Name: analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices
Uploaded: 2015-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

모든 마우스는 스위스의 동물 복지법에와 칸톤 수의학 사무실, 취리히의 규정에 따라 유지 관리 및 처리되었다. 해부 소재, 문화 미디어, 미세 유체 장치 1. 준비 <ol><li> 오토 클레이브 마이크로 해부 집게와 가위 (121 ° C, 살균 시간 : 20 분) 및 멸균 용기에 보관. </li><li> 37 ° C에서 진탕 기에서 24 시간 동안 1 M 염산으로 이들을 배양하여 커버 글라스 (24mm X 24mm)을 소독. 에탄올 99 %와 멸균 증류수로 2 O 3 배를 세 번 씻으십시오. 건조 후 37 ℃에서 또는 멸균 흐름 후드 된 커버. 마지막으로, 오토 클레이브 또는 살균을 완료하기 위해 자외선 (30 분)로 된 커버를 노출. 커버 슬립 후 70 % 에탄올에 저장 될 수있다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 패키지에서 축 축삭 격리 장치를 제거하고 멸균 페트리 접시에 배치합니다. </리&gt; <li> 멸균 생검 펀치 사용 (O : 1mm은) 문화 챔버의 대응 샘플 당 하나의 구멍을 배양 할 (그림 1)를 작성합니다. 참고 : 그들은 가해지는 압력에 의해 손상 될 수 있습니다로, 마이크로 그루브에 너무 가까이 펀치하지 마십시오. </li><li> 에탄올 70 %에이를 immerging에 의해 축 축삭 격리 장치를 소독. 완전히 멸균 흐름 후드 아래에 드라이 후 축 축삭 격리 장치 및 커버 슬립. 진행하기 전에 3 시간의 최소를 기다립니다. 참고 : 완전 건조는 미세 유체 장치의 결함 조립 발생합니다. </li><li> 6 웰 플레이트에서 35mm 페트리 접시로 또는 우물에 각 coverslip에 배치합니다. </li><li> 분리 장치와 유리 커버 슬립 사이의 완전한 접착력을 허용하기 위해 구부러진 끝 핀셋으로 조심스럽게 단단히 coverslip에 키를 누릅니다에 축 축삭 격리 장치를 놓습니다. </li><li> 각 배양 챔버 내에, 피펫 폴리 D 라이신 150 μL (멸균 된 0.1 ㎎ / ㎖는, H 2 증류수O). 배양 챔버로부터 모든 공기를 제거하기 위하여 5 분 동안 진공 하에서 미세 유동 장치를 놓는다. </li><li> 공기는 여전히 챔버 재 피펫 내의 챔버로 폴리 D 라이신 용액을 알 수있는 경우. </li><li> 37 ° C에서 폴리 D 리신 O / N을 갖는 장치를 부화. </li><li> 멸균 증류수 H 2 O와 챔버를 세 시간을 씻으십시오 </li><li> 150 (PBS에서 시그마 - 알드리치, 5 μg의 / ㎖, 또는 무 혈청 배지) μL 라미닌 작업 솔루션으로 챔버를 입력하고 37 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> 다음으로 이루어지는, 삼차 신경절 배양 37 배지 50 ㎖를 준비한다 : 48 ml의 배지로 Neurobasal 배지 1 mL의 B-27 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 5 NG / ㎖ 신경 성장 인자 (100) U (NGF) 0.25 오후 시토신 아라 비노 시드. </li><li> 40 ㎖의 DMEM-F12, 10 mL의 소 태아 혈청 (FBS, 최종 농도 : 20 %)은 다음과 같이 이루어지는 치아 세균 배양 37 배지 50 ㎖를 준비, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 150 μg의 / ㎖ 아스코르브 산. </li></ol> 2. 마우스 배아 생성 및 해부 <ol><li> (질 플러그 : 개발 0.5, E0.5의 배아 일) 질 플러그에 따라 배아 나이를 결정하고 형태 학적 기준을 통해 그것을 확인합니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 일반적으로 E14.5-E17.5 마우스 배아를 사용합니다. </li><li> 해부 영역과 에탄올 70 %와 입체경을 청소합니다. </li><li> 자궁 경부 전위를 통해 임신 어머니를 희생. 그리드에 제 1 및 제 2 손가락으로 마우스의 목을 차단하고, 결정 꼬리를 잡아 당깁니다. </li><li> 낮은 복부 주위 피부를 해부하고, 가위를 사용하여 복부를 엽니 다. 