The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

Alle Mäuse wurden nach Schweizer Tierschutzgesetz und in Übereinstimmung mit den Vorschriften des kantonalen Veterinäramt, Zürich gepflegt und behandelt werden. 1. Herstellung von Dissection Material, Kultur, Medien, Mikrofluidiksysteme <ol><li> Autoklaven Mikrodissektion Pinzette und Schere (121 ° C, Sterilisationszeit: 20 min) und speichert sie in einem sterilen Behälter. </li><li> Sterilisieren Deckgläser (24 mm x 24 mm) durch Inkubation in 1 M HCl 24 h lang auf einem Rundschüttler bei 37 ° C. Dreimal mit 99% Ethanol waschen sie mit sterilem, destilliertem H 2 O und dreimal. Dry dann die Deckgläser auf 37 ° C oder unter sterilen Flow-Haube. Schließlich Autoklaven oder setzen Sie die Deckgläser mit UV-Licht (30 min), um die Sterilisation zu vervollständigen. Deckgläser kann dann in Ethanol 70% gelagert werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die AXIS Axon Isolation Geräte aus der Verpackung mit Hilfe einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. </li&gt; <li> Mit einem sterilen Biopsie Stempel (ø: 1 mm) schaffen ein Loch pro Probe kultiviert werden (Abbildung 1) in Übereinstimmung mit den Kulturkammern. HINWEIS: stanzen nicht zu nahe an den Mikrorillen, da sie möglicherweise durch den Druck aufgebracht beschädigt werden. </li><li> Sterilisieren Sie die AXIS Axon Isolation Devices durch immerging sie in Ethanol 70%. Dry dann AXIS Axon Isolation Geräte und Deckgläser vollständig unter einer sterilen Flow-Haube. Warten Sie mindestens 3 Stunden, bevor Sie fortfahren. HINWEIS: unvollständige Trocknung wird in fehlerhaften Montage der mikrofluidischen Bauteilen führen. </li><li> Legen Sie jedes Deckglas in eine 35 mm Petrischale oder in einen Brunnen in einem 6-wells Platte. </li><li> Setzen Sie den AXIS Axon Isolation Gerät auf dem Deckglas und drücken Sie vorsichtig, aber fest mit einer Zange mit gebogenen Enden, um die volle Haftung zwischen der Trennvorrichtung und dem Deckglas zu ermöglichen. </li><li> In jeder Kulturkammer, einer Pipette 150 ul Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml in sterilem destilliertem H 2O). Legen Sie die mikrofluidischen Vorrichtungen unter Vakuum für 5 Minuten, um die gesamte Luft aus den Kulturkammern zu entfernen. </li><li> Wenn Luft kann noch innerhalb der Kammern, re-Pipette die Poly-D-Lysin-Lösung in die Kammern zu sehen. </li><li> Die Vorrichtungen mit Poly-D-Lysin O / N bei 37 ° C. </li><li> Waschkammern dreimal mit sterilem destilliertem H 2 O. </li><li> Füllen Kammern mit 150 ul Laminin-Arbeitslösung (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml in PBS oder Serum-freiem Medium), und Inkubation O / N bei 37 ° C. </li><li> Vorbereitung 50 ml Medium für Trigeminalganglien Kulturen 37, wie folgt zusammen: 48 ml Neurobasalmedium, 1 ml B-27, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 5 ng / ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) , 12.25 Cytosinarabinosid. </li><li> Bereiten Sie 50 ml Medium für Zahnkeim Kulturen 37, wie folgt zusammen: 40 ml DMEM-F12, 10 ml fötalem Rinderserum (FBS, Endkonzentration: 20%), 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 150 &amp; mgr; g / ml Ascorbinsäure. </li></ol> 2. Mouse Embryo Erzeugung und Dissection <ol><li> Bestimmen Sie embryonalen Alter nach Vaginalpfropf (Vaginalpfropf: embryonalen Tag der Entwicklung 0,5, E0.5) und bestätigen Sie es via morphologischen Kriterien. Für dieses Protokoll verwenden wir in der Regel E14.5-E17.5 Mäuseembryonen. </li><li> Reinigen Sie das Sezierung Bereich und die Stereoskop mit Ethanol 70%. </li><li> Opfer der schwangeren Mutter über Genickbruch. Blockieren Sie den Hals der Maus mit dem ersten und zweiten Finger auf ein Gitter, und ziehen Sie mit der Entscheidung der Schwanz. </li><li> Präparieren Sie die Haut um die Unterbauch, und öffnen Sie den Unterleib mit einer Schere. Suchen Sie die Gebärmutter: während dieser späten Stadien der Schwangerschaft, der Uterus reichlich die Bauchhöhle zu füllen. </li><li> Sezieren die Gebärmutter und in eine Röhre mit PBS auf Eis gefüllt. Wenn auf Eis kann das Gewebe für mehrere Stunden verlassen werden. Entsorgen Sie die Leiche der Mutter gemäß gültiger Richtlinien </li> &lt;li&gt; sezieren die Embryonen aus der Gebärmutter und sie von ihrer extra Gewebe. Legen Sie die Embryonen in PBS auf Eis. </li><li> Enthaupten die Embryonen mit einer Schere, und trennen Sie den Unterkiefer aus dem Rest des Kopfes mit Mikrodissektion Schere (2A). Genau Entfernen Sie die Unterkiefer, ohne Beschädigung der Trigeminalganglien; dieser letzteren in der Nähe des Unterkiefers lokalisiert ist ihre versehentliche Beschädigung möglich. Erhalten Sie den Unterkiefer und den Rest des Kopfes in kaltem PBS, auf Eis. </li><li> Um TG sezieren, nehmen Sie den Kopf und legen Sie sie auf eine Dissektion Glaspetrischale, die zuvor mit kaltem PBS gefüllt. Unter Verwendung der Zange, entfernen Sie