We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. Pflanzenmaterial, Wachstumsbedingungen und Vegetative Cloning Hinweis: Drei waterhemp Populationen wurden in dieser Forschung untersucht: MCR (von McLean County, IL), ACR (von Adams County, IL) und WCS (von Wayne County, IL) (Tabelle 1). <ol><li> Sammeln und waterhemp Samen in 0,1 g L -1 Agar auszusetzen: Wasser-Lösung bei 4 ° C für mindestens 30 Tage, um die Keimung zu verbessern. Hinweis: Einige waterhemp Populationen sind ruhend, aber dieser Schritt hilft, Keimruhe zu überwinden und Samen keimen gleichmäßiger. </li><li> Samen keimen jedes waterhemp Population (wie in Tabelle 1) in 12 x 12 cm Schalen, enthaltend ein Einbettungsmedium im Gewächshaus. <ol><li> Pflegen Gewächshausbedingungen bei 28/22 ° C Tag / Nacht-Temperaturen in einem 16/8 h Photoperiode 12. </li><li> Ergänzung natürliches Licht im Gewächshaus mit Licht von Quecksilberdampflampen, ein Minimum von 500 &amp; mgr; mol m -2 liefern </sup&gt; sec -1 Photonenfluss im Pflanzenbestand Ebene. </li></ol></li><li> Transplantation hervor Sämlinge, wenn sie 2 cm hoch in 80 cm 3 Töpfe im Gewächshaus. </li><li> Sämlinge in 950 cm 3 Töpfe mit einem 3: 1: 1: 1-Mischung aus Blumenerde mischen: Boden: Torf: Sand, wenn Sämlinge sind 4 cm hoch. In 5 g Langzeitdünger Granulat zu jedem Topf und mit diesem Bodenmischung mischen. </li><li> Schneiden Sie und entfernen Sie die Sprossapikalmeristem mit den drei jüngsten Blätter von 7 cm hohen Pflanzen zu Apikaldominanz beseitigen. Hinweis: Dieser Schritt stellt sicher, dass jede Anlage wird genug 3 cm Achselsprossen zu klonen wachsen. </li><li> Verbrauch fünf Achseltriebe (3 cm Länge), wenn Sämlinge sind ca. 14 cm groß aus jeder waterhemp Bevölkerung (wie in Tabelle 1). Entfernen der Mehrzahl der Blätter auf diesen axilläre Knospen um den Wasserverlust bei der weiteren Handhabung zu verringern, behalten aber die zwei jüngsten Blätter zu weiterem Wachstum bei Transplantation ermöglichen. <br/&gt; Hinweis: Behandeln Sie sorgfältig und versuchen Sie nicht, um die Triebe beschädigen, wenn das Entfernen der Blätter. Beschriften Sie jedes Werk mit einer Beteiligung. </li><li> Transplant Achsel schießt in 80 cm 3 Töpfen (eine Keimling pro Topf) in Blumenerde Medium, das das gleiche Medium zum Keimen verwendet wird. Potting-Medium sollte zunächst gesättigt, bis Wurzeln Form in der Wachstumskammer, dann konstant zu halten Feuchtigkeit und Ort Töpfen in der Wachstumskammer für 7 Tage, um Wurzeln zu etablieren. Hinweis: Pflanzen sind an diesem Punkt sehr empfindlich und sollte nicht betont werden. <ol><li> Pflegen Wachstumskammer Bedingungen bei 28/22 ° C Tag / Nacht-Temperaturen in einem 16/8 h Photoperiode 12. </li><li> Eine Kombination von Glühlampen und Leuchtstoffröhren können verwendet werden, um Licht in die Wachstumskammer zur Verfügung zu stellen und sollte mindestens 550 &amp; mgr; mol m -2 s -1 Photonenfluss bei Pflanzendach Level 12 zu liefern. </li></ol></li><li> Transplantation wieder in 950 cm 3 Töpfen (eine Keimling pro Topf) containing einen 3: 1: 1: 1-Mischung aus Blumenerde mischen: Boden: Torf: Sand (auch 5 g Langzeitdünger Granulat) bei geklonten Pflanzen sind 4 cm groß, dann zurück in das Gewächshaus übergeben. </li><li> Klonen Sie die Pflanzen ein zweites Mal mit dem gleichen oben beschriebenen Verfahren (dh wiederholen Sie die Schritte 1,5 bis 1,8, und dann gehen Sie zu Schritt 2.1). Für einen typischen zeitlichen Verlauf Studie zu generieren Klone aus mindestens sechs unabhängige Pflanzen aus jeder waterhemp Bevölkerung und speichert sie als Linien MCR 1-6, 1-6 und ACR WCS 1-6. <ol><li> Stellen Sie mindestens sechs verschiedene &quot;Eltern&quot; klonalen Linien, um das Experiment