie das Gewebe in Paraffinblöcke durch die Verwendung von Gewebeeinbettungstechnik und vermeiden Unterfüllung oder Überfüllung der Kassette, da es mit der richtigen Ausrichtung oder Schnitte stören. Achten Sie auf die Ausrichtung des Gewebes in der Paraffinblock. HINWEIS: Die Ratte Hippocampus, zum Beispiel, ist in der Nähe von hinteren Teil der Hirnhemisphäre. Somit sollte das Gewebe in einer Art und Weise eingebettet werden, dass Schneiden beginnt am hinteren Teil des Gehirns. Verwenden Sie die Paxinos atlas 8 als Führung, um den gewünschten anatomischen Struktur zu erreichen. </li><li> Legen Sie das Mikrotom von Zugluft oder Türöffnungen, da Luftbewegungen machen die Handhabung der Teile schwierig. </li><li> Verwenden Abschnitte mit einer Dicke ≥20 um, wie diese Tiefe mit notwendig sein, Z-Stapel-Bilder von kompletten Astrozyten produzieren. Verwenden Sie nicht die ersten paar Abschnitte, da sie unerwünschte Dicke haben können, aufgrund der thermischen eXpansion. </li><li> Legen Sie die Teile auf der Oberfläche mit warmem Wasser (5 ± 2 C unterhalb der Schmelztemperatur für Paraffin) gerade lang genug, um die Abschnitte zu glätten. HINWEIS: Überexpansion des Profils kann die Morphologie der Struktur stören. Verwenden Sie kleine Pinsel, um vorsichtig zu übertragen Abschnitten. Sammeln Sie zwei vor drei Abschnitten auf jeder Folie. </li><li> Shop Dias in einem Rack in einer aufrechten Position und lassen Sie sie für mehrere Stunden oder O / N trocken bei 37 ° C. </li></ol> 2. Immunhistochemie <ol><li> Entparaffinieren Abschnitte in Xylol, 2 x 10 min, und rehydratisieren durch Alkohol-Gradienten (99,8%, 95% und 70%, jeweils 10 min) und PBS. </li><li> Inkubieren mit Antikörpern gegen saures Gliafaserprotein (GFAP), verdünnt 1: 1500 in PBS, das 0,25% Rinderserumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 und 3,5% normales Serum (O / N bei 4 ° C). </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Inkubieren mit sekundärem alkalische Phosphatase konjugierten antibodies für 1 h (1: 100, 21 C, verdünnt in PBS). </li><li> Für 3 x 5 min Waschen Sie die Schnitte in PBS. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Abschnitte richtig waschen, nachdem Sekundärantikörper, um Hintergrundfärbung zu minimieren. </li><li> Abschnitte in Dunkelheit inkubieren mit Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Hinweis: Bereiten Sie die Lösung nicht mehr als 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Schließlich färben die Kerne mit 4-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1: 500, verdünnt in PBS) vor der Deckung Rutsch. Speichern Sie die Folien im Kühlschrank 24-48 h vor der Mikroskopie. </li></ol> 3. konfokale Mikroskopie HINWEIS: Zur quantitativen Auswertung (siehe unten), wählen Sie eine Astrozyten mit einem deutlich sichtbaren DAPI-gefärbten Zellkern mit einem Minimum von überlappenden Ästen, um das Fehlerrisiko zu verringern. Herstellung von Z-Bilder Stapeln ist zeitaufwendig. Seien Sie geduldig und nicht während der Verarbeitung zu stoppen. Upright konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ist used, um 3D-Bilder von Astrozyten zu erstellen. <ol><li> Setzen Sie den Schieber auf der Mikroskop-Bühne, und wählen Sie das 63X Ziel. </li><li> Öffnen Sie die Imaging-Software und klicken Sie auf Start-System. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen. Zum Ordnen und wählen GFP, um die richtige Licht einzustellen. </li><li> Öffnen Sie den Auslöser, um Licht zu reflektieren. Finden Sie den Reflektor Revolver auf der rechten Seite der Shutter und wählen Sie die Farbe, die von Astrozyten (grün, rot oder violett) widerspiegeln sollte; rote Farbe (FSet20 wf) wurde verwendet. HINWEIS: Vergessen Sie nicht, um das Bild direkt in das Okular des Mikroskops zu konzentrieren. </li><li> Um den besten Fokus zu finden, klicken Sie auf alle geschlossen, legte das Mikroskop Stift im Bildmodus, und klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition. </li><li> Klicken Sie auf Smart Setup im Register Acquisition; öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie die richtige Fluorophors (dh DAPI und Alexa Fluor 555, im aktuellen Projekt) aus der Liste. Die Farbe wird automatisch ausgewählt. </li><li> Klicken Sie auf das beste Signal und Übernehmen, und klicken Sie auf Set Exposure; der Computer wird dann automatisch die Belichtungsparameter eingestellt. </li><li> Zur Optimierung der Bild, gehen Sie zum Fenster Kanäle. Unmark Track2, markieren Track1 und klicken Sie auf Live. Stellen Sie das Bild, wenn nötig. </li><li> Im Fenster Kanäle passen Sie die folgenden Tasten; klicken Sie 1AU automatisch optimieren die Lochkamera. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt sonst die konfokale Bilder werden nicht optimalen tun. Verstärkung anpassen um das beste Intensität (halten Sie diese Einstellung unter 800, um zusätzliche Rauschen zu verringern) zu haben. Schließlich, stellen Sie die digitale Verstärkung zwischen 2 und 3. </li><li> Unmark Track1, klicken Sie auf Track2 und wiederholen Sie Schritt 3.8 für Track2. Dann hör Live. </li><li> Zum Erfassungsmodus-Fenster. Verbessern Sie das Image durch die Optimierung der Bildgröße und Mittelung. Um das zu ändern Frame-Größe auf X * Y und wählen 1.024 x 1.024. Wählen Sie eine langsame Geschwindigkeit, um ein besseres Bild zu erzeugen. </li><li> Zum Mittelwertbildung und wählen Sie eine Anzahl ≥4. Diese Mittelung Wert gibt die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um produc werdene die erfasste Bild. Klicken Sie nun auf den Druckknopf, und speichern Sie die aufgenommenen Bildes 2D. </li><li> Für 3D-Bildgebung, markieren Sie die Z-Stapel Element unter Smart Setup wodurch die Z-Stapel-Fenster zu öffnen. </li><li> Setzen die ersten und letzten Positionen für die Z-Stapel, dh die Tiefe der Zelle ist. Klicken Sie zunächst auf Live. Dann nutzen Sie den Fokustrieb des Mikroskops auf die oberste Position der Astrozyten im Gewebe, wobei die Z-Stapel ist zu Beginn zu konzentrieren. Klicken Sie auf Set Erste. Dann konzentriert bis zur untersten Position der Astrozyten im Gewebe, in dem Z-Stapel Abtastung gestoppt werden soll. Klicken Sie auf Set Last. Dann hör Live. </li><li> Wählen Sie das Intervall; 1,01 &amp; mgr; m in der vorliegenden Studie verwendet wird; Wahl-Intervall kann durch Klicken auf Optimal, um die Anzahl der Schichten eingestellt erfolgen. </li><li> Klicken Sie auf Start Experiment. Speichern Sie die Bilder, sobald die Überprüfung abgeschlossen ist. Oberfläche und Volumen der Astrozyten Gebiet der gesamte Astrozyten einschließlich BH: Dieses Bild wird für die Messung der folgenden Parameter verwendet werdennches, Zellkörper und Kern. </li><li> Erwerben Sie ein 2D-Bild mit einem 10X oder 20X Ziel wie in den Schritten 3,6-3,11 beschrieben. Dieses Bild kann für die Messung der Intensität der Fluoreszenz Immunreaktivität des Antikörper und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2) verwendet werden. </li></ol> 4. Astrocyte Dichte und GFAP + Fluoreszenzintensität <ol><li> Öffnen Sie das 20X 2D-Bild. Klicken Sie auf Histo (Hisogram) auf der linken Seite des Bildfensters. </li><li> Um Astrozyten Dichte zu berechnen, wählen Sie drei aufeinander folgenden Gesichtsfelder unter 20x-Objektiv. Zählen Sie die Anzahl der Astrozyten, die eine klare soma aufweisen mit einem Minimum an, sich überlappenden Niederlassungen in den Feldern. </li><li> Um Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, wählen Sie ein geeignetes Werkzeug (Rechteck oder Kreis) in der Fußzeile der Bildfenster, und wählen Sie einen Bereich für die Messung. Beachten Sie, der Mittelwert und