The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

واستمرت كل الفئران والتعامل معها وفقا لقانون رعاية الحيوان السويسري وامتثالا لتعليمات مكتب كانتون البيطرية، زيورخ. 1. إعداد تشريح المواد، الثقافة وسائل الإعلام، أجهزة ميكروفلويديك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف ملقط تشريح الصغرى والمقص (121 ° C، التعقيم الوقت: 20 دقيقة) وتخزينها في حاوية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم coverslips الزجاج (24 ملم × 24 ملم) التي يحتضنها منهم في 1 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 24 ساعة على شاكر المداري عند 37 درجة مئوية. غسلها ثلاث مرات مع معقم، المقطر H 2 O وثلاث مرات مع الإيثانول 99٪. جاف ثم لل coverslips عند 37 درجة مئوية أو تحت غطاء تدفق العقيمة. أخيرا، الأوتوكلاف أو فضح لل coverslips للأشعة فوق البنفسجية (30 دقيقة) لإتمام عملية التعقيم. ويمكن بعد ذلك أن يتم تخزين Coverslips في الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الأجهزة عزل AXIS أكسون من الحزمة باستخدام ملقط معقم ووضعها في طبق بتري معقمة. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن طريق خزعة لكمة معقمة (ø: 1MM) خلق ثقب واحد لكل عينة من زراعتها (الشكل 1) في المراسلات الدوائر الثقافة. ملاحظة: لا لكمة قريبة جدا من microgrooves، لأنها قد تكون تضررت من الضغوط التي مورست. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأجهزة عزل AXIS أكسون التي كتبها immerging لهم في الايثانول 70٪. ثم الجافة الأجهزة عزل AXIS أكسون وcoverslips تماما تحت غطاء تدفق العقيمة. الانتظار لمدة لا تقل عن 3 ساعات قبل المتابعة. ملاحظة: تجفيف ناقصة ستؤدي إلى التجمع على عيب من الأجهزة ميكروفلويديك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل ساترة إلى 35 مم طبق بتري أو في بئر داخل لوحة 6 آبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع AXIS أكسون عزل الأجهزة على ساترة واضغط بلطف ولكن بحزم مع ملقط مع نهايات عازمة من أجل السماح للالتصاق كامل بين الجهاز العزلة وساترة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل غرفة الثقافة، ماصة 150 ميكرولتر من بولي-D-ليسين (0.1 ملغ / مل في العقيمة، المقطر H 2O). وضع أجهزة ميكروفلويديك في ظل فراغ لمدة 5 دقائق، وذلك لإزالة كل الهواء من غرف الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما إذا كان يمكن النظر إلى الهواء داخل الغرف وإعادة ماصة الحل بولي-D-يسين في غرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجهزة مع O بولي-D-يسين / N عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل غرف ثلاث مرات مع معقم، H المقطر 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرف مع 150 ميكرولتر حل العاملة laminin (سيغما الدريتش، 5 ميكروغرام / مل، في برنامج تلفزيوني أو المصل خالية المتوسطة)، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50 مل من المتوسط ​​للثقافات العقد مثلث التوائم 37، تتألف على النحو التالي: 48 مل Neurobasal المتوسطة، 1 مل B-27، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 5 نانوغرام / مل عامل نمو الأعصاب (NGF) ، 12:25 السيتوزين الأرابينوزيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز 50 مل من المتوسط ​​للثقافات الجرثومية الأسنان 37، تتألف على النحو التالي: 40 مل DMEM-F12، 10 مل مصل بقري جنيني (FBS، التركيز النهائي: 20٪)، و 100 U / مل البنسلين / الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 150 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك. </li></ol> 2. ماوس الجيل الأجنة والتشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العمر الجنيني وفقا للسد عن طريق المهبل (المكونات المهبلية: يوم الجنينية للتنمية 0.5، E0.5) وتأكيد ذلك من خلال معايير شكلية. لهذا البروتوكول، ونحن عادة استخدام أجنة الفئران E14.5-E17.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف المنطقة تشريح والمجسام مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية الأم الحامل عبر خلع عنق الرحم. منع رقبة الفأر مع الإصبع الأول والثاني على الشبكة، وسحب لقرار الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الجلد حول الجزء الأسفل من البطن، وفتح البطن باستخدام مقص. تحديد الرحم: خلال هذه المراحل المتأخرة من الحمل، والرحم تملأ تماما تجويف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج الرحم ووضعه في أنبوب مملوء PBS على الجليد. عندما على الجليد، والأنسجة يمكن أن تترك لعدة ساعة. تجاهل جثة الأم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية </li> &lt;لى&gt; تشريح خارج الأجنة من الرحم وتحريرهم من أنسجتها خارج الجنين. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الأجنة باستخدام مقص، وفصل الفك السفلي عن بقية الرأس باستخدام مقص تشريح الصغيرة (الشكل 2A). إزالة بالضبط الفك السفلي، دون الإضرار العقد مثلث التوائم. كما يتم ترجمة هذا الأخير على مقربة من الفك السفلي، والضرر العرضي هو ممكن. الحفاظ على الفك السفلي وبقية الرأس في برنامج تلفزيوني الباردة، على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشريح TG، واتخاذ الرأس وضعه على طبق بتري الزجاج تشريح، وشغل سابقا مع PBS الباردة. باستخدام ملقط، إزالة الجلد والجمجمة. إزالة ثم الدماغ الانتهائي والمخيخ عن طريق وضع ملقط تحت الدماغ الانتهائي ورفع. فإن الدماغ الانتهائي والمخيخ الوجه معا، وترك الجزء السفلي من الجمجمة المكشوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توطين العقد الثلاثي التوائم (كما هو موضح في الشكل 2B). استخدام ملقطلفصل TG من الأعصاب مثلث التوائم. القضاء على ما تبقى من التوقعات مثلث التوائم باستخدام الإبر تشريح كما السكاكين. وضع TG تشريح في طبق بتري مليئة PBS الباردة والاحتفاظ بها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشريح الأسنان الجنينية، ووضع الفك السفلي، وفصلها في السابق من الجمجمة، وعلى الزجاج تشريح طبق بتري، مليئة PBS الباردة. استخدام الإبر تشريح كما السكاكين، وإزالة اللسان والجلد المحيط بها الفك. فصل اليسار واليمين بين فكي هيمي عن طريق قطع على طول خط الوسط من الفك. جراثيم الأسنان مرئية بسهولة، كما هو مبين في الشكل 1C. عزل جراثيم الأسنان باستخدام الإبر تشريح وإزالة الزائد من الأنسجة غير الأسنان. وضع جراثيم الأسنان تشريح في طبق بتري مليئة PBS الباردة والاحتفاظ بها على الجليد. </li></ol> 3. ميكروفلويديك المشارك الثقافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التشريح، وإزالة laminin من الأجهزة ميكروفلويديك. ملء الغرف مع 200 ميكرولتر من respectiلقد سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالملقط، ونقل بلطف تشريح TG والأسنان الجراثيم في الثقوب التي أنشأتها اللكم (1D الشكل). تأكد من أن الجراثيم الأسنان لا تطفو وأنها تغرق حتى الاتصال لل coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 48 ساعة. لا إفراغ غرف تماما، ولا ماصة مباشرة إلى غرف الثقافة. تفريغ كامل للغرف شأنه أن يؤدي إلى تشكيل فقاعات الهواء داخل غرف. سوف pipetting لمباشرة الى غرفة يؤدي إلى تلف المحاور. لتجنب هذه المشاكل، وإزالة المتوسطة مشيرا ماصة نحو الجانب الخارجي من الآبار. وبالمثل، ماصة متوسطة جديدة إلى جانب الآبار الواقعة قبالة الدوائر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الفترة الثقافة والثقافات شارك ويمكن تصويرها بسهولة عن طريق الوقت الفاصل بين المجهري. يمكن الحفاظ المشترك الثقافات لأكثر من 10 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اللثة الثقافةد، وغسل الدوائر من قبل pipetting 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في بئر واحدة لكل غرفة، والسماح PBS تتدفق من خلال الدوائر الثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإصلاح عينات من قبل pipetting 150 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (في برنامج تلفزيوني) في بئر واحدة لكل غرفة. في احتضان RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الدوائر مرتين مع PBS كما هو موضح في 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في مزيد من التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells.">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).</li><li>Katayama, Y., Battista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+sympathetic+nervous+system+regulate+hematopoietic+stem+cell+egress+from+bone+marrow.">Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow.</a> Cell. 124 (2), 407-421 (2006).</li><li>Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis.">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li><li>Oakley, B., Witt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+sensory+receptors+on+the+tongue.">Building sensory receptors on the tongue.</a> Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).</li><li>Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+mouse+vallate+gustatory+epithelium+and+taste+buds+requires+BDNF-dependent+taste+neurons.+Brain+research.">The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research.</a> Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).</li><li>Sun, H., Oakley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anterior+gustatory+epithelia+in+the+palate+and+tongue+requires+epidermal+growth+factor+receptor.">Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor.</a> Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).</li><li>Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+size,+number,+and+morphology+of+gustatory+papillae+and+taste+buds+in+BDNF+null+mutant+mice+demonstrate+neural+dependence+of+developing+taste+organs.">Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs.</a> The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).</li><li>Mitsiadis, T. a., Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+during+tooth+development+and+regeneration.">Cell fate determination during tooth development and regeneration.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).</li><li>Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histological+study+of+the+innervation+of+developing+mouse+teeth.">A histological study of the innervation of developing mouse teeth.