Name: measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay at JoVE.com

We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. 식물 재료, 성장 조건, 그리고 식물 복제 참고 : 세 waterhemp 집단이 연구 조사 하였다 : MCR (아담스 카운티, 일리노이에서), ACR, 및 WCS (맥린 카운티, 일리노이에서) (표 1) (웨인 카운티, 일리노이에서). <ol><li> 수집하여 0.1 g L-1 한천 waterhemp 씨앗 일시 : 발아를 강화하기 위해 적어도 30 일 동안 4 ℃에서 용액을 물. 참고 : 일부 waterhemp 인구가 휴면 있지만,이 단계는 휴면을 극복하고 종자가보다 균일하게 발아 할 수 있도록 도와줍니다. </li><li> 온실에서 화분 매체를 포함하는 12 X 12cm 트레이에 (표 1에서와 같이) 각 waterhemp 인구의 씨앗을 발아. <ol><li> 16/8 시간의 광주 (12) 내에 22분의 28 ° C를 주 / 야간 온도에서 온실 조건을 유지한다. </li><li> 500 μmol m의 최소값을 제공하는 할로겐화 수은 램프로부터의 빛을 온실에서 자연광을 보충 -2 </SUP&gt; 공장 캐노피 수준에서 초 -1 광자 플럭스. </li></ol></li><li> 그들은 80cm 온실에서 3 냄비에 2cm 키가 큰 경우 이식 모종을 등장. </li><li> 1 : 1 : 포팅 믹스의 1 : 1 혼합물 토양 : 이탄 : 모래 모종 4cm 키가 950cm 3를 포함하는 3 냄비에 이식 모종. 각각의 냄비에 서방 비료 과립 5g을 추가하고이 토양 혼합물로 섞는다. </li><li> 혀끝의 지배력을 제거하기 위해 잘라 7cm 키가 큰 식물에서 세 어린 잎을 포함하는 촬영을 혀끝의 분열 조직을 제거합니다. 참고 :이 단계는 각 공장은 복제 할 수있는 충분한 3cm의 겨드랑이 촬영을 증가 할 것을 보장한다. </li><li> 모종 (표 1에서와 같이) 각 waterhemp 인구에서 높이 약 14cm가 소비세 다섯 겨드랑이 촬영 (길이 3cm). 추가 처리시 수분 손실을 줄이기 위해 이러한 겨드랑이 촬영에 잎의 대부분을 제거 할 수 있지만 이식에 추가 성장을 할 수 있도록 두 어린 잎을 유지합니다. <br/&gt; 참고 : 신중하게 처리하고 잎을 제거 할 때 촬영이 손상되지 않도록하려고합니다. 지분 각 공장 레이블. </li><li> 이식 겨드랑이는 발아에 사용 된 것과 같은 매체 포팅 매체에 80cm 3 냄비 (냄비 당 하나의 경종)로 촬영합니다. 포팅 매체는 초기에 포화 성장 챔버에 뿌리를 형성 할 때까지, 다음 뿌리를 설정하기 위해 7 일간 성장 챔버에서 일정한 수분과 장소 냄비를 유지해야한다. 참고 : 식물이 시점에서 매우 민감하고 스트레스를해서는 안된다. <ol><li> 16/8 시간의 광주 (12) 내에 22분의 28 ° C를 주 / 야간 온도에서 성장 챔버 조건을 유지한다. </li><li> 백열등과 형광등의 조합이 성장 챔버에서 광을 제공하는데 사용될 수 있고, 적어도 550 μmol m -2의 식물 캐노피 수준에서 12 초 -1 광자 플럭스를 제공한다. </li></ol></li><li> 950cm 3 냄비에 다시 이식 (포트 당 하나의 경종) C1 : 1 : 포팅 믹스의 1 : 1 혼합물 토양 : 이탄 : 3 ontaining 복제 식물이 4cm 높이있을 때 모래를 다시 온실로 전송, (도 5g 서방 비료 과립을 포함한다). </li><li> 상술 한 바와 같은 방법을 사용하여 식물을 한 번 복제 (즉, 반복 단계는 1.5 내지 1.8, 및 2.1 단계로 진행). 전형적인 시간 코스 연구를 위해, 각 waterhemp 인구에서 최소 6 독립적 인 식물에서 클론을 생성하고 라인 MCR 1-6, ACR 1-6과 WCS 1-6로 기록한다. <ol><li> 실험을 반복하고 적절하게 각 waterhemp 인구 내에서 유전 적 다양성을 표현하기 위해 적어도 6 별개 &quot;부모&quot;클론 라인을 설정합니다. </li><li> 분석 얼마나 많은 시간이 지점에 따라, 시간 코스 연구를 수행하기 위해 각 &quot;부모&quot;클론 라인에서 충분히 서브 클론을 생성합니다. </li></ol></li></ol> 2. 