zu wiederholen und angemessen vertreten genetische Variabilität innerhalb der einzelnen waterhemp Bevölkerung. </li><li> Je nachdem, wie viele Zeitpunkten analysiert werden, erzeugen genügend Unter Klone aus jeder &quot;Eltern&quot; klonalen Linie, um eine Zeitverlaufsstudie durchzuführen. </li></ol></li></ol> 2. Die Durchführung einer Stoffwechselstudie mit herausgeschnitten Waterhemp Leaves <ol><li> Verbrauchsteuern Das Dritt jüngsten Blätter (2 bis 3 cm in der Länge, sind 0,5 cm befestigt Blattstiel), wenn geklont waterhemp Pflanzen sind 10 bis 12 cm hoch Herbizid-Stoffwechsel und DT 50 Analyse. </li><li> Cut Blattstielen von jedem waterhemp Werk ein zweites Mal (um sicherzustellen, dass 0,3 cm des Blattstiels bleibt) unter Wasser, und legen Sie diese Schnittenden in 1,5 ml-Kunststoffröhrchen (ein Blatt pro Fläschchen) 15. Hinweis: Schneiden ein zweites Mal unter Wasser verhindert Bildung von Luftblasen und Verstopfen Xylemgefäße. <ol><li> Zum einen teilweise ausgeschnittenen Blättern mit geschnittenen Blattstiel in Vorinkubation Puffer (200 ul) von 0,1 M Tris-HCl (pH 6) eintauchen für 1 Stunde. </li><li> Zweitens bewegt jedes Blatt in ein neues 1,5-ml-Ampulle, enthaltend eine Inkubations-Puffer (200 ul) von 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 &amp; mgr; M [URL- 14 C] Herbizid, und Inkubieren bei 28 ° C für 1 Stunde, um ermöglichen eine Herbizidabsorption in die Blätter. Hinweis: Die beiden 14 C-Mesotrion und <sbis&gt; 14 C-Primisulfuron-methyl wurden in unseren Untersuchungen bei spezifischen Aktivitäten von etwa 20 mCi mmol -1. Sowohl Diffusion und durch das Xylem Transpirationsstrom Auffassung tragen zur Herbizidmenge, die pro Blatt gemacht. Anmerkung: Die Wirkung von metabolischen Inhibitoren auf Herbizid-Metabolismus durch Modifizieren Schritten 2.2.1 und 2.2.2 ermittelt werden. Je 100 &amp; mgr; M des Inhibitors in die Pre-Inkubationspuffer und lassen Inkubation für 2 Stunden, dann auf Inkubationspuffer Transfer mit Herbizid und erneut hinzufügen 100 &amp; mgr; M Inhibitor. Zum Beispiel, Malathion und tetcyclacis hemmen bestimmten Cytochrom-P450-Aktivitäten in Pflanzen 15-17. </li><li> Waschen Sie den eingetauchten Teil des ausgeschnittenen Blättern mit VE-Wasser und übertragen geschnitten Blätter zu einem Viertel festen Murashige und Skoog (MS) Salzlösung (500 ul) für 0 h, 5 h, 11 h, 23 h oder 35 h zugeführt, in der Wachstumskammer für den Zeitverlauf Stoffwechsel Studie. </li></ol></li><li> Ernte durch Entfernen Urlaubs aus Inkubationslösung bei der geeigneten Zeitpunkt manuell schleifen jedes Blattgewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Polypropylen-Röhrchen (15 ml) und Glaspistill. </li><li> Extrahieren radiomarkierten Herbizid und seiner Metaboliten, die jedes Blatt mit 7 ml 90% Aceton mit einem Labor Gewebehomogenisator in der gleichen Polypropylen-Röhrchen wie oben. Spülen Gewebehomogenisator mit zusätzlichen 7 ml 90% igem Aceton und weiter zu homogenisieren, bis die Gewebe wird gründlich pulverisiert (üblicherweise etwa 2 min). Anmerkung: 90% Aceton zur Extraktion der meisten Herbizide aus Pflanzengeweben verwendet werden. Wenn jedoch diese Methode nicht mehr als 90% der aufgenommenen radiomarkierten Verbindungen zu extrahieren, dann 90% Methanol oder 90% Acetonitril als Extraktionslösungsmittel ersetzt werden. </li><li> Label 90% Acetonextrakte (14 ml insgesamt) und lagern bei 4 ° C für 16 Stunden, damit für zusätzliche Extraktion auftreten. Anmerkung: Nach dieser Extraktion der behandelten Blätter, die Menge an extrahierbarem radioactivity beträgt typischerweise mindestens 98% des durch das behandelte Blatt aufgenommen radiomarkierten Verbindungen. Nichtextrahierbare Radioaktivität (gebundene