die Haut und den Schädel. Entfernen Sie dann das Telencephalon und das Kleinhirn, indem Zange unterhalb des Telencephalon und Aufzug; das Telencephalon und das Kleinhirn zusammen drehen, so dass die Unterseite des Schädels freigelegt. </li><li> Lokalisierung der trigeminalen Ganglien (in 2B gezeigt). Verwenden Sie die Pinzetteum die TG von den Trigeminus trennen. Beseitigen Sie die Reste der Trigeminus-Projektionen mit Hilfe der Dissektion Nadeln wie Messer. Legen Sie die seziert TG in einer Petrischale mit kaltem PBS gefüllt und halten sie auf Eis. </li><li> Embryonale Zähne sezieren, legen Sie den Unterkiefer, die zuvor aus dem Schädel getrennt auf die Dissektion Glaspetrischale mit kaltem PBS gefüllt. Verwendung Dissektion Nadeln wie Messer, entfernen Sie die Zunge und die Haut rund um den Kiefer. Trennen Sie den linken und den rechten Hemi-Backen durch Schneiden entlang der Mittellinie des Kiefers. Die Zahnanlagen sind gut sichtbar, wie in 1C gezeigt. Isolieren Sie die Zahnkeime mit Dissektion Nadeln und entfernen Sie den Überschuss an nicht-Zahngewebe. Legen Sie die seziert Zahnkeime in einer Petrischale mit kaltem PBS gefüllt und halten sie auf Eis. </li></ol> 3. Mikrofluidik-Co-Kulturen <ol><li> Nach der Sektion, entfernen Laminin aus den mikrofluidischen Systemen. Füllen der Kammern mit 200 ul der respective Medien. </li><li> Mit einer Pinzette, übertragen vorsichtig seziert die TG und Zahnkeime in die Löcher erzeugt durch Stanzen (1D). Stellen Sie sicher, dass die Zahnkeime nicht schwimmen, und dass sie sinken, bis sie die Deckgläser. </li><li> Kultur die Proben in Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 Stunden. Die Kammern leeren nicht vollständig, und nicht direkt Pipette nicht in die Kulturkammern. Vollständige Entleerung der Kammern würde zur Bildung von Luftblasen in den Kammern führen; direkte Pipettieren in die Kammer würde in axonalen Schäden führen. Um diese Probleme zu vermeiden, entfernen Sie das Medium zeigt die Pipette in Richtung der Außenseite der Vertiefungen; Ähnlich pipettieren frischem Medium auf der Seite der Vertiefungen angeordnet gegenüber den Kammern. </li><li> Während der Kulturzeit kann Co-Kulturen leicht durch Zeitraffer-Mikroskopie abgebildet werden. Co-Kulturen für 10 Tage lang aufrechterhalten werden. </li><li> Nach der Kultur period, waschen Sie die Kammern durch Pipettieren von 150 ul PBS in einem gut pro Kammer und ließ PBS durch die Kammern fließen dreimal. </li><li> Entfernen Sie die PBS und fixieren Sie die Proben durch Pipettieren von 150 ul Para 4% (in PBS) in einer gut per Kammer; Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Zweimaliges Waschen der Kammern mit PBS, wie in 3.6 beschrieben. </li><li> Fahren Sie mit der weiteren Analyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells.">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).</li><li>Katayama, Y., Battista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+sympathetic+nervous+system+regulate+hematopoietic+stem+cell+egress+from+bone+marrow.">Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow.</a> Cell. 124 (2), 407-421 (2006).</li><li>Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis.">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li><li>Oakley, B., Witt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+sensory+receptors+on+the+tongue.">Building sensory receptors on the tongue.</a> Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).</li><li>Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+mouse+vallate+gustatory+epithelium+and+taste+buds+requires+BDNF-dependent+taste+neurons.+Brain+research.">The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research.</a> Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).</li><li>Sun, H., Oakley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anterior+gustatory+epithelia+in+the+palate+and+tongue+requires+epidermal+growth+factor+receptor.">Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor.</a> Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).</li><li>Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+size,+number,+and+morphology+of+gustatory+papillae+and+taste+buds+in+BDNF+null+mutant+mice+demonstrate+neural+dependence+of+developing+taste+organs.">Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs.</a> The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).</li><li>Mitsiadis, T. a., Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+during+tooth+development+and+regeneration.">Cell fate determination during tooth development and regeneration.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).</li><li>Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histological+study+of+the+innervation+of+developing+mouse+teeth.">A histological study of the innervation of developing mouse teeth.</a> Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).