</a> Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).</li><li>Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+fibres+during+development+of+embryonic+rat+molar+using+peripherin+and+protein+gene+product+9.5+antibodies.">Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies.</a> Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).</li><li>Johnsen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+teeth:+qualitative,+quantitative,+and+developmental+assessment.">Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment.</a> Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).</li><li>Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+growth+factor+(NGF)+and+NGF+receptor+(NGF-R)+in+the+developing+first+molar+tooth+of+the+rat.">Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat.</a> Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).</li><li>Mitsiadis, T. a., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+in+odontogenesis.">Neurotrophins in odontogenesis.</a> The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).</li><li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kettunen, P., L&#248;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+trigeminal+axon+navigation+and+patterning+with+tooth+organ+formation:+epithelial-mesenchymal+interactions+and+epithelial+Wnt4+and+Tgfbeta1+regulate+semaphorin+3a+expression+in+the+dental+mesenchyme.">Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme.</a> Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).</li><li>Tuisku, F., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+neural+influence+on+tooth+germ+generation+in+a+polyphyodont+species.">Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species.</a> Developmental biology. 165, 1-9 (1994).</li><li>Zhao, H., Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+rudimentary+diastema+tooth+primordia+are+devoid+of+peripheral+nerve+fibers.">Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers.</a> Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).</li><li>Lumsend, A., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+timing+and+topography+of+early+tooth+development+in+the+mouse+embryo.">An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo.</a> Archives of oral biology. , 301-311 (1986).</li><li>Kollar, E., Lumsend, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+tooth+morphogenesis+and+neuronal+development+through+tissue+interactions:+lessons+from+mouse+models.">Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models.</a> Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Lumsend, A., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323 (9), 538-539 (1986).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).</li><li>Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Nogo-A+regulates+neurite+fasciculation,+branching+and+extension+in+the+developing+nervous+system.">Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system.</a> Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).</li><li>Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odontogenesis.">Odontogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 887, (2012).</li><li>Mitsiadis, T. a., Drouin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Pitx1+genomic+locus+affects+mandibular+tooth+morphogenesis+and+expression+of+the+Barx1+and+Tbx1+genes.">Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes.</a> Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll/interleukin-1+receptor+domain-containing+adapter+inducing+interferon-&#946;+mediates+microglial+phagocytosis+of+degenerating+axons.">Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-&#946; mediates microglial phagocytosis of degenerating axons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).</li><li>Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+on+microfluidics:+multimodal+analysis+for+studying+celll-cell+interaction.">Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction.</a> Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).</li><li>Neto, E., Alves, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+neurons+and+osteoblasts:+close+partners+in+a+microfluidic+environment.">Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment.</a> Integrative Biology. , (2014).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#233;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li><li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maxillary+factor,+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons.">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

