The authors have nothing to disclose.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH) eingestellt Politik von Ethic Ausschuss der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) zugelassen wurde. 1. Tiere, Chirurgie und Probenvorbereitungen HINWEIS: Bereiten Hirngewebe für 3D-konfokale mikroskopische Analyse. <ol><li> Divide Tiere zufällig in zwei Gruppen: 1-40 -Injektion (n = 8) und 1-40 -Injektion mit Genistein Behandlung (n = 8); verabreichen Genistein (10 mg / kg in einem Vehikel verdünnt wie polyethoxyliertes Rizinusöl) per Schlundsonde 1 Stunde vor der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch einen Mangel an Ziehreflex nach dem Einklemmen des Zehe. Verwenden Salbe auf die Augen während der Operation bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Zeigen Tiere in stereotaktischen Apparat und rasieren Kopf. Bewerben iodine Lösung, um die Kopfhaut vor dem Schnitt säubern und zu halten, das den Betrieb vor Ort sterile während der Operation, um das Infektionsrisiko zu verringern. Injizieren 1-40 stereotaktisch (4 ul) im Hippocampus bei -3,5 mm hinter Bregma, ± 2 mm lateral zur Mittellinie, und -2,8 mm unterhalb dura nach Rattenhirnatlas 8. Für stereotaktischen Verfahren finden Sie in früheren Veröffentlichung 9. </li><li> Geben Sie postoperative Beobachtungs / Pflege, bis die Tiere bei vollem Bewusstsein, um den Komfort der Tiere zu gewährleisten. Halten Sie die Tiere warmen während der Wiederherstellung, und schützen Sie sie vor einem Käfig mit anderen Tieren zurück, bis vollständige Genesung. Achten Sie auf Anzeichen von Infektionen bei den Tieren nach der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere tief von Ketamin (150 mg / kg) drei Wochen nach der Operation. Führen transkardialer Fixierung durch Perfusion die Tiere mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH = 7,4), dann entfernen und zu beheben Gehirn wie in 10 beschrieben &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd für 2-3 Tage bei 4 ° C. </li><li> Betten Sie das Gewebe in Paraffinblöcke durch die Verwendung von Gewebeeinbettungstechnik und vermeiden Unterfüllung oder Überfüllung der Kassette, da es mit der richtigen Ausrichtung oder Schnitte stören. Achten Sie auf die Ausrichtung des Gewebes in der Paraffinblock. HINWEIS: Die Ratte Hippocampus, zum Beispiel, ist in der Nähe von hinteren Teil der Hirnhemisphäre. Somit sollte das Gewebe in einer Art und Weise eingebettet werden, dass Schneiden beginnt am hinteren Teil des Gehirns. Verwenden Sie die Paxinos atlas 8 als Führung, um den gewünschten anatomischen Struktur zu erreichen. </li><li> Legen Sie das Mikrotom von Zugluft oder Türöffnungen, da Luftbewegungen machen die Handhabung der Teile schwierig. </li><li> Verwenden Abschnitte mit einer Dicke ≥20 um, wie diese Tiefe mit notwendig sein, Z-Stapel-Bilder von kompletten Astrozyten produzieren. Verwenden Sie nicht die ersten paar Abschnitte, da sie unerwünschte Dicke haben können, aufgrund der thermischen eXpansion. </li><li> Legen Sie die Teile auf der Oberfläche mit warmem Wasser (5 ± 2 C unterhalb der Schmelztemperatur für Paraffin) gerade lang genug, um die Abschnitte zu glätten. HINWEIS: Überexpansion des Profils kann die Morphologie der Struktur stören. Verwenden Sie kleine Pinsel, um vorsichtig zu übertragen Abschnitten. Sammeln Sie zwei vor drei Abschnitten auf jeder Folie. </li><li> Shop Dias in einem Rack in einer aufrechten Position und lassen Sie sie für mehrere Stunden oder O / N