</li><li>Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+fibres+during+development+of+embryonic+rat+molar+using+peripherin+and+protein+gene+product+9.5+antibodies.">Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies.</a> Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).</li><li>Johnsen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+teeth:+qualitative,+quantitative,+and+developmental+assessment.">Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment.</a> Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).</li><li>Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+growth+factor+(NGF)+and+NGF+receptor+(NGF-R)+in+the+developing+first+molar+tooth+of+the+rat.">Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat.</a> Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).</li><li>Mitsiadis, T. a., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+in+odontogenesis.">Neurotrophins in odontogenesis.</a> The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).</li><li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kettunen, P., L&#248;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+trigeminal+axon+navigation+and+patterning+with+tooth+organ+formation:+epithelial-mesenchymal+interactions+and+epithelial+Wnt4+and+Tgfbeta1+regulate+semaphorin+3a+expression+in+the+dental+mesenchyme.">Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme.</a> Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).</li><li>Tuisku, F., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+neural+influence+on+tooth+germ+generation+in+a+polyphyodont+species.">Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species.</a> Developmental biology. 165, 1-9 (1994).</li><li>Zhao, H., Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+rudimentary+diastema+tooth+primordia+are+devoid+of+peripheral+nerve+fibers.">Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers.</a> Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).</li><li>Lumsend, A., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+timing+and+topography+of+early+tooth+development+in+the+mouse+embryo.">An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo.</a> Archives of oral biology. , 301-311 (1986).</li><li>Kollar, E., Lumsend, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+tooth+morphogenesis+and+neuronal+development+through+tissue+interactions:+lessons+from+mouse+models.">Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models.</a> Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Lumsend, A., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323 (9), 538-539 (1986).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).</li><li>Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Nogo-A+regulates+neurite+fasciculation,+branching+and+extension+in+the+developing+nervous+system.">Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system.</a> Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).</li><li>Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odontogenesis.">Odontogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 887, (2012).</li><li>Mitsiadis, T. a., Drouin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Pitx1+genomic+locus+affects+mandibular+tooth+morphogenesis+and+expression+of+the+Barx1+and+Tbx1+genes.">Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes.</a> Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll/interleukin-1+receptor+domain-containing+adapter+inducing+interferon-&#946;+mediates+microglial+phagocytosis+of+degenerating+axons.">Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-&#946; mediates microglial phagocytosis of degenerating axons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).</li><li>Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+on+microfluidics:+multimodal+analysis+for+studying+celll-cell+interaction.">Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction.</a> Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).</li><li>Neto, E., Alves, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+neurons+and+osteoblasts:+close+partners+in+a+microfluidic+environment.">Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment.</a> Integrative Biology. , (2014).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#233;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li><li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maxillary+factor,+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons.">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Vorherige in vitro-Studien der Zahn Innervation wurden auf herkömmliche Kokulturen Trigeminalganglien und Zahngewebe oder Zellen 26,28,29 basiert. Diese Studien wurden durchgeführt, um in erster Linie untersuchen die attraktive Wirkung dieser Zellen oder Gewebe auf sensorische Axone 38. Zwar bringen bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet wurden mehrere technische Fragen aufgeworfen. Zahnkeime beginnen, nach ein paar Tagen der Kultur 37 degenerieren. Basierend auf diesen Beobac...

Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben, 1,2. 5 - Weiterhin ist Innervation bei der Regulation der Stammzellproliferation, Mobilisierung und Differenzierung 3 beteiligt. In der Tat, die jüngsten Studien in Geweben des orofazialen Komplexes realisiert haben gezeigt, dass parasympathischen Nerven sind für epithelialen Vorläuferzellen Funktion notwendig bei der Entwicklung und Regeneration der Speicheldrüsen 6,7. Ebenso hat sich gezeigt, dass Innervation für die Entwicklung und Wartung von Gaumen 8 notwendig - 11. Somit ist es wichtig, die noch vernachlässigt Rollen Innervation bei der Entwicklung anderer wichtiger orofacial Organen und Geweben wie Zähne analysieren. Trotz der Innervation reichen zweiten Zähne und im Gegensatz zu allen anderen Organen und Geweben des Körpers, developing Zähne beginnen, in den frühesten Stadien der postnatalen innerviert werden. Zähne entwickeln als Folge der sequentiellen und gegenseitige Wechselwirkungen zwischen oralen Ektoderm und Schädel Neuralleiste stammenden Mesenchym. Diese Wechselwirkungen führen zu Epithelzellen abgeleitete Adamantoblasten und Mesenchym abgeleitete Odontoblasten, die für die Bildung von Zahnschmelz und Dentin, die jeweils 12 verantwortlich sind. Sensorischen Nerven vom Trigeminalganglien und sympathischen Nerven aus der oberen Halsganglien innervieren die Erwachsenen die Zähne 13-15. Während der Embryogenese, Nervenfasern aus dem Trigeminalganglien Projekt gegenüber den Entwicklungszahnkeime ausgeht und progressiv umgeben sie aber nicht in die Papille Mesenchym 13 eindringen. Nervenfasern in das Zahnmark Mesenchym in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien, die mit odontoblast Differenzierung und Dentin Matrixablagerung 16 zu korrelieren. Pulpa Innervation ist komplETED bald nach dem Zahndurchbruch in der Mundhöhle 13. Frühere Studien haben gezeigt, dass verschiedene Semaphorine und Neurotrophine sind an der Regulation der Innervation bei Odontogenese 16 beteiligt - 19. Frühere Studien haben klar gezeigt, dass Innervation ist eine Voraussetzung für die Zahnbildung bei Fischen 20. Neuere Studien haben gezeigt, daß die Homöostase der Zahn Mesenchym-Stammzellen in Maus-Schneidezähne wird durch sensorische Nerven über Sekretion von Sonic Hedgehog (Shh) 21 reguliert wird. Dennoch ist die Rolle der Innervation in Zahn Initiierung, Entwicklung und Regeneration immer noch sehr umstritten in Säugetieren 22-24. Eine Vielzahl von in-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen 13,25,26 vorgesehen. Jedoch sind die meisten von diesen auf angemesseneSchmerzen nicht optimal sind, um die molekularen Grundlagen der Wechselwirkungen zwischen Nervenfasern und Ziel Organe und Gewebe zu markieren. Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in eine kontrollierte und isolierte Umgebung 26-29. Zugleich ist Kokultivierung unterliegen verschiedenen technischen Anpassungen. Zum Beispiel, Nerven und spezifische Zahngewebe (zB Pulpa, Zahnsäckchen, Zahn Epithel) erfordern oft unterschiedliche Kulturmedien, um Gewebeüberlebenszeit für längere Zeit garantieren 30 - 32. In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen mit dem gleichen Kulturmedium für sehr kurze Zeiträume (zB zwei Tage) durchgeführt wurde, um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern 27 zu untersuchen - 29.Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen und die Dynamik von Nervenfasern innerhalb Verzweigungszielorgane zu untersuchen. Deshalb würde nicht zusammenhängende Co-Kulturen besser geeignet, um Studien über neuronale-Zahngewebe Interaktionen durchzuführen. Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. In diesen Vorrichtungen werden Zahngeweben und Neuronen in verschiedenen Kammern getrennt, während gleichzeitig das Wachstum der Axone der neuronalen Zellkörper durch Mikrokanäle in Richtung der Kammer ihre Zielgewebe 33 enthält. Mikrofluidik-Vorrichtungen wurden bereits verwendet, um die Interaktionen zwischen Neuronen und Mikroglia 34,35 sowie von Zelle zu Zelle-Wechselwirkungen bei Krebs und Neovaskularisation 35 zu studieren. Darüber hinaus sind diese Systeme sind verwendet worden, um die Wechselwirkungen zwischen dors studierenal Wurzelganglien und Osteoblasten 36. Wir haben kürzlich gezeigt, dass trigeminalen Ganglien (TG) und der Zähne in der Lage sind, für längere Zeiträume zu überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidik-Vorrichtungen 37. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Zähne von verschiedenen Entwicklungsstadien zu erhalten in diesen in vitro Bedingungen die gleichen abstoßend oder anziehend Auswirkungen auf Trigeminus innerviert, dass sie in vivo 37 zeigen. Dieses Protokoll enthält Informationen über eine einfache, leistungsfähige und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen von spezifischen Molekülen auf solche Wechselwirkungen in einer kontrollierten und isolierten Umgebung zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AXIS Axon Isolation Devices</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX15010-TC</td>
			<td>Microchannels of different lenght are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse beta-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1156-NG-100</td>
			<td>Human and Rat beta-NGF (R&#38;D Systems) are equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices

Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Phänomene sind nicht gut noch verstanden. Insbesondere wird die Rolle der Innervation in der Zahnentwicklung und Regeneration vernachlässigt. Mehrere In-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die meisten dieser Ansätze nicht optimal, um die molekulare Grundlage der Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zielorgane und Gewebe zu markieren. Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in einer kontrollierten und isolierten Umgebung. In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen unter Verwendung des gleichen Kulturmediums für sehr kurze Zeiträume durchgeführt wurden (beispielsweise zwei Tage)um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern zu untersuchen. Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen. Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Trigeminalganglien (TG) und die Zähne sind in der Lage, für eine lange Zeit überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidvorrichtungen, und dass sie zu erhalten in diesen Bedingungen die gleiche Innervationsmuster, dass sie in vivo zeigen. Auf dieser Basis beschreiben wir, wie zu isolieren und Co-Kultur entwickeln Trigeminalganglien und Zahnkeime in einem mikrofluidischen Co-Kultur system.This Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen zu studieren spezifischer Moleküle auf solchen Wechselwirkungen in einem controlled und isolierten Umgebung.

Diese Ergebnisse zeigen, dass isolierte Trigeminalganglien kann in einem Abteil der mikrofluidischen Vorrichtung zu wachsen, und zusätzlich, dass die Entwicklung von den isolierten Zahnanlagen ist für einen langen Zeitraum in der anderen Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung aufrechterhalten. Verschiedenen Kulturmedien sind in den zwei Kammern verwendet, und die Mikrorillen zwischen den beiden Kammern zu ermöglichen Verlängerung der Axone vom Ganglion trigeminale gegenüber den Entwicklungszahnanlagen dar....

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices at JoVE.com

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Aufrufe.  University of Zurich. Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.