سابقة في الدراسات المختبرية من تعصيب الأسنان استندت شارك الثقافات التقليدية من العقد مثلث التوائم وأنسجة الأسنان أو خلايا 26،28،29. وأجريت هذه الدراسات للتحقيق أساسا الآثار جذابة من هذه الخلايا أو الأنسجة على محاور الحسية 38. على الرغم من تحقيق تق?...

تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة 1،2. وعلاوة على ذلك، تشارك تعصيب في تنظيم تكاثر الخلايا الجذعية، وتعبئة والتمايز 3-5. في الواقع، أظهرت الدراسات الأخيرة التي تحققت في أنسجة مجمع فموي وجهي أن الأعصاب الحركية ضرورية لالظهارية وظيفة الخلايا الاصلية خلال تطوير وتجديد اللعابية الغدد 6،7. وبالمثل، فقد ثبت أن تعصيب ضروري لتطوير وصيانة براعم الذوق 8-11. وبالتالي، فمن المهم تحليل الأدوار إلا أنها مهملة من تعصيب في تطوير أجهزة فموي وجهي الهامة الأخرى والأنسجة مثل الأسنان. على الرغم من تعصيب غنية من أسنان الكبار، وعلى النقيض من جميع الأعضاء والأنسجة الأخرى في الجسم، develoالأسنان بينغ تبدأ في أن معصب في المراحل الأولى بعد الولادة. تنشأ الأسنان نتيجة للتفاعلات متسلسلة ومتبادلة بين الأديم الظاهر عن طريق الفم والجمجمة العصبية المشتقة من قمة اللحمة المتوسطة. هذه التفاعلات تؤدي إلى خلايا تكوين المينا المستمدة الظهارية والخلايا المولدة للعاج المستمدة من اللحمة المتوسطة التي هي المسؤولة عن تشكيل المينا وعاج الأسنان، على التوالي 12. الأعصاب الحسية من العقد مثلث التوائم والأعصاب متعاطفة من العقد عنق الرحم متفوقة يعصب أسنان البالغين 13-15. خلال مرحلة التطور الجنيني، الألياف العصبية المنبثقة عن مشروع العقد الثلاثي التوائم نحو جراثيم الأسنان النامية وتدريجيا تحيط بهم ولكنها لا تخترق حليمة اللحمة المتوسطة طب الأسنان (13). الألياف العصبية تدخل اللب اللحمة المتوسطة الأسنان في مراحل نمو أكثر تقدما التي ترتبط مع التمايز مصورات العاج وعاج مصفوفة ترسب 16. لب الأسنان تعصيب هو COMPLeted قريبا بعد بزوغ الأسنان في تجويف الفم (13). وقد كشفت الدراسات السابقة بأن مختلف semaphorins وneurotrophins يشاركون في تنظيم تعصيب أثناء تكون السن 16-19. وقد أثبتت دراسات سابقة بوضوح أن تعصيب هو شرط أساسي لتكوين الأسنان في الأسماك 20. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن توازن الخلايا الجذعية اللحمة المتوسطة الأسنان في القواطع الماوس ينظمه الأعصاب الحسية عن طريق إفراز القنفذ سونيك (SHH) 21. ومع ذلك، فإن دور تعصيب في السن بدء وتطوير وتجديد لا يزال مثيرا للجدل في الثدييات 22-24. وقد قدم عدد كبير من الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية 13،25،26. ومع ذلك، فإن معظم هذه APPROأوجاع ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة. المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة 26-29. في الوقت نفسه، وشارك في زراعة تخضع لتعديلات فنية مختلفة. على سبيل المثال، الأعصاب والأنسجة الأسنان محددة (على سبيل المثال، لب الأسنان، جريب الأسنان، طب الأسنان ظهارة) غالبا ما تتطلب ثقافة وسائل الإعلام المختلفة من أجل ضمان بقاء الأنسجة لفترات طويلة من الزمن 30-32. في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين) للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية 27-29.ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي، ودراسة ديناميات الألياف العصبية المتفرعة داخل الأجهزة المستهدفة. ولذلك، فإن غير متجاورة المشترك الثقافات يكون أكثر ملاءمة لإجراء دراسات على الخلايا العصبية الأسنان الأنسجة التفاعلات. نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. في هذه الأجهزة، يتم فصل الأنسجة الأسنان والخلايا العصبية في أماكن مختلفة، بينما يسمح للنمو من المحاور من أجسام الخلايا العصبية من خلال microchannels نحو مقصورة تحتوي على الأنسجة المستهدفة 33. تم الأجهزة ميكروفلويديك تستخدم بالفعل لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة 34،35، فضلا عن الخلية إلى التفاعلات الخلية في سرطان واتساع الأوعية الدموية 35. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمت هذه الأنظمة لدراسة التفاعلات بين DORSآل العقد الجذرية وبانيات 36. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك 37. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن الأسنان من مراحل تنموية مختلفة الحفاظ في هذه الظروف في المختبر نفس الآثار مثير للاشمئزاز أو جذابة على تعصيب مثلث التوائم أنها تظهر في الجسم الحي 37. وينص هذا البروتوكول على معلومات حول طريقة بسيطة وقوية ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة دور جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في بيئة تسيطر عليها والمعزولة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AXIS Axon Isolation Devices</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX15010-TC</td>
			<td>Microchannels of different lenght are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse beta-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1156-NG-100</td>
			<td>Human and Rat beta-NGF (R&#38;D Systems) are equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices

تعصيب يلعب دورا رئيسيا في تطوير والتوازن وتجديد الأعضاء والأنسجة. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الظواهر ليست مفهومة جيدا حتى الآن. على وجه الخصوص، وإهمال دور تعصيب في نمو الأسنان والتجدد. قدمت عدة الدراسات المجراة على معلومات هامة حول أنماط تعصيب من أنسجة الأسنان خلال عمليات التنمية وإصلاح مختلف النماذج الحيوانية. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب ليست الأمثل لتسليط الضوء على الأساس الجزيئي للتفاعلات بين الألياف العصبية والأجهزة المستهدفة والأنسجة. المشترك الثقافات تشكل وسيلة قيمة للتحقيق والتعامل مع التفاعلات بين الألياف العصبية والأسنان في بيئة تسيطر عليها والمعزولة. في العقود الأخيرة، وقد أجريت التقليدية المشترك الثقافات باستخدام نفس مستنبت لفترات قصيرة جدا (على سبيل المثال، يومين)للتحقيق في الآثار جذابة أو مثيرة للاشمئزاز لتطوير أنسجة الفم والأسنان على الألياف العصبية الحسية. ومع ذلك، لا بد من تمديد فترة ثقافة للتحقيق في آثار تعصيب على التشكل الأسنان وتمايز خلوي. نظم على microfluidics تسمح المشترك الثقافات من الخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة المناسب لها. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن العقد الثلاثي التوائم (TG) والأسنان قادرين على البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من الزمن عندما شارك في تربيتها في أجهزة ميكروفلويديك، وأنها تحافظ في هذه الظروف نمط تعصيب نفسه أنها تظهر في الجسم الحي. على هذا الأساس، نحن تصف كيفية عزل ويصف التعاون ثقافة تطوير مثلث التوائم العقد والأسنان الجراثيم في البروتوكول ميكروفلويديك شارك في الثقافة system.This وسيلة بسيطة ومرنة للمشاركة في ثقافة العقد / الأعصاب والأنسجة المستهدفة ودراسة الأدوار من جزيئات محددة بشأن هذه التفاعلات في مقاولاتolled وبيئة معزولة.