절제 Waterhem과 대사 연구를 실시P 잎 <ol><li> 복제 waterhemp 식물 제초제 대사와 DT (50) 분석을위한 높이 10~12cm이 때 세 번째로 어린 잎 (첨부 잎자루 0.5 CM을 포함 길이 2-3cm)을 절제. </li><li> 각 waterhemp 공장에서 잘라 잎은 잎자루 두 번째 물 속에서 (잎자루의 0.3 cm가 될 수 있도록 보장),이 컷은 1.5 ml의 플라스틱 병 (유리 병 당 하나의 잎) (15)에 종료 놓습니다. 참고 : 물에서 두 번째로 절단 형성과 목부 혈관을 연결에서 공기 방울을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 첫째, 부분적으로 1 시간 동안 0.1 M 트리스 - 염산 (PH 6)의 사전 배양 버퍼 (200 μL)에서 컷 잎자루와 잎 적출 몰입. </li><li> 둘째, 새로운 1.5 ml의 유리 병 0.1 M 트리스 - 염산 (PH 6) 플러스 150 μM [URL- (14) C] 제초제 (200 μL) 배양 버퍼를 포함하는 각 잎을 이동하고, 1 시간 동안 28 ℃에서 배양 잎에 제초제 흡수 할 수 있습니다. 참고 : 모두 14 C-메소 트리 온 및 <s최대&gt; (14) C-primisulfuron 메틸 약 20의 MCI 밀리몰의 특정 활동에서 우리의 연구에 사용되었다 -1. 목부 증산 스트림을 통해 두 확산 및 흡수는 잎 당 흡수 제초제의 양에 기여한다. 주 : 제초제 대사 대사 억제제의 효과는 단계 2.2.1 및 2.2.2 상기 수정에 의해 결정될 수있다. 사전 배양 버퍼에 억제제의 100 μM을 추가 한 다음 제초제와 배양 버퍼로 전송하고 다시 100 μm의 억제제를 추가, 2 시간 동안 품어 보자. 예를 들어, 말라 티온 및 tetcyclacis 식물 15-17 특정 시토크롬 P450 활동을 억제한다. </li><li> 탈 이온수로 절제 잎의 침지 부분을 세척하고 분기 강도 무라 시게과 스쿡 (MS) 염 용액 (500 μL)는 각각 0 시간, 5 시간, 11 시간, 23 시간, 35 시간, 용에 절제 잎을 전송, 시간 코스 대사 연구를위한 성장 챔버. </li></ol></li><li> 휴가를 제거하여 수확수동 배양 적절한 시점에서의 용액은 폴리 프로필렌 튜브 (15 mL) 및 유리 유봉을 사용하여 액체 질소의 각 잎 조직을 분쇄. </li><li> 방사성 표지 제초제와 위와 같은 폴리 프로필렌 튜브 실험실 조직 균질 90 % 아세톤의 7 ml의 각 잎에서의 대사 산물의 압축을 풉니 다. 90 % 아세톤의 추가 7 ml의 조직 균질 린스, 그리고 조직이 철저하게 (보통 2 분) 분쇄 될 때까지 균질화를 계속합니다. 참고 : 90 % 아세톤 식물 조직에서 가장 제초제의 추출에 사용될 수있다. 이 방법은 흡수 된 방사성 표지 화합물의 90 % 이상을 추출 할 수없는 경우에는, 90 % 메탄올, 90 % 아세토 니트릴을 추출 용매로 치환 될 수있다. </li><li> 추가 추출이 발생하는 레이블 90 % 아세톤 추출물 (14 ml의 총)과 상점은 -4 16 시간 동안 C를 허용하는 °. 참고 : 처리 된 잎의 추출 후, 추출 방사선의 양을ioactivity는 처리 잎에 흡수 방사성 표지 화합물의 적어도 98 %가 일반적이다. 