Standardabweichung automatisch unter dem Bild erscheinen. In der aktuellen Studie, ein 0,7 mm 2 rechteckigen Bereich zwischen striatum und mediale Klinge Gyrus dentatus wurde verwendet. </li></ol> 5. Astrocyte Branchen <ol><li> Um die Länge und die Gesamtzahl der Filialen zu quantifizieren, verwenden Sie 3D-Bilder (mit 20X erworben) in der Bildanalysesoftware. Zeichnen Sie eine Linie von Hand entlang der Länge jedes Zweiges des ausgewählten Astrozyten. Wählen Sie dann den Mess-Tool, das zur Messung von Leitungslängen spezialisiert ist. Um die Zahl der Filialen zu quantifizieren, wählen Sie den Count-Werkzeug, um die Anzahl der markierten Objekte zu zählen. </li></ol> 6. Volumen und Oberfläche HINWEIS: Markieren einer Struktur manuell in 3D-Bildanalyse-Software erfordert Fokus und Ausbildung. Üben Sie mehrmals, bevor ein Experiment. <ol><li> Um das Volumen und Oberfläche des Astrozyten-Zellkern, soma, Zellkörper und Territorium zu quantifizieren, übertragen Sie die 3D-Bilder (in Schritten von 3,1 bis 3,16 erworben) zu einem 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.1. </li><li> Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine neueBibliothek. Ziehen Sie alle Bilder auf der linken grauen Spalte in der neuen Bibliothek. Dann wählen Sie eine 3D-Bild. Auf der rechten Seite gibt es unterschiedliche Kanäle mit unterschiedlichen Farben. Schalten Sie einen Kanal von Interesse; beispielsweise die Blaukanal für DAPI bei der Messung der Zellkern. Ändern Sie die Helligkeit manuell, um einen optimalen Kontrast zu erhalten. </li><li> Wählen Sie das Menü Extras finden Sie auf Volume Stellen und erzeugen ein einziges 3D-Bild von Z-Stapel-Bildern. Klicken Sie auf Eigenschaften in dem Menü Bearbeiten und stellen Sie sicher, dass X, Y und Z-Eigenschaften werden vorgestellt; sonst ist es unmöglich durchzuführen 3D-Analyse. </li><li> Klicken Sie auf das Freihand-RIO-Werkzeug-Symbol in der Symbolleiste. Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkern zu messen ziehen Sie eine Linie um den DAPI-markierten Zellkern. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkörper zu messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma ohne Filialen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der gesamten Astrozyten (Zellkörper einschließlich Zweigniederlassungen) messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma nach demFläche aller Branchen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Gebiet zu bewerten ziehen Sie eine Linie zwischen den Spitzen der Zweige. HINWEIS: Drücken Sie Entf auf der Tastatur, um unerwünschte Zeichnungen zu löschen. </li><li> Klicken Sie auf die Messungen-Menü am oberen Rand des Bildfensters, um ein Messprotokoll zu erstellen; ein Fenster mit verschiedenen Werkzeugen geöffnet. </li><li> Ziehen Sie die Objekte finden, um oben im Fenster (Fensterbereich). Geben Sie einen aussagekräftigen Namen für die Bevölkerung ein, wählen Sie die zugehörigen Farbe, und klicken Sie auf Messen. Ein weiteres Fenster öffnet sich. </li><li> Wählen Sie einen Parameter, dh, das Volumen oder Fläche. Klicken Sie auf OK. Die Daten werden in einer Tabelle angezeigt. </li><li> Um die Daten klicken Sie auf das Menü Messung zu speichern und wählen Machen Mess Artikel. </li><li> Wählen Sie einen neuen Messpunkt aus dem geöffneten Fenster aufgerufen. Dann geben Sie einen Namen ein, um die Daten und klicken Sie auf OK. </li><li> Schließlich exportieren Sie die Daten der Statistik-Software wie Graph Pad oder Excel-Programm. Verwenden Sie t-Test, um die Daten zu analysieren, dann zeichnen 2D grAPHS. </li></ol>

<ol>
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem County Council von Östergötland, (Schweden) und der Cellular and Molecular Research Center an der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) unterstützt.