자궁을 찾습니다 임신의 늦은 단계에서, 자궁이 풍부 복강을 입력합니다. </li><li> 얼음에 PBS로 채워진 튜브에 자궁과 장소를 해부하다. 때 얼음에, 조직은 여러 시간 동안 남아있을 수 있습니다. 제도적 지침에 따라 어머니의 시체를 버리고 </li> &lt;리&gt; 자궁에서 배아를 해부하고 자신의 배외 (extraembryonic) 조직에서 그들을 무료로 제공됩니다. 얼음에 PBS에서 배아를 놓습니다. </li><li> 가위를 이용하여 배아 목을 벨, 마이크로 해부 가위 (도 2A)를 사용하여 헤드의 나머지 아래턱을 분리한다. 삼차 신경에 손상을주지 않고, 정확하게 아래턱을 제거; 후자는 아래턱에 근접 지역화 같이 그들의 사고 손상이 가능하다. 얼음에 아래턱과 차가운 PBS의 머리의 나머지 부분을 보존합니다. </li><li> TG를 해부하기 위해 머리를 가지고 이전에 차가운 PBS로 가득 해부 유리 페트리 접시, 위에 놓습니다. 집게를 사용하여 피부와 두개골을 제거합니다. 다음 telencephalon 및 telencephalon 및 리프트 아래 집게를 배치하여 소뇌를 제거; telencephalon 및 소뇌 노출 두개골의 바닥을두고 함께 플립 것이다. </li><li> (도 2b에 도시) 삼차 신경절 지역화. 집게를 사용하여삼차 신경에서 TG를 분리합니다. 칼으로 해부 바늘을 사용하여 삼차 돌기의 잔해를 제거합니다. 차가운 PBS로 가득 페트리 접시에 해부 TG를 놓고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 차가운 PBS로 가득 이전 해부 유리 페트리 접시에, 두개골에서 분리 아래턱을, 배치, 배아 치아를 해부합니다. 칼 같이 해부 바늘을 사용하여, 혀와 턱 주변의 피부를 제거한다. 턱의 중심선을 따라 절단하여 좌우 헤미 턱 별개. 도 1c에 도시 한 바와 같이 치아 세균은 쉽게 볼 수있다. 해부 바늘을 사용하여 치아의 세균을 분리하고 비 치아 조직의 초과를 제거합니다. 차가운 PBS로 가득 페트리 접시에 해부 치아 세균을 놓고 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 3. 미세 유체 공동 문화 <ol><li> 절개 후 미세 유체 장치에서 라미닌를 제거합니다. respecti 200 μL와 챔버를 채우미디어를했습니다. </li><li> 집게로 (그림 1D)를 펀칭에 의해 생성 된 구멍에 ​​조심스럽게 해부 TG 치아 세균을 전송합니다. 치아의 세균이 떠 있지 않은지 확인하고이 된 커버에 닿을 때까지 그들은 침몰있다. </li><li> 배양 37 ° C의 배양기에서 샘플, 5 % CO 2. </li><li> 문화 매체마다 48 시간을 변경합니다. 완전히 챔버를 버리지 말 것, 그리고 문화 실에 직접 피펫하지 않습니다. 챔버 내의 기포의 형성을 초래 챔버 전체 비우는; 챔버에 직접 피펫은 축삭 손상을 초래할 것입니다. 우물의 외부 쪽을 향해 피펫을 가리키는 매체를 제거, 이러한 문제를 방지하려면; 마찬가지로, 챔버에 대향 위치한 웰의 측면에 새로운 배지를 피펫. </li><li> 배양 기간 동안 공동 배양을 용이하게 시간 경과 현미경으로 묘화 될 수있다. 공동 배양은 10 일 이상 동안 유지 될 수있다. </li><li> 문화 perio 후D는 실 당 하나의 우물에 PBS 150 μl를 피펫 팅하고, PBS를 실을 통해 세 번 흐를 수 있도록함으로써 실을 씻는다. </li><li> PBS를 제거하고 챔버 당 하나의 잘 파라 포름 알데히드의 150 μL (PBS)에 4 %를 피펫 팅하여 샘플을 수정; 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 3.6에 기술 된 바와 같이 PBS로 두 번 챔버를 씻으십시오. </li><li> 추가 분석을 진행합니다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li><li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maxillary+factor,+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons.">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