Reste) in Blätter ausgeschnitten gemittelt 0,3% über alle Zeitpunkte in unserer früheren Studie 12, aber diese Menge kann entsprechend dem verwendeten Herbizids Zeitpunkt geprüft variieren. </li><li> Zentrifuge Proben bei 5000 g für 10 min und Konzentratüberstände auf 40 ° C mit einem Rotationsverdampfer bis zu einem Endvolumen von 0,5 ml erhalten wird. Übertragen Sie diese Lautstärke auf ein 2,0 ml Kunststoffröhrchen. </li><li> Hinzufügen Acetonitril: Wasser (1: 1, auf das Volumen) verstellen das Endvolumen der Pflanzenextrakte und 1,25 ml und Wiederzentrifuge bei 10.000 × g für 10 Minuten, um alle Partikel zu entfernen. </li><li> Messen Gesamtradioaktivität in einem Aliquot von jeder Probe (dpm ul -1) durch Flüssigszintillationsspektroskopie (LSS) 12 aufgenommen und zu normalisieren Mengen an [14 C-markiertem] Verbindungen, HPLC injiziert (zum Beispiel 10,000 Gesamt dpm / sample / run) so y-Achse wird zwischen den Proben einheitlich sein, wenn die grafische Ergebnisse. </li></ol> 3. HPLC-Analyse der Herbizid Metabolism in Abgeschnittene Blätter Hinweis: Resolve insgesamt extrahierbare Radioaktivität in die Mutter Herbizid und Herbizid-Metaboliten unter Verwendung der folgenden RP-HPLC-Bedingungen 12. <ol><li> Zuführen RP-HPLC mit einer C18-Säule (4,6 x 250 mm, 5 um Teilchengrße für analytische HPLC) mit einer Flussrate von 1 ml min -1 für die meisten nicht-polaren Herbizide. Anmerkung: C 4 oder C 12 RP-HPLC-Säulen kann auch verwendet werden, um die Trennung der Mutter Herbizid aus seiner Metaboliten zu optimieren. Eine Vorsäule Filter und / oder Schutzsäule können ebenfalls zum Schutz und zur Verlängerung der Lebensdauer der RP-Säule werden. <ol><li> Verwenden Sie den folgenden mobilen Phase für die RP-HPLC: Eluent A, 0,1% Ameisensäure (v / v) in Wasser und Eluent B 100% HPLC-Qualität Acetonitril. Hinweis: HPLC-grade Methanol kann auch als El verwendet werdenießend B für die Lösung mehrere polare Verbindungen und Metaboliten, aber beachten Sie, dass die Retentionszeiten können auch geändert werden. Hinweis: Das Elutionsprofil verwendet, um Mesotrion oder Primisulfuron-methyl ihrer polaren Metaboliten in unserer Forschung 12 zu lösen ist: Schritt 1, A: B (4: 1, v / v) bis A: B (3: 2, v / v ) in einem linearen Gradienten (12 min); Schritt 2, A: B (3: 2, v / v) bis A: B (3: 7, v / v) in einem linearen Gradienten (5 min); Schritt 3 A: B (3: 7, v / v) bis A: B (1: 9, v / v) in einem linearen Gradienten für 2 Minuten (insgesamt 19 Minuten). Hinweis: Farbverläufe und isokratische Schritte müssen möglicherweise auf der Grundlage der physikalischen Eigenschaften des Grundmaterials, um die Auflösung zu optimieren eingestellt werden. </li><li> Den oben genannten linearen Gradienten Stufen A: B (1: 9, v / v) bis A: B (4: 1, v / v) in einem linearen Gradienten (3 min) und A: B (4: 1, v / v) isokratisch Schritt (mindestens 2 Minuten) neu äquilibrieren die RP-Säule vor dem Einspritzen des nächsten 12-Extrakt. </li></ol></li><li> Erkennen und visualisieren radiomarkierten Verbindungen mit einer Durchfluss Scintillation Analyzer. Aufzeichnung der Menge an in jeder Probe als Prozentsatz der Gesamtradioaktivität in jeder Probe verbleibenden Mutter Herbizid (ermittelt und vom Durchfluss-Szintillations-Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert), Rate des Herbizids Stoffwechsel in jedem waterhemp Population während des Zeitverlaufs zu bestimmen. </li></ol> 4. Statistische Verfahren <ol><li> Vereinbaren Behandlungen in einer vollständig randomisierten Design (oder andere geeignete Anordnung für die statistische Analyse). </li><li> Führen zwei unabhängigen Experimenten mit jeder Behandlung drei biologischen Wiederholungen für jedes Experiment