وتشير هذه النتائج إلى أن العقد الثلاثي التوائم معزولة يمكن أن تنمو في حجرة واحدة من الجهاز ميكروفلويديك وبالإضافة إلى ذلك، أن تطور جراثيم الأسنان معزولة وتدوم لفترة طويلة من الوقت في حجرة أخرى من الجهاز ميكروفلويديك. وتستخدم وسائل الإعلام ثقافة مختلفة في القسمين، و...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices at JoVE.com

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

تحليل وضع الأسنان جرثومة تعصيب استخدام أجهزة ميكروفلويديك المشارك الثقافة

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Views.  University of Zurich. Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Video: Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

وحدة للسيارات وظيفية في صحن الثقافة: شارك في ثقافة Explants النخاع الشوكي وخلايا العضلات

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

التقييم الوظيفي والمورفولوجية من الحجاب الحاجز تعصيب من قبل الحجابي موتور الخلايا العصبية

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

عالية الدقة حجم التصوير من الخلايا العصبية باستبعاد استخدام Fluorescence الأسلوب وكرست أجهزة موائع جزيئية

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

الحصول على البيانات وتحليلها في الدماغ أثار استجابة القياس السمعي في الفئران

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

جيل من Oligodendrocytes وOligodendrocyte- متوسطة مكيفة للتجارب الثقافة المشتركة

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

النقل المحوري للأرغنفيات في ثقافات الخلايا العصبية الحركية باستخدام نظام غرف السوائل الدقيقة

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the cranial dura mater using immunofluorescence, three-dimensional (3D) reconstruction and retrograde tracing technique. Here, the nerve fibers and blood vessels were stained using immunofluorescence and histochemistry techniques with CGRP and fluorescent phalloidin, respectively. The spatial correlation of dural CGRP-immuoreactive nerve fibers and blood vessels were demonstrated by 3D reconstruction. Meanwhile, the origin of the CGRP-immunoreactive nerve fibers were detected by neural tracing technique with fluorogold (FG) from the area around middle meningeal artery (MMA) in the cranial dura mater to the trigeminal ganglion (TG) and cervical (C) dorsal root ganglia (DRGs). In addition, the chemical characteristics of FG-labeled neurons in the TG and DRGs were also examined together with CGRP using double immunofluorescences. Taking advantage of the transparent whole-mount sample and 3D reconstruction, it was shown that CGRP-immunoreactive nerve fibers and phalloidin-labeled arterioles run together or separately forming a dural neurovascular network in a 3D view, while the FG-labeled neurons were found in the ophthalmic, maxillary, and mandibular branches of TG, as well as the C2-3 DRGs ipsilateral to the side of tracer application in which some of FG-labeled neurons presented with CGRP-immunoreactive expression. With these approaches, we demonstrated the distributional characteristics of CGRP-immunoreactive nerve fibers around the blood vessels in the cranial dura mater, as well as the origin of these nerve fibers from TG and DRGs. From the perspective of methodology, it may provide a valuable reference for understanding the complicated neurovascular structure of the cranial dura mater under the physiological or pathological condition.

Here we present a protocol to visualize spatial correlation of calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive nerve fibers and blood vessels in the cranial dura mater using immunofluorescence and fluorescent histochemistry with CGRP and phalloidin, respectively. In addition, the origin of these nerve fibers was retrograde traced with a fluorescent neural tracer.

تصور الكالسيتونين الجينات ذات الصلة الببتيد المناعي الداخلي من الجرذ الجمجمة دورا ماتر مع Immunofluorescence والتتبع العصبي

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...