We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. المواد النباتية شروط النمو، والخضري الاستنساخ ملاحظة: تم التحقيق ثلاثة السكان waterhemp في هذا البحث: MCR (من مقاطعة ماكلين، IL)، ACR (من مقاطعة آدمز، IL)، وجمعية حماية الحياة البرية (من مقاطعة وين، IL) (الجدول 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وتعليق بذور waterhemp في 0.1 ز L -1 أجار: المحلول المائي في 4 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل لتعزيز الإنبات. ملاحظة: بعض السكان waterhemp هي نائمة، ولكن هذه الخطوة تساعد على التغلب على السكون وجعل البذور تنبت بشكل موحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبت بذور كل السكان waterhemp (كما في الجدول رقم 1) في 12 × 12 سم الصواني التي تحتوي على وسيلة بوتينغ في الاحتباس الحراري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الظروف المسببة للاحتباس الحراري في 28/22 ° C درجات الحرارة اليوم / ليلة خلال الفترة الضوئية 16/8 الساعة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة الضوء الطبيعي في الاحتباس الحراري مع الضوء من مصابيح هالوجين الزئبق لتوفير الحد الأدنى من 500 ميكرومول م -2 </سوب&gt; تدفق ثانية -1 الفوتون على مستوى مظلة النبات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ظهرت زرع الشتلات عندما تكون 2 سم إلى 80 سم 3 الأواني في الاحتباس الحراري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شتلات الزرع إلى 950 سم 3 الأواني التي تحتوي على 3: خليط 1 من مزيج بوتينغ: 1: 1 التربة: الخث: الرمال عندما الشتلات هي 4 سم. إضافة 5 غرام من حبيبات الأسمدة بطيئة الافراج على كل وعاء وتخلط مع هذا الخليط التربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وإزالة تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي الذي يحتوي على أصغر الأوراق ثلاثة من 7 سم النباتات طويل القامة للقضاء على هيمنة قمي. ملاحظة: هذه الخطوة يضمن أن كل محطة سوف تنمو ما يكفي من يطلق النار على 3 سم إبطي لاستنساخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكوس خمسة براعم الإبطية (3 سم في الطول) عندما الشتلات هي حوالي 14 سم من كل السكان waterhemp (كما في الجدول رقم 1). إزالة غالبية الأوراق على هذه البراعم الإبطية لتقليل فقدان الماء على مزيد من التعامل معها، ولكن الإبقاء على أصغر اثنين من يترك للسماح للمزيد من النمو على زرع. <br/&gt; ملاحظة: التعامل مع بعناية ومحاولة عدم الاضرار يطلق النار عند إزالة الأوراق. تسمية كل محطة مع حصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع إبطي يطلق النار في 80 سم 3 قدور (الشتلات واحدة في وعاء) في بوتينغ المتوسطة، وهو نفس الوسيلة المستخدمة للإنبات. يجب أن تكون مشبعة بوتينغ المتوسطة في البداية حتى شكل جذور في غرفة النمو، ثم الحفاظ على رطوبة ثابتة ومكان الأواني في غرفة النمو لمدة 7 أيام لإقامة الجذور. ملاحظة: النباتات هي حساسة جدا في هذه المرحلة، وينبغي ألا أكدت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على ظروف غرفة نمو في 28/22 ° C درجات الحرارة اليوم / ليلة خلال الفترة الضوئية 16/8 الساعة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من هاج والفلورية المصابيح يمكن استخدامها لتوفير الضوء في غرفة النمو وأن يحقق ما لا يقل عن 550 ميكرومول م -2 ثانية -1 تدفق الفوتون في مصنع مستوى المظلة 12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة مرة أخرى إلى 950 سم 3 قدور (الشتلات واحدة في وعاء) جontaining 3: خليط 1 من مزيج بوتينغ: 1: 1 التربة: الخث: الرمال (تشمل أيضا 5 ز بطيئة الافراج عن حبيبات الأسمدة) عند محطات المستنسخة هي 4 سم، ثم نقل مرة أخرى إلى المسببة للاحتباس الحراري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ النباتات مرة ثانية باستخدام نفس الأسلوب هو موضح أعلاه (أي، كرر الخطوات 1،5-1،8، ومن ثم الانتقال إلى الخطوة 2.1). لدراسة وقتا بالطبع النموذجية، وتوليد الحيوانات المستنسخة من لا يقل عن ستة محطات مستقلة عن بعضها السكان waterhemp وتسجيلها على شكل خطوط MCR 1-6 و1-6 وACR WCS 1-6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء ستة على الأقل &quot;الأم&quot; خطوط نسيلي متميزة من أجل تكرار التجربة وكاف تمثل التنوع الوراثي داخل كل السكان waterhemp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على عدد النقاط الزمنية سيتم تحليلها، وتوليد ما يكفي من الحيوانات المستنسخة فرعية من كل &quot;الأم&quot; خط نسيلي لإجراء دراسة وقتا بالطبع. </li></ol></li></ol> 2. إجراء دراسة الأيض مع رفعه Waterhemأوراق ص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال الثالثة وأصغر الأوراق (2-3 سم في الطول، وتشمل 0.5 سم من سويقات المرفقة) عندما النباتات waterhemp