هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بدراسة تأثير الأنواع البكتيرية على الخلايا من الجهاز العصبي المعوي لأول مرة. نظرا لأنه لا يمكن الوصول إلى الجهاز العصبي المعوي بسهولة ، فإن هذا النموذج يسمح بدراسة تأثير ميكروبيوم الأمعاء على خلايا الجهاز العصبي المعوي. في المستقبل ، يمكن استخدام هذا النموذج لمعرفة كيف يؤثر ميكروبيوم الأمعاء للمرضى المرضى على خلايا الجهاز العصبي المعوي ، على سبيل المثال ، في مرض باركنسون.
سيكون الهدف المستقبلي المحتمل هو ربط هذا النموذج بنماذج الأعضاء الأخرى لبناء نموذج يمثل محور الأمعاء والدماغ. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرا بالغ الأهمية لأن البروتوكول يتضمن العديد من الخطوات وكل خطوة ضرورية لهذا التحقيق الناجح لهذا النموذج. ومن بين القائمين على هذا الإجراء كاثرين سيدراني، مرشحة الدكتوراه من مختبر بيئة النظام.
للبدء ، أحكم ربط البراغي ، وقم بتأمين الأجزاء العلوية والسفلية من المشبك ، وانقل غطاء البولي كربونات السفلي المطلي والمجفف من طبق بتري المربع إلى أعلى قاعدة المشبك عن طريق تثبيت البراغي الأربعة في زاوية الغطاء. استخدم ملاقط معقمة لوضع حشية الغرفة الظهارية بحيث يكون الغشاء متجها لأعلى على غطاء البولي كربونات. قم بمحاذاة الحشية والغطاء مع البراغي ، مما يضمن محاذاة منافذ مدخل ومخرج الزاوية مع فتحات الحشية.
ضع حشية الساندويتش أعلى حشية الكولاجين بحيث يكون الجانب العلوي متجها لأعلى. ثم ضع غطاء البولي كربونات العلوي أعلى حشية الساندويتش. تأكد من محاذاة الأشواك الموجودة على غطاء المشبك مع فتحة مدخل ومخرج تجميعات الغشاء ، وأن مسامير الغطاء السفلي تتناسب مع فتحة الغطاء العلوي.
لإغلاق الجهاز ، ضع غطاء المشبك أعلى غطاء البولي وأغلق المزالج. لتحضير خطوط الأنابيب ، أدخل إبر التهوية مع المرشحات في حاجز كل زجاجة تدفق وتدفق. باستخدام ملاقط معقمة نظيفة ، أدخل الإبر 120 ملم في زجاجات المصل 250 ملم والإبر 80 ملم في زجاجات المصل 15 ملم.
أدخل الإبر التي يبلغ قطرها 40 ملم في نهاية كل خط أنابيب في زجاجة مصل التدفق. يتم توصيل الإبر التي يبلغ قطرها 40 ملم لخطوط الأنابيب الظهارية والعصبية بنفس زجاجة التدفق الخارجي للتخلص المتوسط. يذهب خط الأنبوب البكتيري إلى زجاجة التدفق الثانية.
أدخل خطوط أنابيب المضخة في أشرطة المضخة. اضبط المضخة التمعجية لتوجيه الوسائط من التدفق إلى زجاجة التدفق الخارجي بسرعة خمس دورات في الدقيقة واضغط على زر البدء لبدء المضخة. تأكد من أن جميع المحابس ثلاثية الاتجاهات لخطوط الأنابيب مفتوحة.
بمجرد سقوط الوسائط في زجاجات التدفق ، تأكد من عدم وجود تسرب أو فقاعات هواء في خطوط الأنابيب ونقاط الاتصال. عندما تسقط جميع خطوط الأنبوب في زجاجات التدفق الخارجي ، اضبط معدل التدفق على عدد دورات في الدقيقة لتوصيل الجهاز الأولي. لتوصيل خط ، أغلق صمامات المحبس ثلاثية الاتجاهات ، بدءا من جانب التدفق الخارجي.
افصل الأنبوب القصير عن موصل الإغراء الأنثوي وقم بتوصيله بمنفذ مخرج الجهاز عن طريق دفع الأنبوب فوق الشوكة. للحصول على اتصال آمن خال من التسرب ، ادفع الأنبوب لأسفل فوق الموصل ، مع التأكد من ملامسته للغطاء. افتح المحبس بمجرد توصيل سطر واحد بالكامل بالجهاز.
اضبط معدل تدفق المضخة على دورتين في الدقيقة وقم بزيادة سرعة المضخة بحد أقصى 2.5 دورة في الدقيقة لتجنب التسرب بسبب تراكم الضغط. اسمح للمضخة بتجهيز الغرف. قلل سرعة المضخة إلى 0.5 دورة في الدقيقة بمجرد ملء جميع الغرف بوسط زراعة الخلايا وعدم بقاء فقاعات في الجهاز.