enthalten. Die zwei unabhängigen Experimenten sind sechs biologischen Replikaten in insgesamt. Wenn das Experiment Effekt ist nicht signifikant (α = 0,05), zu kombinieren und zu analysieren, Daten von jedem unabhängigen Experiment. Wenn das Experiment Effekt wesentlich ist, dann analysieren jedes Experiment gesondert. Hinweis: Fügen Sie die ersten drei biologischen Replikaten in Experiment 1 und die nächsten drei biologischen Replikaten in Experiment 2. Die biologische Replikation stellt eine andere &quot;Eltern&quot; klonalen Linie von jeder Population abgeleitet (MCR 1-6, 1-6 ACR und WCS 1-6), so daß jeder Zeit Natürlich Analyse nutzt genetisch identische Pflanzen. Die zwei unabhängigen Experimenten sind sechs biologischen Replikaten in insgesamt, die für eine angemessene Darstellung der genetischen Variabilität und Ermittlung eines Median DT 50 für jeden waterhemp Bevölkerung ermöglicht. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit nicht-linearen Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate und passen sie mit einer einfachen erster Ordnung Kurve, um abzuschätzen, DT 50 s. Die folgende Gleichung beschreibt das Modell: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> wobei in diesem Modell y den Prozentsatz des zum Zeitpunkt t verbleibenden Mutter Herbizid, μ i der DT 50 für jedenwaterhemp Bevölkerung i, und der Parameter C 0 ist der geschätzte Betrag der Mutter Herbizid vorhanden bei t = 0 12. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die hier beschriebene geschnitten Blatt-Verfahren wurde bereits in der Erforschung Primisulfuron Stoffwechsel in Maisblätter 15 verwendet worden, aber unsere Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll ist auch wirkungsvoll, präzise und reproduzierbar zu messen Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkrautarten 12. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik gegenüber Ganzpflanzen Studien ist, dass ein ausgeschnittener Blatt ist unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster Nachauflauf, sy...

Herbizidresistenz in Unkraut stellt eine ernsthafte Bedrohung für die globale Produktion von Nahrungsmitteln und Faser 1,2. Derzeit Tausende von resistenten Populationen und Biotypen von über hundert Unkrautarten weltweit sind dokumentiert und untersucht 3. Ein Hauptmechanismus, Herbizid-Resistenz verleiht, in Pflanzen ist die Veränderung der Ziel Herbizid-site-Gene und Proteine, einschließlich genetischer Mutationen, herbizid Proteinbindungskinetiken oder Amplifikation der Ziel-Ort-Gen 2 beeinflussen. Metabolische Entgiftung über erhöhte Aktivitäten der Cytochrom P450 Monooxygenase (P450) oder Glutathion-S-Transferase (GST) Enzyme ist ein weiterer Mechanismus, der Herbizid-Resistenz in Unkräutern, die verschiedene in mehrfacher Hinsicht vom Ziel-Ort basierten Mechanismen 2 verleiht. Metabolic-basierten Widerstand hat erhebliche Auswirkungen auf, ob Pflanzen Fitness-Kosten (auch bekannt als Fitness-Strafen) können aus den Herbizidresistenz mechanis führenm, sowie in Bezug auf das Potential für einen einzigen Entgiftungsmechanismus zum Verleihen kreuz- oder mehreren Herbizid-Resistenz in Unkrautpopulationen 1,2,4. Allgemeiner kann Herbizid-Metabolismus in Pflanzen in drei Phasen 5 geteilt werden. Phase I beinhaltet Herbizidumwandlung oder Aktivierung wie P450 Hydroxylierung von aromatischen Ringen oder Alkylgruppen, oder N - oder O- Dealkylierungsreaktionen, was zu erhöhter Polarität und partiellen Entgiftung Herbizid 5,6. Neu eingeführten funktionellen Gruppen in Phase I können Verknüpfungsstellen für die Konjugation an reduziertem Glutathion von GSTs bereitzustellen oder durch UDP-abhängige Glycosyltransferasen in Phase II 5,7 Glucose. Beispielsweise ist die große Anfangs Metabolit Primisulfuron-methyl in Mais hydroxy-Primisulfuron-Methyl 8, die weiter metabolisiert werden können, zu Hydroxy-Primisulfuron-glucosid (Phase II) und dann in der Vakuole zur langfristigen Lagerung oder weitere metabolische transportiert Profibeitung 5,6 (Phase III). Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) ist ein schwer zu Kontrolle, dicot Jahresunkrautarten, die die Produktion von Mais (Zea mays), Sojabohne (Glycine max) und Baumwolle (Gossypium hirsutum) in den Vereinigten Staaten behindert. Der hohe Grad der genetischen Vielfalt der waterhemp sich durch seine zweihäusig Biologie und Fernwindbestäubung ermöglicht, und eine einzelne weibliche waterhemp Pflanze kann bis zu eine Million Samen 9 zu erzeugen. Diese Samen sind klein und leicht verbreiten, was natürlich zu verleihen waterhemp mit einer effektiven Streuvorrichtung. Waterhemp zeigt kontinuierliche Keimung in der gesamten Vegetationsperiode 9, und ihre Samen sind in der Lage, nach mehreren Jahren der Ruhe keimen. Waterhemp ein C 4 Pflanze, die eine höhere Wachstumsrate als die meisten breitblättrigen Unkräutern in Ackeranbausystemen 10 besitzt. Darüber hinaus sind zahlreiche waterhemp Populationen gegen mehrere families von Herbiziden 3. Eine Population von waterhemp (bezeichnet MCR) aus Illinois ist beständig gegen 4-Hydroxy-Dioxygenase (HPPD) inhibierende Herbizide 11, wie Mesotrion, sowie Atrazin und Acetolactatsynthase (ALS) inhibierende Herbizide, einschließlich Primisulfuron-methyl wegen Nichtziel-Website basierten Mechanismen 12,13. Eine andere Population von waterhemp bezeichnet ACR 14, die Primisulfuron-methyl-resistente (aufgrund einer Mutation in dem ALS-Gen) und Atrazin-resistente aber empfindlich gegen Mesotrion und einem waterhemp Population bezeichnet WCS 14, die Primisulfuron-methyl empfindlich ist, Mesotrion und Atrazin wurden im Vergleich zu MCR in unserer früheren Forschung 12 und aktuelle Experimente verwendet (in Tabelle 1 zusammengefasst). Erste Studien keine Veränderungen in den HPPD-Gen-Sequenz oder Expressionsniveaus oder verringert Mesotrion Aufnahme zu erfassen, in der MCR-Bevölkerung im Vergleich mit Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen 12. Allerdings Metabolismus-Untersuchungen mit ganzen Pflanzen zeigten eine signifikant niedrigere Mutter Mesotrion Herbizid in MCR Vergleich ACR und WCS, die mit früheren phänotypische Reaktionen korreliert, um Mesotrion 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp Bevölkerung </td><td> Abkürzung </td><td> Phänotyp zu Mesotrion </td><td> Mesotrion Resistenzmechanismus </td><td> Phänotyp Primisulfuron </td><td> Primisulfuron Resistenzmechanismus </td></tr><tr><td> McLean Grafschaft-Resistant </td><td> MCR </td><td> Widerstandsfähig </td><td> Metabolism * </td><td> Widerstandsfähig </td><td> Stoffwechsel </td></tr><tr><td> Adams County-Resistant </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Widerstandsfähig </td><td> Ziel-Ort Mutation in ALS 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensitive </td><td> WCS </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Sensitive </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Non-Target-Ort-Resistenzmechanismen, andere als verbessert den Stoffwechsel, können ebenfalls zu verleihen Mesotrion Widerstand in der Bevölkerung MCR 12. Tabelle 1: Beschreibung der waterhemp Populationen aus Illinois in dieser Studie verwendet. Neben der Bestimmung Raten von Herbizidmetabolismus in intakten waterhemp Sämlinge, wurde ein anderer experimenteller Ansatz entwickelt und in unserer früheren Forschung eingesetzt, um den Stoffwechsel, indem ein herausgeschnitten waterhemp Blatt Assay 12 sowie