치아의 신경 분포의 시험 관내 연구에서 이전은 삼차 신경절 및 치아 조직 또는 세포 26,28,29의 기존의 공동 문화를 기반으로했다. 이러한 연구는 주로 감각 축색 돌기 (38)에이 세포 또는 조직의 매력적인 효과를 조사하기 위해 실시 하였다. 분야에서 상당한 발전을 가져 있지만, 몇 가지 기술적 인 문제가 발생했다. 치아 세균은 문화 (37)의 몇 일 후에 퇴화하기 시작?...

신경 분포는 기관 및 조직의 1,2- 개발, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. 5 - 또한, 신경 분포는 줄기 세포의 증식, 분화 및 동원 (3)의 조절에 관여한다. 실제로, 구강 안면 복합체의 조직에서 실현하는 최근 연구는 부교감 신경이 타액의 발달 및 재생 -6,7- 땀샘 중에 상피 전구 세포의 기능을 위해 필요한 것으로 나타났다. 11 - 마찬가지로,이 신경 분포는 입맛 (8)의 개발 및 유지 보수에 대한 필요가 있다고 입증되었다. 따라서, 예컨대 이빨 다른 중요한 구강 안면 기관 및 조직의 신경 분포의 개발에 아직 무시 역할을 분석하는 것이 중요하다. 성인 치아 풍부한 신경 분포에도 불구하고, 반면에 본체 develo의 다른 모든 기관 및 조직에핑 치아는 생후 초기 단계에서 신경 지배되기 시작. 치아는 구강 외배엽과 두개골 신경 능선 유래 중간 엽 사이의 순차 및 상호 작용의 결과로 개발한다. 이러한 상호 작용은 상피 유래 ameloblasts 에나멜과 상아질, 각각 (12)의 형성에 대한 책임이 있습니다 중간 엽 유래 상아 아세포에 상승을 제공합니다. (15) - 우수한 경추 신경에서 삼차 신경과 교감 신경의 감각 신경은 성인 치아 (13)을 신경을 분포시키다. 배아 동안, 신경 섬유가 개발 치아 세균으로 삼차 신경절 프로젝트에서 나오는 점진적으로 그들을 둘러싸고 있지만 치과 유두 중간 엽 (13)에 침투하지 않습니다. 신경 섬유는 상아질 모세포의 분화와 상아질 매트릭스 증착 (16)와 상관 관계가 더 진보 된 발달 단계에있는 치과 펄프 중간 엽를 입력합니다. 치과 펄프 신경 분포는 COMPL입니다eted 곧 구강 (13) 치아 폭발 후. 19 - 다양한 semaphorins 및 뉴로이 odontogenesis 16시 신경 분포의 조절에 관여하는 것으로 이전의 연구 밝혀졌다. 이전 연구는 명확하게 신경 분포가 물고기 (20)의 치아 형성을위한 전제 조건임을 증명하고있다. 최근의 연구는 소닉 고슴도치 (쉬) (21)의 분비를 통해 감각 신경에 의해 조절된다 마우스 앞니 치과 간엽 줄기 세포의 항상성을 보여 주었다. 24 - 그럼에도 불구하고, 치아 개시, 개발 및 재생에 신경 분포의 역할은 여전히 포유 동물 (22) 매우 논쟁의 여지가있다. 생체 내 연구의 과다는 다양한 동물 모델 13,25,26의 개발 및 수리 과정에서 치아 조직의 신경 분포의 패턴에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다. 그러나, 이들의 대부분은 아프로통증은 신경 섬유 및 대상 기관과 조직 사이의 상호 작용의 분자 기초를 강조 최적 없습니다. 29 - 공동 문화 조사하고 제어 및 격리 된 환경 (26)에서 신경 섬유와 치아 사이의 상호 작용을 조작 할 수있는 가치있는 방법을 구성한다. 동시에, 공동 배양은 다양한 기술에 따라 조정된다. (32) - 예를 들어, 신경 및 특정 치아 조직 (예를 들면, 치과 펄프, 치과 대과, 치과 상피) 종종 30 시간의 긴 기간 동안 조직의 생존을 보장하기 위해 서로 다른 배지를 필요로한다. 29 - 지난 수십 년 동안, 동일한 배양 배지를 이용하여, 종래의 공 배양 감각 신경 섬유 (27)에 구강 및 치아 조직의 개발은 매력적인 또는 반발 효과를 조사하기 위해 매우 짧은 기간 (예 이틀)에 대해 수행되었다.그러나, 배양 기간의 연장은 치아 형태 형성과 신경 분포 cytodifferentiation에의 영향을 조사하고, 표적 기관 내의 분기 신경 섬유의 역학을 연구 할 필요가있다. 따라서, 비 연속 공동 문화는 신경 - 치아 조직의 상호 작용에 대한 연구를 수행하는 것이 더 적합 할 것입니다. 마이크로 유체 시스템은 적절한 배지에서 신경원과 다른 종류의 세포 공동 배양을 허용한다. 그들의 표적 조직 (33)을 포함 함을 향해 마이크로 채널을 통해 신경 세포체에서 축삭 성장을 허용하면서 이러한 장치에서, 치아 조직 및 신경 세포는 다른 구획으로 분리된다. 미세 유체 장치가 이미 암 및 혈관 신생 (35)에 세포 상호 작용에 뉴런과 마이크로 글 리아 (34, 35) 사이의 상호 작용뿐만 아니라 세포를 연구하기 위해 사용되었다. 더욱이, 이러한 시스템은 DORS 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다알 루트 신경과 조골 세포 (36). 우리는 최근 삼차 신경절 (TG)와 치아를 오랜 기간 동안 생존 할 수 있음을 입증 한 경우 공동 배양 한 미세 유체 장치 (37)에. 또한, 우리는 다른 발달 단계에서 이빨이 체외 조건들이 생체 (37)에 표시 삼차 신경 분포에 같은 반발 또는 매력적인 효과를 유지하고 있음을 증명하고있다. 이 프로토콜은 간단하고 강력하고 유연한 방식으로하는 공동 배양 신경 / 신경과 대상 조직 및 제어 및 격리 된 환경에서 이러한 상호 작용의 특정 분자의 역할을 연구에 대한 정보를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>AXIS Axon Isolation Devices</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>Microchannels of different lenght are available</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse beta-NGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>Human and Rat beta-NGF (R&amp;amp;D Systems) are equivalent</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices

신경 분포는 기관 및 조직의 발달, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. 그러나 이러한 현상의 기초가되는 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않는다. 특히, 치아 발달 및 재생의 신경 분포의 역할은 무시된다. 생체 내 연구의 여러 다양한 동물 모델의 개발 및 수리 과정에서 치아 조직의 신경 분포의 패턴에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다. 그러나 이러한 접근 방법의 대부분은 신경 섬유 및 대상 기관과 조직 사이의 상호 작용의 분자 기초를 강조 최적 없습니다. 공동 문화 조사하고 제어 및 격리 된 환경에서 신경 섬유와 치아 사이의 상호 작용을 조작 할 수있는 유용한 방법을 구성한다. 지난 수십 년 동안, 동일한 배양 배지를 이용하여 종래의 공동 배양이 매우 짧은 기간 동안 수행되었다 (예 이틀)감각 신경 섬유에 구강 및 치아 조직을 개발하는 매력 또는 반발 효과를 알아보고자 하였다. 그러나, 배양 기간의 연장은 치아 형태 형성과 신경 분포 cytodifferentiation에의 영향을 조사 할 필요가있다. 마이크로 유체 시스템은 적절한 배지에서 신경원과 다른 종류의 세포 공동 배양을 허용한다. 우리는 최근 삼차 신경절 (TG) 및 치아 장기간 생존 할 수 있음을 증명하고있다 때 공 배양 미세 유동 장치에있어서, 그들이 이러한 조건들은 생체 내에서 보여 같은 신경 분포 패턴을 유지하는 것이다. 이를 바탕으로, 우리는 분리하고 미세 공 배양하면 시스템의 프로토콜에서 삼차 신경과 치아 세균을 개발하고 공동 문화가 간단하고 유연한 방법에 공동 배양 신경 / 신경과 표적 조직 등을 설명하는 방법을 설명하는 역할을 연구하기 제어 방식에서 이러한 상호 작용에 대한 특정 분자olled과 격리 된 환경을 제공합니다.

이러한 결과는 절연 삼차 신경절은 절연 치아 세균의 개발은 미세 유체 소자의 다른 구획에서 장기간 지속되어, 추가로, 미세 유체 소자의 한 구획에서 성장할 수 있음을 나타낸다. 다른 문화 매체는 두 구획에 사용되는, 두 구획 사이의 마이크로 그루브가 개발 치아 세균으로 삼차 신경절에서 축삭의 확장을 할 수 있습니다. 그림 3 마우스의 공동 문화, 면역 형광 (37)를 통해 ?...