trocken bei 37 ° C. </li></ol> 2. Immunhistochemie <ol><li> Entparaffinieren Abschnitte in Xylol, 2 x 10 min, und rehydratisieren durch Alkohol-Gradienten (99,8%, 95% und 70%, jeweils 10 min) und PBS. </li><li> Inkubieren mit Antikörpern gegen saures Gliafaserprotein (GFAP), verdünnt 1: 1500 in PBS, das 0,25% Rinderserumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 und 3,5% normales Serum (O / N bei 4 ° C). </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Inkubieren mit sekundärem alkalische Phosphatase konjugierten antibodies für 1 h (1: 100, 21 C, verdünnt in PBS). </li><li> Für 3 x 5 min Waschen Sie die Schnitte in PBS. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Abschnitte richtig waschen, nachdem Sekundärantikörper, um Hintergrundfärbung zu minimieren. </li><li> Abschnitte in Dunkelheit inkubieren mit Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Hinweis: Bereiten Sie die Lösung nicht mehr als 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Schließlich färben die Kerne mit 4-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1: 500, verdünnt in PBS) vor der Deckung Rutsch. Speichern Sie die Folien im Kühlschrank 24-48 h vor der Mikroskopie. </li></ol> 3. konfokale Mikroskopie HINWEIS: Zur quantitativen Auswertung (siehe unten), wählen Sie eine Astrozyten mit einem deutlich sichtbaren DAPI-gefärbten Zellkern mit einem Minimum von überlappenden Ästen, um das Fehlerrisiko zu verringern. Herstellung von Z-Bilder Stapeln ist zeitaufwendig. Seien Sie geduldig und nicht während der Verarbeitung zu stoppen. Upright konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ist used, um 3D-Bilder von Astrozyten zu erstellen. <ol><li> Setzen Sie den Schieber auf der Mikroskop-Bühne, und wählen Sie das 63X Ziel. </li><li> Öffnen Sie die Imaging-Software und klicken Sie auf Start-System. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen. Zum Ordnen und wählen GFP, um die richtige Licht einzustellen. </li><li> Öffnen Sie den Auslöser, um Licht zu reflektieren. Finden Sie den Reflektor Revolver auf der rechten Seite der Shutter und wählen Sie die Farbe, die von Astrozyten (grün, rot oder violett) widerspiegeln sollte; rote Farbe (FSet20 wf) wurde verwendet. HINWEIS: Vergessen Sie nicht, um das Bild direkt in das Okular des Mikroskops zu konzentrieren. </li><li> Um den besten Fokus zu finden, klicken Sie auf alle geschlossen, legte das Mikroskop Stift im Bildmodus, und klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition. </li><li> Klicken Sie auf Smart Setup im Register Acquisition; öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie die richtige Fluorophors (dh DAPI und Alexa Fluor 555, im aktuellen Projekt) aus der Liste. Die Farbe wird automatisch ausgewählt. </li><li> Klicken Sie auf das beste Signal und Übernehmen, und klicken Sie auf Set Exposure; der Computer wird dann automatisch die Belichtungsparameter eingestellt. </li><li> Zur Optimierung der Bild, gehen Sie zum Fenster Kanäle. Unmark Track2, markieren Track1 und klicken Sie auf Live. Stellen Sie das Bild, wenn nötig. </li><li> Im Fenster Kanäle passen Sie die folgenden Tasten; klicken Sie 1AU automatisch optimieren die Lochkamera. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt sonst die konfokale Bilder werden nicht optimalen tun. Verstärkung anpassen um das beste Intensität (halten Sie diese Einstellung unter 800, um zusätzliche Rauschen zu verringern) zu haben. Schließlich, stellen Sie die digitale Verstärkung zwischen 2 und 3. </li><li> Unmark Track1, klicken Sie auf Track2 und wiederholen Sie Schritt 3.8 für Track2. Dann hör Live. </li><li> Zum Erfassungsmodus-Fenster. Verbessern Sie das Image durch die Optimierung der Bildgröße und Mittelung. Um das zu ändern Frame-Größe auf X * Y und wählen 1.024 x 1.024. Wählen Sie eine langsame Geschwindigkeit, um ein besseres Bild zu erzeugen. </li><li> Zum Mittelwertbildung und wählen Sie eine Anzahl ≥4. Diese Mittelung Wert gibt die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um produc werdene die erfasste Bild. Klicken Sie nun auf den Druckknopf, und speichern Sie die aufgenommenen Bildes 2D. </li><li> Für 3D-Bildgebung, markieren Sie die Z-Stapel Element unter Smart Setup wodurch die Z-Stapel-Fenster zu öffnen. </li><li> Setzen die ersten und letzten Positionen für die Z-Stapel, dh die Tiefe der Zelle ist. Klicken Sie zunächst auf Live. Dann nutzen Sie den Fokustrieb des Mikroskops auf die oberste Position der Astrozyten im Gewebe, wobei die Z-Stapel ist zu Beginn zu konzentrieren. Klicken Sie auf Set Erste. Dann konzentriert bis zur untersten Position der Astrozyten im Gewebe, in dem Z-Stapel Abtastung gestoppt werden soll. Klicken Sie auf Set Last. Dann hör Live. </li><li> Wählen Sie das Intervall; 1,01 &amp; mgr; m in der vorliegenden Studie verwendet wird; Wahl-Intervall kann durch Klicken auf Optimal, um die Anzahl der Schichten eingestellt erfolgen. </li><li> Klicken Sie auf Start Experiment. Speichern Sie die Bilder, sobald die Überprüfung abgeschlossen ist. Oberfläche und Volumen der Astrozyten Gebiet der gesamte Astrozyten einschließlich BH: Dieses Bild wird für die Messung der folgenden Parameter verwendet werdennches, Zellkörper und Kern. </li><li> Erwerben Sie ein 2D-Bild mit einem 10X oder 20X Ziel wie in den Schritten 3,6-3,11 beschrieben. Dieses Bild kann für die Messung der Intensität der Fluoreszenz Immunreaktivität des Antikörper und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2) verwendet werden. </li></ol> 4. Astrocyte Dichte und GFAP + Fluoreszenzintensität <ol><li> Öffnen Sie das 20X 2D-Bild. Klicken Sie auf Histo (Hisogram) auf der linken Seite des Bildfensters. </li><li> Um Astrozyten Dichte zu berechnen, wählen Sie drei aufeinander folgenden Gesichtsfelder unter 20x-Objektiv. Zählen Sie die Anzahl der Astrozyten, die eine klare soma aufweisen mit einem Minimum an, sich überlappenden Niederlassungen in den Feldern. </li><li> Um Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, wählen Sie ein geeignetes Werkzeug (Rechteck oder Kreis) in der Fußzeile der Bildfenster, und wählen Sie einen Bereich für die Messung. Beachten Sie, der Mittelwert und Standardabweichung automatisch unter dem Bild erscheinen. In der aktuellen Studie, ein 0,7 mm 2 rechteckigen Bereich zwischen striatum und mediale Klinge Gyrus dentatus wurde verwendet. </li></ol> 5. Astrocyte Branchen <ol><li> Um die Länge und die Gesamtzahl der Filialen zu quantifizieren, verwenden Sie 3D-Bilder (mit 20X erworben) in der Bildanalysesoftware. Zeichnen Sie eine Linie von Hand entlang der Länge jedes Zweiges des ausgewählten Astrozyten. Wählen Sie dann den Mess-Tool, das zur Messung von Leitungslängen spezialisiert ist. Um die Zahl der Filialen zu quantifizieren, wählen Sie den Count-Werkzeug, um die Anzahl der markierten Objekte zu zählen. </li></ol> 6. Volumen und Oberfläche HINWEIS: Markieren einer Struktur manuell in 3D-Bildanalyse-Software erfordert Fokus und Ausbildung. Üben Sie