المستنسخة هي 10-12 سم لعملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب وDT 50 تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعناق قطع ورقة من كل مصنع waterhemp مرة ثانية (ضمان 0،3 سم من سويقات تبقى) تحت سطح الماء، ووضع هذه القطع ينتهي إلى 1.5 مل قارورة بلاستيكية (ورقة واحدة في قارورة) 15. ملاحظة: القطع مرة ثانية تحت الماء يمنع فقاعات الهواء من تشكيل ويسد الأوعية الخشب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، تزج جزئيا أوراق رفعه مع قطع سويقات العازلة في مرحلة ما قبل الحضانة (200 ميكرولتر) من 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6) لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثانيا، نقل كل ورقة إلى 1.5 جديد مل قارورة تحتوي على وجود مخزن مؤقت الحضانة (200 ميكرولتر) من 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6)، بالإضافة إلى 150 ميكرومتر [URL- 14 C] مبيدات الأعشاب، واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ل السماح لامتصاص مبيدات الأعشاب إلى الأوراق. ملاحظة: كل 14 C-mesotrione و <sواستخدمت تصل&gt; 14 C-primisulfuron-الميثيل في دراساتنا في أنشطة محددة من حوالي 20 ميلي كوري ملمول -1. كل من نشر وامتصاص من خلال مجرى الخشب النتح تساهم في كمية المبيدات تناولها لكل ورقة. ملاحظة: تأثير مثبطات الأيض على عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب يمكن تحديدها عن طريق تعديل الخطوات 2.2.1 و2.2.2 أعلاه. إضافة 100 ميكرومتر المانع إلى المخزن المؤقت مرحلة ما قبل الحضانة والسماح احتضان لمدة 2 ساعة، ثم نقل إلى عازلة الحضانة مع مبيدات الأعشاب، ومرة ​​أخرى إضافة 100 ميكرومتر المانع. على سبيل المثال، الملاثيون وtetcyclacis تمنع بعض الأنشطة السيتوكروم P450 في النباتات 15-17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل جزء مغمورة من أوراق رفعه مع الماء منزوع الأيونات ونقل أوراق رفعه إلى ربع قوة Murashige وسكوغ (MS) أملاح الحل (500 ميكرولتر) ل0 ساعة، 5 ساعة، 11 ساعة، 23 ساعة، أو 35 ساعة، على التوالي، في غرفة النمو لدراسة التمثيل الغذائي وقتا بالطبع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد عن طريق إزالة إجازةالصورة من حل الحضانة في نقطة زمنية مناسبة ويدويا طحن كل الأنسجة ورقة في النيتروجين السائل باستخدام أنبوب البولي بروبلين (15 مل)، والزجاج مدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج مبيدات الأعشاب رديولبلد وعناصره من كل ورقة مع 7 مل من 90٪ الأسيتون مع الخالط الأنسجة مختبر في نفس أنبوب البولي بروبلين على النحو الوارد أعلاه. شطف الخالط الأنسجة مع 7 مل إضافية من 90٪ الأسيتون، ومواصلة التجانس حتى يتم حطمت الأنسجة تماما (عادة حوالي 2 دقيقة). ملاحظة: 90٪ الأسيتون يمكن أن تستخدم لاستخراج معظم الأعشاب من الأنسجة النباتية. ومع ذلك، إذا كان هذا الأسلوب غير قادر على استخراج أكثر من 90٪ من المركبات رديولبلد استيعابها، ثم 90٪ الميثانول أو 90٪ الأسيتونتريل يمكن أن تكون بديلا مثل المذيبات الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية 90٪ مقتطفات الأسيتون (14 مل الكل) وتخزينها في -4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة للسماح لاستخراج إضافية تحدث. ملاحظة: بعد هذه استخراج أوراق المعالجة، ومقدار راد المستخلصioactivity عادة لا يقل عن 98٪ من المركبات رديولبلد تستوعبها ورقة المعالجة. النشاط الإشعاعي غير القابل للاستخراج (بقايا ملزمة) في أوراق رفعه متوسط ​​0.3٪ فقط في كل نقطة زمنية في دراستنا السابقة 12، ولكن يمكن أن تختلف هذه الكمية وفقا لمبيدات الأعشاب المستخدمة ونقطة زمنية فحصها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحصول على عينات الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة والتركيز supernatants عند 40 درجة مئوية مع المبخر الدوار حتى الحجم النهائي من 0.5 مل. نقل هذا الحجم إلى أنبوب بلاستيكي 2.0 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأسيتونتريل: الماء (1: 1، من حيث الحجم) لضبط الحجم النهائي من المستخلصات النباتية إلى 1.25 مل وإعادة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة أي الجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مجموع النشاط الإشعاعي في قسامة أخذت من كل عينة (DPM ميكرولتر -1) من خلال التلألؤ السائل الطيفي (LSS) 12 وتطبيع كميات من [14 C المسمى] مركبات حقن لتحليل HPLC (على سبيل المثال، 10،000 جميع DPM / عينة / المدى) حتى ص محاور، سوف تكون موحدة بين عينات عندما الرسوم البيانية النتائج. </li></ol> 3. تحليل HPLC من مبيدات الأعشاب التمثيل الغذائي في أوراق رفعه ملاحظة: حل مجموع النشاط الإشعاعي استخراجها إلى مبيدات الأعشاب ومبيدات الأعشاب الأم الأيض باستخدام الظروف RP-HPLC التالية 