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Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K 조회수.  University of Zurich. Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

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Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

연구

신경과학

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to overcome the resistance to current treatments and find a new way of cure, modeling the disease as close as possible in an in vitro setting to test new drugs and therapeutic procedures is highly demanding. Studying their fundamental pathobiological processes, including glutamatergic neuron hyperexcitability, will be a real advance in understanding interactions between the environmental brain and pHGG cells. Therefore, to recreate neurons/pHGG cell interactions, this work shows the development of a functional in vitro model co-culturing human-induced Pluripotent Stem (hiPS)-derived cortical glutamatergic neurons pHGG cells into compartmentalized microfluidic devices and a process to record their electrophysiological modifications. The first step was to differentiate and characterize human glutamatergic neurons. Secondly, the cells were cultured in microfluidic devices with pHGG derived cell lines. Brain microenvironment and neuronal activity were then included in this model to analyze the electrical impact of pHGG cells on these micro-environmental neurons. Electrophysiological recordings are coupled using multielectrode arrays (MEA) to these microfluidic devices to mimic physiological conditions and to record the electrical activity of the entire neural network. A significant increase in neuron excitability was underlined in the presence of tumor cells.

Recent works uncover the neuronal impact on high-grade pediatric glioma (pHGG) cells and their reciprocal interactions. The present work shows the development of an in vitro model co-culturing pHGG cells and glutamatergic neurons and recorded their electrophysiological interactions to mimic those interactivities.

글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

암 연구학

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

발생학

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

생물학

A Gut-on-a-Chip Model to Study the Gut Microbiome-Nervous System Axis

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located in the gut. Though the interplay between the gut microbiome and the host has been extensively studied, how the gut microbiome interacts with the enteric nervous system remains largely unknown. To date, a physiologically representative in vitro model to study gut microbiome-nervous system interactions does not exist. 
To fill this gap, we further developed the human-microbial crosstalk (HuMiX) gut-on-chip model by introducing induced pluripotent stem cell-derived enteric neurons into the device. The resulting model, 'neuroHuMiX', allows for the co-culture of bacterial, epithelial, and neuronal cells across microfluidic channels, separated by semi-permeable membranes. Despite separation of the different cell types, the cells can communicate with each other through soluble factors, simultaneously providing an opportunity to study each cell type separately. This setup allows for first insights into how the gut microbiome affects the enteric neuronal cells. This is a critical first step in studying and understanding the human gut microbiome-nervous system axis.

neuroHuMiX is an advanced gut-on-a-chip model to study the interactions of bacterial, epithelial, and neuronal cells under proximal and representative co-culture conditions. This model allows unravelling of the molecular mechanisms underlying the communication between the gut microbiome and the nervous system.

장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하기 위한 gut-on-a-chip 모델

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located ...

Establishing a Co-Culture of Dental Pulp Cells and Trigeminal Neurons for Cross-Communication

Source: Barkley, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60809">A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020).
This video showcases a technique for establishing a co-culture of trigeminal neurons and primary dental pulp cells using a transwell filter. In this physically separated condition, mesenchymal cells obtained from dental pulp tissue secrete paracrine signaling molecules that traverse through the pores, promoting the differentiation and migration of neurons towards the mesenchymal cells establishing a co-culture system.

교차 의사소통을 위한 치아 치수 세포와 삼차 신경 세포의 공동 배양 확립

1. Plate Preparation
NOTE: Be sure the plate lid is on during all incubation and rinsing steps outside of the sterile tissue culture hood to prevent ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Generating Neuromuscular Junctions Using a Microfluidic Device

Source: Stoklund Dittlau, K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62959">Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates the formation of neuromuscular junctions using a microfluidic device. Neural precursor cells and muscle progenitor cells are seeded into different wells within the device and left to mature into motor neurons and myotubes, respectively. The creation of a volume and chemical gradient leads to the development of active neuromuscular junctions.

미세유체 소자(microfluidic device)를 이용한 신경근접합부 생성

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
All reagents and equipment used in ...

Advanced Neuronal Models

Analyzing Tooth Germ and Trigeminal Ganglia Interactions Using a Microfluidic Co-culture System

Source: Pagella, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53114">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the utilization of a microfluidic device to study the interactions between tooth germ pulp and trigeminal ganglia. It showcases the placement of tissues inside the microfluidic device and provides a detailed visualization of trigeminal neurite growth toward the tooth germ through the device&#39;s microgrooves. Additionally, it highlights the role of tooth-derived molecular factors in promoting or inhibiting neurite extension into the tooth germ pulp, which is crucial for ensuring efficient postnatal tooth innervation.