mehrmals, bevor ein Experiment. <ol><li> Um das Volumen und Oberfläche des Astrozyten-Zellkern, soma, Zellkörper und Territorium zu quantifizieren, übertragen Sie die 3D-Bilder (in Schritten von 3,1 bis 3,16 erworben) zu einem 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.1. </li><li> Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine neueBibliothek. Ziehen Sie alle Bilder auf der linken grauen Spalte in der neuen Bibliothek. Dann wählen Sie eine 3D-Bild. Auf der rechten Seite gibt es unterschiedliche Kanäle mit unterschiedlichen Farben. Schalten Sie einen Kanal von Interesse; beispielsweise die Blaukanal für DAPI bei der Messung der Zellkern. Ändern Sie die Helligkeit manuell, um einen optimalen Kontrast zu erhalten. </li><li> Wählen Sie das Menü Extras finden Sie auf Volume Stellen und erzeugen ein einziges 3D-Bild von Z-Stapel-Bildern. Klicken Sie auf Eigenschaften in dem Menü Bearbeiten und stellen Sie sicher, dass X, Y und Z-Eigenschaften werden vorgestellt; sonst ist es unmöglich durchzuführen 3D-Analyse. </li><li> Klicken Sie auf das Freihand-RIO-Werkzeug-Symbol in der Symbolleiste. Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkern zu messen ziehen Sie eine Linie um den DAPI-markierten Zellkern. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkörper zu messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma ohne Filialen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der gesamten Astrozyten (Zellkörper einschließlich Zweigniederlassungen) messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma nach demFläche aller Branchen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Gebiet zu bewerten ziehen Sie eine Linie zwischen den Spitzen der Zweige. HINWEIS: Drücken Sie Entf auf der Tastatur, um unerwünschte Zeichnungen zu löschen. </li><li> Klicken Sie auf die Messungen-Menü am oberen Rand des Bildfensters, um ein Messprotokoll zu erstellen; ein Fenster mit verschiedenen Werkzeugen geöffnet. </li><li> Ziehen Sie die Objekte finden, um oben im Fenster (Fensterbereich). Geben Sie einen aussagekräftigen Namen für die Bevölkerung ein, wählen Sie die zugehörigen Farbe, und klicken Sie auf Messen. Ein weiteres Fenster öffnet sich. </li><li> Wählen Sie einen Parameter, dh, das Volumen oder Fläche. Klicken Sie auf OK. Die Daten werden in einer Tabelle angezeigt. </li><li> Um die Daten klicken Sie auf das Menü Messung zu speichern und wählen Machen Mess Artikel. </li><li> Wählen Sie einen neuen Messpunkt aus dem geöffneten Fenster aufgerufen. Dann geben Sie einen Namen ein, um die Daten und klicken Sie auf OK. </li><li> Schließlich exportieren Sie die Daten der Statistik-Software wie Graph Pad oder Excel-Programm. Verwenden Sie t-Test, um die Daten zu analysieren, dann zeichnen 2D grAPHS. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem County Council von Östergötland, (Schweden) und der Cellular and Molecular Research Center an der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) unterstützt.

In der aktuellen Protokoll beschäftigten wir 3D-konfokale Morphometrie zu 12 verschiedene Parameter, die mit Astrozytenmorphologie verbunden waren zu bewerten. Hierzu Hippocampusgewebe von Ratten mit 1-40 - induziert wurden Astrogliose, mit oder ohne Vorbehandlung Genistein als entzündungshemmendes Mittel verwendet. Durch Verwendung von 3D-Bildern und morphometrische Software, waren wir in der Lage, die Wirkung von Genistein auf Astrogliose dh der Morphologie von Astrozyten zeigen. <p class="jo...