12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء RP-HPLC مع C 18 عمود (4.6 × 250 ملم، 5 ميكرون حجم الجسيمات لHPLC التحليلي) بمعدل تدفق 1 مل دقيقة -1 بالنسبة لمعظم الأعشاب غير القطبية. ملاحظة: يمكن أيضا أعمدة C 4 أو C 12 RP-HPLC أن تستخدم لتحسين فصل مبيدات الأعشاب الأم من عناصره. مرشح ما قبل العمود و / أو عمود الحرس يمكن أيضا أن تستخدم لحماية وإطالة عمر العمود RP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الطور المتحرك التالية لRP-HPLC: شاطف A، حمض الفورميك 0.1٪ (ت / ت) في الماء، وشاطف B 100٪ HPLC الصف الأسيتونتريل. ملاحظة: يمكن أيضا HPLC الصف الميثانول أن تستخدم شركةuent B لحل مركبات أكثر القطبية والأيض، ولكن كن على علم بأن قد تتغير أيضا الاحتفاظ مرات. ملاحظة: الملف الشخصي شطف استخدامها لحل mesotrione أو primisulfuron ميثيل من نواتج الأيض القطبية في بحثنا 12 غير: الخطوة 1، A: B (4: 1، V / V) لA: B (3: 2، ت / ت ) في الانحدار الخطي (12 دقيقة). الخطوة 2، A: B (3: 2، ت / ت) لA: B (3: 7، ت / ت) في الانحدار الخطي (5 دقائق)؛ الخطوة 3، A: B (3: 7، ت / ت) لA: B (1: 9، ت / ت) في الانحدار الخطي لمدة 2 دقيقة (التي تضم ما مجموعه 19 دقيقة). ملاحظة: قد تحتاج التدرجات والخطوات isocratic إلى تعديل بناء على الخصائص الفيزيائية للمواد الأم من أجل تحسين دقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات الانحدار الخطي أعلاه مع A: B (1: 9، ت / ت) لA: B (4: 1، V / V) في الانحدار الخطي (3 دقائق) وA: B (4: 1، V / V) خطوة isocratic (لمدة 2 دقيقة على الأقل) لإعادة توازن العمود RP-من قبل حقن مستخلص المقبل 12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف وتصور المركبات رديولبلد مع تدفق Scintillation محلل. تسجيل كمية من مبيدات الأعشاب الأم المتبقية في كل عينة كنسبة مئوية من إجمالي النشاط الإشعاعي في كل عينة (الكشف عن وكميا من التلألؤ محلل تدفق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لتحديد معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في كل السكان waterhemp أثناء الوقت. </li></ol> 4. الإجراءات الإحصائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب العلاجات في تصميم عشوائية تماما (أو ترتيب آخر مناسب للتحليل الإحصائي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تجربتين مستقلة مع كل معاملة، تتألف من ثلاثة مكررات البيولوجية لكل تجربة. وتشمل التجارب المستقلتين ستة مكررات البيولوجية في المجموع. إذا كان تأثير التجربة هو غير هام (α = 0.05)، والجمع بين وتحليل البيانات من كل تجربة مستقلة. إذا كان تأثير التجربة هو كبير، ثم تحليل كل تجربة على حدة. ملاحظة: تضمين أول ثلاث مكررات البيولوجية طن التجربة 1 ومكررات البيولوجية الثلاثة المقبلة في تجربة 2. كل تكرار البيولوجي يمثل &quot;الأم&quot; متميزة خط نسيلي المستمدة من كل السكان (MCR 1-6 و1-6 ACR، وWCS 1-6) بحيث يكون لكل زمنيا تحليل بالطبع يستخدم النباتات وراثيا متطابقة. وتشمل التجارب المستقلتين ستة مكررات البيولوجية في المجموع، والذي يسمح للتمثيل كاف من التباين الوراثي والاصرار لمتوسط ​​DT 50 لكل السكان waterhemp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات مع غير الخطية تحليل الأقل الساحات الانحدار ويصلح لهم مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير DT 50 ق. توضح المعادلة أدناه نموذج: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حيث في هذا النموذج ذ يمثل النسبة المئوية للمبيدات الأعشاب الأم المتبقية في الزمن t، μ ط هو DT 50 لكلwaterhemp السكان ط، والمعلمة C 0 هو المبلغ المقدر من الأم مبيدات الأعشاب الحاضر في تي = 0 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Yu, Q., Powles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism-based+herbicide+resistance+and+cross-resistance+in+crop+weeds:+A+threat+to+herbicide+sustainability+and+global+crop+production.">Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production.</a> Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).</li><li>Powles, S. B., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+in+action:+plants+resistant+to+herbicides.">Evolution in action: plants resistant to herbicides.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).</li><li>Heap, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+perspective+of+herbicide-resistant+weeds.">Global perspective of herbicide-resistant weeds.</a> Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).</li><li>D&#233;lye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-target-site-based+resistance+should+be+the+centre+of+attention+for+herbicide+resistance+research:+Alopecurus+myosuroides+as+an+illustration.">Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration.</a> Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).</li><li>Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+enzymes+for+a+new+job.+Herbicide+detoxification+in+plants.">Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants.</a> Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).</li><li>Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+without+intoxication:+herbicide+safeners+activate+plant+defense+gene+expression.">Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression.</a> Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).</li><li>Siminszky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cytochrome+P450-mediated+herbicide+metabolism.">Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism.</a> Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).</li><li>Fonn&#233;-Pfister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxylation+of+primisulfuron+by+an+inducible+cytochrome+P450-dependent+monooxygenase+system+from+maize.">Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).</li><li>Steckel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dioecious+Amaranthus+spp.:+here+to+stay.">The dioecious Amaranthus spp.: here to stay.</a> Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).</li><li>Horak, M. J., Loughin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+analysis+of+four+Amaranthus+species.">Growth analysis of four Amaranthus species.</a> Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).</li><li>Hausman, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+HPPD-inhibiting+herbicides+in+a+population+of+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus)+from+Illinois,+United+States.">Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States.</a> Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+detoxi&#64257;cation+mechanisms+confer+resistance+to+mesotrione+and+atrazine+in+a+population+of+waterhemp.">Distinct detoxi&#64257;cation mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp.</a> Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-target-site+resistance+to+ALS+inhibitors+in+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus).">Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus).</a> Weed Science. in press, (2015).</li><li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus)+biotype+with+multiple+resistance+across+three+herbicide+sites+of+action.">A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action.</a> Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).</li><li>Kreuz, K., Fonn&#233;-Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide-insecticide+interaction+in+maize:+malathion+inhibits+cytochrome+P450-dependent+primisulfuron+metabolism.">Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).</li><li>Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. , 247-322 (2005).</li><li>Hawkes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesotrione:+mechanism+of+herbicidal+activity+and+selectivity+in+corn.">Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn.</a> Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference &#8211; Weeds. 2, 563-568 (2001).</li><li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+herbicide+responses+among+Illinois+waterhemp+(Amaranthus+rudis+and+A.+tuberculatus)+populations.">Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations.</a> Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).</li><li>Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+resistance+across+glufosinate,+glyphosate,+paraquat+and+ACCase-inhibiting+herbicides+in+an+Eleusine+indica+population.">Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.</a> Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).</li><li>Iwakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+CYP81A12+and+CYP81A21+are+associated+with+resistance+to+two+acetolactate+synthase+inhibitors+in+Echinochloa+phyllopogon.">Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon.</a> Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