verschiedene P450-Inhibitoren (zB tetcyclacis und Malathion) zu untersuchen. Dieses Verfahren wurde speziell für waterhemp aus einem Previ angepaßtous Untersuchung Primisulfuron-methyl-Stoffwechsel in geschnitten Maisblätter 15, da die herausgeschnittenen Blatt Test noch nicht für die Durchführung von Herbizidstoffwechselforschung in einer dikotylen Pflanze berichtet. Die organophophosate Insektizid Malathion wurde häufig für in vivo und in vitro herbizidStoffWechselForschung, um P450 Beteiligung 16 anzugeben. Zum Beispiel, Toleranz und schnellen Metabolismus von Mesotrion bei Mais sind auf P450-katalysierte Ring Hydroxylierung, die überprüft wurde, als Malathion erhöhten Mais Empfindlichkeit auf Mesotrion 17. In ähnlicher Weise gehemmt Malathion Stoffwechsel der ALS-Hemmer Primisulfuron-methyl in geschnitten Maisblätter 15. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik ist, dass Daten erzeugt werden, unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster, ein wichtiger Faktor in die Abwägung Metabolismus von systemischen Nachauflaufherbizide in Pflanzen. Folglich ermöglicht dieses Verfahren die quantitative undqualitative metabolischen Analysen auf einer einzigen behandelte Blatt 12 zu fokussieren. Eine vegetative Klonierungsstrategie, in Verbindung mit dem ausgeschnittenen Blatt Protokoll wurde vorher in waterhemp verwendet, um Stoffwechselstudien 12 durchzuführen. Aufgrund der Natur der Auskreuzung waterhemp (getrennte männliche und weibliche Pflanzen) und hohes Maß an genetischer Vielfalt innerhalb zweihäusig Amaranthus Arten 9, dieses Protokoll gewährleistet, dass genetisch identische waterhemp Sämlinge wurden in den Zeitverlaufsexperimenten untersucht. Dieser Artikel beschreibt den Nutzen der herausgeschnittenen Blatt Verfahren zur Messung der Raten der Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkraut (waterhemp). Die Menge der Mutter Herbizid verblieben war, zu jedem Zeitpunkt (1) durch nichtlineare Kleinste-Quadrate-Regressionsanalyse Sitz mit einer einfachen ersten Ordnung Kurve, um die Zeit für die 50% der absorbierten Herbizids zu erniedrigen Schätzung (bestimmt und wurde DT 50). RepräsentativChromatogramme von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) für ALS-resistente und -sensitive waterhemp Populationen, die das Verschwinden der Mutter Herbizid und gleichzeitiger Bildung von polaren Metaboliten (s) während einer Zeitverlaufsstudie anzuzeigen (Abbildung angezeigten 2). Der Schwerpunkt unseres Artikels ist zu beschreiben und zeigen die Nützlichkeit des herausgeschnittenen Blatt Assay in Kombination mit einem vegetativen Klonen Methode zur Bestimmung präzise und reproduzierbare Raten von Herbizidmetabolismus in dicot Pflanzen, mit gleichmäßig Ring-markierten (URL- 14 C) Herbizide in drei waterhemp Populationen, die in ihrer Ganzpflanzenantworten zu unterscheiden HPPD- und ALS-inhibierenden Herbiziden (Tabelle 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Entweder zwischen WCS oder ACR und MCR (Abbildung 1) wurden große Unterschiede in Raten von Mesotrion Stoffwechsel erkannt. Zu jedem Zeitpunkt, hatte MCR Mesotrion schneller als die beiden Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen, WCS und ACR, die mit früheren Ganzpflanzen phänotypische Reaktionen 11 korreliert metabolisiert. Durch Klonen genug Pflanzen aus einer Elternpflanze aus jeder Population, sind herbizid Stoffwechsel Zeitverlauf Analysen gleichmäßige und reproduzierbare aufgru...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Messraten von Herbizid Metabolism in DICOT Weeds mit einem herausgeschnittenen Blatt Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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