Bei gesunden zentralen Nervensystems (ZNS), spielen Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutflusses, Energiestoffwechsel, synaptische Funktion und Plastizität und extrazellulären Ionen und Neurotransmitter Homöostase 1-3. Darüber hinaus Astrozyten reagieren auf verschiedene schädliche Reize und anormale Zustände wie Trauma, Infektion, Ischämie oder Neurodegeneration über reaktive Astrogliose die durch Hypertrophie, Proliferation und funktionellen Umgestaltung Astrozyten 4,5 gekennzeichnet ist. Reaktiv Astrogliose kann die Entzündungsreaktion und Reparaturprozesses in der Gewebezüchtung, und daher kann das klinische Ergebnis therapeutischer Maßnahmen beeinflussen. Dementsprechend Astrozyten Aufmerksamkeit von Neuro in den letzten Jahrzehnten als potentielle Ziele für therapeutische Interventionen für eine Vielzahl von Erkrankungen des ZNS erhalten. Astrozyten haben normalerweise eine Sternform mit gut defined Zweige, die rund um den Soma 6 zu verbreiten. In einem erkrankten Zustand, in dem Gehirn, Astrozyten Verzweigungen verworren und zeigen gequollenen Enden 7, beispielsweise in Gegenwart von Amyloid-beta (Aß). Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Analyse von 3D-Bildern von Astrozyten durch konfokale Mikroskopie erworben. Zwölf verschiedene quantitative Parameter für jeden Astrozyten wurden gemessen: die Flächen und Volumina der Astrozyten-Gebiet (die durch einen überdachten Astrozyten Gewebe), gesamte Zelle (einschließlich Zweigniederlassungen), Zellkörper und Kern; die Gesamtlänge und die Zahl der Filialen; die Fluoreszenzintensität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet; und die Dichte der Astrozyten (Anzahl / 1.000 &amp; mgr; m 2). Zu diesem Zweck verwendeten wir Gehirnschnitten von Ratten, um die Injektion von 1-40 mit oder ohne Genistein Behandlung eines entzündungshemmenden Substanz intrahippocampal belichtet. Das beschriebene Protokoll kann für eine morphometrische verwendet werdenalysis verschiedener Zelltypen in vitro oder in vivo in verschiedenen Bedingungen.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Gliazellen im Gehirn haben Astrozyten diverse funktionelle Rolle im zentralen Nervensystem. In Gegenwart von schädlichen Stimuli, Astrozyten ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften, eine so genannte reaktive Astrogliose modifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Beurteilung der morphologischen Eigenschaften der Astrozyten wird vorgestellt. Dieses Protokoll umfasst die Quantifizierung der 12 verschiedene Parameter, dh die Fläche und das Volumen der von einem Astrozyten (Astrozyten Gebiet) abgedeckt Gewebe, das gesamte Astrozyten einschließlich Filialen, Zellkörper und Kern sowie Gesamtlänge und die Anzahl der Filialen, die Intensität Fluoreszenz Immunreaktivität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet, und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2). Hierzu dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Bilder wurden erzeugt und 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.3 wurde für die Messungen verwendet. Rattenhirngewebe, um Beta-Amyloid 1-40 ausgesetzt </sub&gt; (1-40) mit oder ohne einen therapeutischen Eingriff verwendet wurde, um das Verfahren darzustellen. Dieses Protokoll kann auch für 3D morphometrische Analyse anderer Zellen entweder in vivo oder in vitro-Bedingungen verwendet werden.

Dieser Abschnitt enthält einige Beispiele für die qualitative und quantitative Beobachtungen 3D morphometrische Analyse hergestellt. Die vollständigen Ergebnisse aller 12 zuvor genannten Parameter finden Sie in unserer früheren Veröffentlichung 10. Qualitative Beobachtungen Astrozyten zeigten dünne oder dicke Äste, die in der Regel in 1-40 injizierten Ratten (Abbildung 1) lang waren. Einige kleine sternförmigen Astro...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Aufrufe.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Serie: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Morphometrische Analysen von Netzhautschnitte

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Denver Papillen Protokoll für objektive Analyse der pilzförmige Papillen

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Dreidimensionale Formmodellierung und Analyse von Gehirnstrukturen

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.