طريقة رفعه ورقة الموصوفة هنا تم استخدامها سابقا في البحث الأيض primisulfuron في الذرة يترك 15، ولكن تظهر نتائجنا أن هذا البروتوكول هو أيضا فعالة ودقيقة، وقابلة للتكرار لقياس التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في أنواع الأعشاب dicot 12. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ور...

مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة يشكل تهديدا خطيرا للإنتاج العالمي من المواد الغذائية والألياف 1،2. حاليا، الآلاف من السكان مقاومة وbiotypes من أكثر من مائة أنواع الأعشاب في جميع أنحاء العالم وقد تم توثيق ودراسة 3. آلية الكبرى التي تمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في النباتات هي تغيير مبيدات الأعشاب الجينات والبروتينات الموقع المستهدف، بما في ذلك الطفرات الوراثية التي تؤثر على حركية ملزمة مبيدات الأعشاب البروتين أو التضخيم من الجينات الموقع المستهدف 2. إزالة السموم الأيضية عبر الأنشطة مرتفعة من أكسيجيناز أحادية السيتوكروم P450 (P450) أو الجلوتاثيون S -transferase (GST) الإنزيمات هو آلية أخرى الذي يمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة، والذي يختلف بعدة طرق من الآليات القائمة على الموقع المستهدف-2. المقاومة القائم على التمثيل الغذائي لها تداعيات كبيرة على ما إذا كانت تكاليف اللياقة البدنية النبات (ويعرف أيضا باسم عقوبات اللياقة البدنية) قد تنجم عن mechanis مبيدات الأعشاب المقاومةم، وكذلك بشأن احتمال وجود آلية إزالة السموم واحدة للتشاور المقاومة العابرة أو متعددة مبيدات الأعشاب في السكان الاعشاب 1،2،4. عموما، يمكن تقسيم عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في النباتات إلى ثلاث مراحل متميزة 5. وتشمل المرحلة الأولى تحويل مبيدات الأعشاب أو تفعيل مثل الهيدروكسيل P450 بوساطة من الحلقات العطرية أو مجموعات الألكيل، أو N - أو ردود فعل dealkylation O-، مما يؤدي إلى زيادة الاستقطاب ومبيدات الأعشاب الجزئي إزالة السموم 5،6. أدخلت حديثا المجموعات الوظيفية في المرحلة الأولى يمكن أن توفر مواقع الربط لاقتران إلى انخفاض الجلوتاثيون التي كتبها GSTs أو إلى جلوكوز عن طريق glycosyltransferases UDP التي تعتمد في المرحلة الثانية 5،7. على سبيل المثال، والأيض الأولي الرئيسي للprimisulfuron-الميثيل في الذرة هو هيدروكسي primisulfuron ميثيل 8، والتي يمكن استقلاب أيضا على هيدروكسي primisulfuron-جلوكوسيدي (المرحلة الثانية) ومن ثم نقلها إلى فجوة للتخزين طويل الأجل أو زيادة الأيض المؤيدcessing 5،6 (المرحلة الثالثة). Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) هي التي يصعب السيطرة عليها، dicot الأنواع السنوية الاعشاب التي تعيق إنتاج الذرة (ذرة شامية) وفول الصويا (جليكاين ماكس)، والقطن (الكرسف أزغب) في الولايات المتحدة. ومما يسهل على درجة عالية من التنوع الجيني للwaterhemp التي لها البيولوجيا ثنائي الجنس والمسافات الطويلة تلقيح الرياح، ومحطة waterhemp أنثى واحدة يمكن أن تنتج ما يصل إلى مليون البذور 9. هذه البذور صغيرة وتنتشر بسهولة، والتي تمنح بشكل طبيعي waterhemp مع آلية تشتت فعالة. Waterhemp يعرض إنبات مستمرة طوال موسم النمو 9، وبذوره قادرة على الإنبات بعد عدة سنوات من السكون. Waterhemp هو نبات C 4 التي تمتلك معدل نمو أعلى من معظم الأعشاب ذات الأوراق العريضة في النظم الزراعية الصالحة للزراعة 10. بالإضافة إلى ذلك، العديد من السكان waterhemp مقاومة لفام متعددةilies مبيدات الأعشاب 3. عدد سكانها waterhemp (المعين MCR) عن ولاية إلينوي مقاوم لل4-هيدروكسي-فينيل بيروفات دي أكسيجيناز (HPPD) -inhibiting مبيدات الأعشاب 11، مثل mesotrione، فضلا عن الأترازين وسينسيز acetolactate (ALS) -inhibiting مبيدات الأعشاب، بما في ذلك primisulfuron ميثيل ، نظرا لعدم استهداف الموقع الآليات القائمة 12،13. عدد السكان مختلفة من waterhemp المعينة ACR 14، وهو primisulfuron مقاومة للالميثيل (بسبب طفرة في جين ALS)، ولكن حساسية لmesotrione مقاومة للالأترازين، ويبلغ عدد سكانها waterhemp المعينة WCS 14 التي تعتبر حساسة لprimisulfuron ميثيل، استخدمت mesotrione، والأترازين بالمقارنة مع MCR في بحث سابق لدينا 12 والتجارب الحالية (ملخصة في الجدول 1). لم الدراسات الأولية لم يكشف تغييرات في مستويات التسلسل الجيني HPPD أو التعبير، أو انخفاض امتصاص mesotrione، في MCRالسكان بالمقارنة مع السكان الحساسة mesotrione 12. ومع ذلك، دراسات التمثيل الغذائي مع النباتات الكاملة أظهروا مستويات أقل بكثير من mesotrione الأم مبيدات الأعشاب في MCR مقارنة مع ACR وWCS، التي ترتبط مع ردود المظهري السابقة لmesotrione 11،12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Waterhemp السكان </td><td> الاختصار </td><td> النمط الظاهري لMesotrione </td><td> آلية Mesotrione المقاومة </td><td> النمط الظاهري لPrimisulfuron </td><td> آلية Primisulfuron المقاومة </td></tr><tr><td> ماكلين مقاطعة مقاومة لل </td><td> MCR </td><td> مقاوم </td><td> التمثيل الغذائي* </td><td> مقاوم </td><td> التمثيل الغذائي </td></tr><tr><td> آدامز مقاطعة مقاومة لل </td><td> ACR </td><td> Sensitإيف </td><td> - </td><td> مقاوم </td><td> طفرة في الموقع المستهدف في ALS 14 </td></tr><tr><td> مقاطعة وين-حساس </td><td> WCS </td><td> حساس </td><td> - </td><td> حساس </td><td> - </td></tr></tbody></table> * آليات المقاومة غير المستهدفة الموقع، بخلاف تعزيز عملية التمثيل الغذائي، ويمكن أيضا أن تمنح المقاومة mesotrione في عدد السكان MCR 12. الجدول 1: وصف السكان waterhemp عن ولاية إلينوي المستخدمة في هذه الدراسة. بالإضافة إلى تحديد معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في الشتلات waterhemp سليمة، تم وضع المنهج التجريبي مختلفة