بالنسبة للخلايا الظهارية، افصل خلايا Caco-2 عن الدورق باستخدام التربسين EDTA. أعد تعليقها في RPMI 1640 بالإضافة إلى 10٪ FBS ، وقم بحسابها في عداد خلية Neubauer باستخدام مقايسة استبعاد التريبان الأزرق. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلايا Caco-2 لمدة ثلاث دقائق عند 300G وتجاهل المادة الطافية لإزالة الرحلات المتبقية في EDTA.
أعد تعليق خلايا Caco-2 في RPMI 1640 بالإضافة إلى 10٪ FBS للحصول على تعليق 0.35 مليون خلية لكل ملليلتر. انقل 1.5 ملليلتر من معلق خلية Caco-2 إلى حقنة معقمة سعة 2 ملليلتر ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء متبقية في المحقنة. أغلق صمامات المحبس ثلاثية الاتجاهات على أنبوب كل من الغرف البكتيرية والعصبية وافصل الأنبوب عن المضخة عن طريق إزالة الكاسيتات مع الأنبوب المعني من الدوار.
افتح غطاء صمام المحبس لأنبوب التدفق المؤدي إلى الغرفة الظهارية وقم بتدوير الصمام لإعادة توجيه التدفق المتوسط من الجهاز إلى الموصل المفتوح. اترك الوسط يتدفق حتى تظهر قطرة من الوسط في الطرف المفتوح للصمام الحابس. أدخل المحقنة ذات الخلايا الظهارية في الموصل المفتوح باستخدام طريقة توصيل الإسقاط والإفلات لمنع إدخال فقاعة الهواء أثناء الإدراج.
أدر صمام المحبس لإيقاف تدفق الوسط من زجاجة التدفق ، وللسماح بالتدفق من المحقنة المتصلة إلى الجهاز الأولي. افصل الغرفة الظهارية عن المضخة واضغط ببطء على المحقنة لتلقيح الغرفة الظهارية ب 1.5 ملليلتر من تعليق الخلية. أغلق صمام محبس التدفق الخارجي وافصل المحقنة.
أغلق الطرف المفتوح من المحبس مع الغطاء واحتفظ بالغرفة مغلقة لمدة ساعتين على الأقل. في غضون ذلك ، تلقيح الخلايا العصبية. بعد إزالة الجهاز من الحاضنة وإزالة خطوط الأنابيب ، افتح المشبك ببطء وأزل الغطاء.
قم بإزالة غطاء البولي كربونات العلوي بعناية. اجمع الوسط في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر وضعه على الجليد. قم بإزالة حشية الساندويتش برفق ، أثناء جمع الوسائط من الغرفة الظهارية دون لمس طبقة الخلية.
ضع حشية الساندويتش في طبق بتري مربع وأضف محلول كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪ ومحلول الماء إلى الغرفة البكتيرية حتى يتم تغطية الحجرة بالكامل. قم بإزالة حشية الكولاجين ببطء أثناء جمع الوسائط من الغرفة العصبية. بعد نقل الوسائط إلى أنبوب طرد مركزي صغير ، ضع الأنابيب على الجليد.
ضع حشية الكولاجين في طبق مربع وأضف برفق بضعة ملليلتر من PBS إلى طبقة Caco-2 حتى يتم تغطية طبقة الخلية بالكامل. ضع غطاء البولي كربونات السفلي في طبق بتري مربع وأضف برفق ما يقرب من ملليلتر من PBS فوق الخلايا العصبية حتى لا تجف أثناء عملية أخذ العينات. جهاز طرد مركزي أنبوب الوسائط لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد نقل المواد الطافية لكل أنبوب إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد ، ضعه على الثلج الجاف على الفور. تم تقييم عدد CFU لإعدادين أوليين مختلفين للجهاز. شارك L.reuteri مع Caco-2 و L.reuteri في جهاز الحديث المتبادل الميكروبي البشري.
في كلا الإعدادين ، كان عدد CFU مختلفا بشكل كبير عن لقاح HuMix والخلايا المحصودة التي تشير إلى نمو الخلايا البكتيرية داخل الجهاز الأولي. لتقييم ما إذا كان زرع الخلايا العصبية المعوية في الجهاز يغير النمط الظاهري للخلية ، لوحظ مورفولوجيتها الإجمالية باستخدام مجهر تباين الطور المقلوب. أشار إنشاء شبكة عصبية متقاربة إلى أن الخلايا قد ارتبطت جيدا بغطاء البولي كربونات المطلي.
كانت الحافة بين الشبكة العصبية المتقاربة واللولب المحدد للحشية واضحة بوضوح. تكمن إمكانات الدبال العصبي في الإجابة على الأسئلة التي كان من الصعب معالجتها في السابق ، فيما يتعلق بالتفاعلات بين ميكروبيوم الأمعاء البشرية والجهاز العصبي المعوي بسبب عدم وجود نموذج تمثيلي.