In der aktuellen Protokoll beschäftigten wir 3D-konfokale Morphometrie zu 12 verschiedene Parameter, die mit Astrozytenmorphologie verbunden waren zu bewerten. Hierzu Hippocampusgewebe von Ratten mit 1-40 - induziert wurden Astrogliose, mit oder ohne Vorbehandlung Genistein als entzündungshemmendes Mittel verwendet. Durch Verwendung von 3D-Bildern und morphometrische Software, waren wir in der Lage, die Wirkung von Genistein auf Astrogliose dh der Morphologie von Astrozyten zeigen. <p class="jo...

Bei gesunden zentralen Nervensystems (ZNS), spielen Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutflusses, Energiestoffwechsel, synaptische Funktion und Plastizität und extrazellulären Ionen und Neurotransmitter Homöostase 1-3. Darüber hinaus Astrozyten reagieren auf verschiedene schädliche Reize und anormale Zustände wie Trauma, Infektion, Ischämie oder Neurodegeneration über reaktive Astrogliose die durch Hypertrophie, Proliferation und funktionellen Umgestaltung Astrozyten 4,5 gekennzeichnet ist. Reaktiv Astrogliose kann die Entzündungsreaktion und Reparaturprozesses in der Gewebezüchtung, und daher kann das klinische Ergebnis therapeutischer Maßnahmen beeinflussen. Dementsprechend Astrozyten Aufmerksamkeit von Neuro in den letzten Jahrzehnten als potentielle Ziele für therapeutische Interventionen für eine Vielzahl von Erkrankungen des ZNS erhalten. Astrozyten haben normalerweise eine Sternform mit gut defined Zweige, die rund um den Soma 6 zu verbreiten. In einem erkrankten Zustand, in dem Gehirn, Astrozyten Verzweigungen verworren und zeigen gequollenen Enden 7, beispielsweise in Gegenwart von Amyloid-beta (Aß). Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Analyse von 3D-Bildern von Astrozyten durch konfokale Mikroskopie erworben. Zwölf verschiedene quantitative Parameter für jeden Astrozyten wurden gemessen: die Flächen und Volumina der Astrozyten-Gebiet (die durch einen überdachten Astrozyten Gewebe), gesamte Zelle (einschließlich Zweigniederlassungen), Zellkörper und Kern; die Gesamtlänge und die Zahl der Filialen; die Fluoreszenzintensität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet; und die Dichte der Astrozyten (Anzahl / 1.000 &amp; mgr; m 2). Zu diesem Zweck verwendeten wir Gehirnschnitten von Ratten, um die Injektion von 1-40 mit oder ohne Genistein Behandlung eines entzündungshemmenden Substanz intrahippocampal belichtet. Das beschriebene Protokoll kann für eine morphometrische verwendet werdenalysis verschiedener Zelltypen in vitro oder in vivo in verschiedenen Bedingungen.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Gliazellen im Gehirn haben Astrozyten diverse funktionelle Rolle im zentralen Nervensystem. In Gegenwart von schädlichen Stimuli, Astrozyten ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften, eine so genannte reaktive Astrogliose modifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Beurteilung der morphologischen Eigenschaften der Astrozyten wird vorgestellt. Dieses Protokoll umfasst die Quantifizierung der 12 verschiedene Parameter, dh die Fläche und das Volumen der von einem Astrozyten (Astrozyten Gebiet) abgedeckt Gewebe, das gesamte Astrozyten einschließlich Filialen, Zellkörper und Kern sowie Gesamtlänge und die Anzahl der Filialen, die Intensität Fluoreszenz Immunreaktivität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet, und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2). Hierzu dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Bilder wurden erzeugt und 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.3 wurde für die Messungen verwendet. Rattenhirngewebe, um Beta-Amyloid 1-40 ausgesetzt </sub&gt; (1-40) mit oder ohne einen therapeutischen Eingriff verwendet wurde, um das Verfahren darzustellen. Dieses Protokoll kann auch für 3D morphometrische Analyse anderer Zellen entweder in vivo oder in vitro-Bedingungen verwendet werden.

Dieser Abschnitt enthält einige Beispiele für die qualitative und quantitative Beobachtungen 3D morphometrische Analyse hergestellt. Die vollständigen Ergebnisse aller 12 zuvor genannten Parameter finden Sie in unserer früheren Veröffentlichung 10. Qualitative Beobachtungen Astrozyten zeigten dünne oder dicke Äste, die in der Regel in 1-40 injizierten Ratten (Abbildung 1) lang waren. Einige kleine sternförmigen Astro...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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