ويعملون في بحثنا السابق للتحقيق في عملية التمثيل الغذائي باستخدام waterhemp رفعه ورقة فحص 12 فضلا عن مختلف مثبطات P450 (على سبيل المثال، tetcyclacis والملاثيون). وقد تم تكييف هذه الطريقة على وجه التحديد لwaterhemp من PREVIالتحقيق الأوس الأيض-primisulfuron الميثيل في الذرة رفعه يترك 15، منذ لم يتم إبلاغ ورقة فحص المستأصل لإجراء البحوث الأيض مبيدات الأعشاب في مصنع dicot. تم الحشرات الملاثيون organophophosate كثيرا ما تستخدم في الجسم الحي في المختبر البحوث مبيدات الأعشاب الأيض تشير إلى تورط P450 16. على سبيل المثال، والتسامح، والتمثيل الغذائي السريع لmesotrione في الذرة ومن المقرر أن P450 المحفزة الهيدروكسيل الحلبة، والتي تم التحقق عندما الملاثيون زيادة الحساسية الذرة إلى mesotrione 17. وبالمثل، تحول دون الملاثيون التمثيل الغذائي للALS المانع primisulfuron-الميثيل في الذرة رفعه يترك 15. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ورقة رفعه هو أن البيانات التي تم إنشاؤها مستقلة عن أنماط النبات كامل النبات، عاملا هاما في الاعتبار عند تقييم التمثيل الغذائي للالنظامية ومبيدات الأعشاب مبيد في النباتات. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب يسمح الكمي ويحلل التمثيل الغذائي النوعي للتركيز على ورقة واحدة تعالج 12. استراتيجية استنساخ الخضري، في تركيبة مع بروتوكول رقة المستأصل، استخدمت سابقا في waterhemp لإجراء دراسات عملية التمثيل الغذائي 12. ونظرا لطبيعة التهجين من waterhemp (منفصلة للذكور والإناث النباتات)، ودرجة كبيرة من التنوع الجيني داخل الأنواع Amaranthus ثنائي الجنس 9، يضمن هذا البروتوكول الذي تم تحليل الشتلات waterhemp وراثيا متطابقة ضمن التجارب وقتا بالطبع. توضح هذه المقالة الأداة المساعدة للأسلوب ورقة رفعه لقياس معدلات التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة dicot (waterhemp). تم تحديد كمية المبيدات الأم تبقى في كل نقطة زمنية (الشكل 1) من غير الخطية أقل التحليل الساحات الانحدار، وكان مناسبا مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير الوقت ل50٪ من مبيدات الأعشاب استيعابها لتتحلل ( DT 50). ممثليتم عرض الاستشرابية من عكس المرحلة العالية الاداء اللوني السائل (RP-HPLC) للALS-المقاومة والسكان waterhemp -sensitive، التي تشير إلى اختفاء مبيدات الأعشاب الأم وتشكيل يصاحب ذلك من المستقلب القطبي (الصورة) خلال دراسة وقتا بالطبع (الشكل 2). محور مقالنا هو وصف وإثبات فائدة من ورقة فحص المستأصل في تركيبة مع طريقة الاستنساخ النباتي لتحديد معدلات دقيقة وقابلة للتكرار في استقلاب مبيدات الأعشاب في محطات dicot، وذلك باستخدام بشكل موحد وصفت حلقة (URL- 14 C) مبيدات الأعشاب في ثلاثة السكان waterhemp التي تختلف في ردود كامل مصنع لHPPD- ومبيدات الأعشاب تثبيط ALS (الجدول 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

تم الكشف عن اختلافات كبيرة في معدلات الأيض mesotrione بين إما WCS أو ACR وMCR (الشكل 1). في كل نقطة زمنية، قد MCR استقلاب mesotrione بسرعة أكبر من اثنين من السكان الحساسة mesotrione، WCS وACR، الذي يرتبط مع الردود السابقة المظهرية كامل النبات 11. عن طريق الاستنساخ ما يكفي من النبا...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay at JoVE.com

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

قياس معدلات المبيدات الأيض في Dicot الأعشاب مع الفحص رفعه ليف

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

measuring-rates-herbicide-metabolism-dicot-weeds-with-an-excised-leaf

Research

JoVE Journal

Environment

11.9K Views.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Video: Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

قياس تدفقاتها من المغذيات المعدنية والمواد السامة في النباتات مع المشعة الراسمات

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

بروتوكولات قوية مبيدات الأعشاب اختبار المقاومة بأنواع الأعشاب مختلفة

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS تحليل الصفائح الدموية البشرية باعتبارها منصة لدراسة الميتوكوندريا الأيض

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

المختبر وبروتوكول الميدانية لتقدير معدلات تحات ورقة من ديندروجيومورفولوجي

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

مقايسة Biosensor اللاهوائية للكشف عن الزئبق والكادميوم

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

تقدير معدلات إزالة النتروجينيات الرواسب باستخدام النوى ون2س ميكروسينسورس

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

قياس شكل وحجم الجسيمات للحماه معطلة في أجار مع أنبوب لبرمجيات مصدر المفتوح

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

زراعة الطحالب الخضراء في فقاعة العمود Photobioreactors وفحص للدهون محايدة

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

تقدير مؤشر منطقة الورق باستخدام ثلاث طرق متميزة في مواقف نفضي نقية

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a non-targeted approach, plant metabolites and xenobiotics of interest are identified and localized in plant tissues to uncover&#160;specific distribution patterns. Then, in silico prediction of potential metabolites (i.e., catabolites and conjugates) from the identified xenobiotics is performed. When a xenobiotic metabolite is located in the tissue, the type of enzyme involved in its alteration by the plant is recorded. These results were used to describe different types of biological reactions occurring in S. alba leaves in response to xenobiotic accumulation in the leaves. The metabolites were predicted in two generations, allowing the documentation of successive biological reactions to transform xenobiotics in the leaf tissues.

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

This method uses mass spectrometry imaging (MSI) to understand metabolic processes in S. alba leaves when exposed to xenobiotics. The method allows the spatial localization of compounds of interest and their predicted metabolites within specific, intact tissues.

التحقيق في التمثيل الغذائي Xenobiotics في ساليس ألبا يترك عن طريق التصوير الطيفي الشامل

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...