절제 잎에 비 추출 방사능 (결합 잔류 물은) 우리의 이전 연구 (12)의 모든 시점에서 0.3 %로 평균,하지만이 금액은 조사 된 사용 제초제와 시점에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 0.5 ㎖의 최종 부피까지 원심 분리를 10 분 동안 5,000 XG에 샘플 및 로타리 증발기로 40 ℃에서 농축 상청액이 얻어진다. 2.0 ml의 플라스틱 튜브에이 볼륨을 전송합니다. </li><li> 식물의 최종 부피는 1.25 ml의 추출 조정하고 다시 원심 분리기를 10,000 XG에 10 분 동안 모든 입자를 제거하기 위해 (볼륨 1, 1) 물 : 아세토 니트릴을 추가합니다. </li><li> (DPM μL -1) 액체 섬광 분광 (LSS) (12)에 의해 각각의 샘플에서 가져온 나누어 총 방사능을 측정하고 양을 정상화 (예를 들어, HPLC 분석을 위해 주입 화합물, 10,00 [14 C 표지]결과를 그래프 0 총 DPM / 샘플 / 실행) 그래서 Y 축 샘플에서 통일 될 것입니다. </li></ol> 절제된 잎에서 제초제 대사 3. HPLC 분석 주 : 다음 RP-HPLC 조건 (12)를 사용하여 부모 제초제 제초제 대사로 총 추출 방사능를 해결합니다. <ol><li> 1ml의 분의 유속으로 18 C 컬럼 (4.6 × 250mm, HPLC 분석 용 5 ㎛의 입자 크기)와 RP-HPLC를 수행 -1 가장 비극성 대한 제초제. 주 : 4 C 또는 C 12 RP-HPLC 컬럼은 또한 대사에서 상위 제초제의 분리를 최적화하기 위해 사용될 수있다. 미리 열 필터 및 / 또는 보호 컬럼은 보호 RP 컬럼의 수명을 연장하는 데 사용될 수있다. <ol><li> 리제, 물에 0.1 % 포름산 (V / V)와 리제 B 100 % HPLC 급 아세토 니트릴 : RP-HPLC에 대해 다음 이동상을 사용합니다. 주 : HPLC 등급 메탄올 또한 엘로서 사용될 수있다uent의 극성 화합물 및 대사 문제를 해결하기 위해 B,하지만 체류 시간도 변경 될 수 있음에 유의하십시오. 참고 : 우리의 연구 (12)에서의 극성 대사에서 메소 또는 primisulfuron 메틸를 해결하는 데 사용되는 용출 프로파일은 다음과 같습니다 1 단계 : B (4 : 1, v / v)로 : B (3 : 2, V / V ) 선형 구배 (12 분) B :에 : (2, V / V 3) : 2 단계, B (3 : 7, v / v)의 선형 구배 (5 분) 3 단계 : B :에 : (7, V / V 3) B : 2 분 선형 그라데이션 (1 9, v / v)로 (19 분의 총을 포함). 주 : 그래디언트 및 등용 매 단계 분해능을 최적화하기 위해 모재의 물성에 기초하여 조절 될 필요가있을 수있다. </li><li> B (4 : 1, v / v)의 선형 구배 (3 분) : 행 (9, V / V 1) B :와, 상기 선형 그라데이션 단계에 따라 B를 (4 : 1, V / v)의 최소 2 분 동안 등용 매 단계 () 다음 추출물 (12)를 주입하기 전에 RP 열을 다시 평형을합니다. </li></ol></li><li> 검색 및 흐름 Scinti과 방사성 동위 원소 표지 화합물을 시각화llation 분석기. 각 샘플의 총 방사능 량의 백분율로 각 샘플에 남아있는 상위 제초제의 양을 녹음 (검출하고 제조자의 지시에 따라 상기 흐름 섬광 분석기로 정량) 시간 중에 각 waterhemp 인구 제초제 대사의 속도를 결정한다. </li></ol> 4. 통계 절차 <ol><li> 완전히 무작위 디자인 (또는 통계 분석을위한 다른 적절한 배열)에서 치료를 정렬합니다. </li><li> 각 실험에 대한 세 가지 생물학적 복제로 구성된 각각의 처리, 두 개의 독립적 인 실험을 수행합니다. 두 개의 독립적 인 실험은 총 여섯 생물 복제를 포함한다. 실험 효과 (α가 = 0.05)가 아닌 심각한 경우, 각각의 독립적 인 실험으로부터의 데이터를 결합 분석. 실험 효과가 중요한 경우, 개별적으로 각 실험 분석. 참고 : 처음 세 생물학적 복제를 포함 전n은 1을 실험과 실험 2에서 향후 3 생물 복제는 각 생물 복제는 (MCR 1-6, ACR 1-6, 및 WCS 1-6) 각 집단에서 파생 된 클론 라인 있도록 별개의 &quot;부모&quot;를 나타내는 각각의 시간 - 물론 분석은 유전자 동일한 식물을 사용합니다. 두 개의 독립적 인 실험은 각 waterhemp 인구에 대한 중간 DT (50)의 유전 적 다양성과 결정의 적절한 표현을 가능하게 총 여섯 생물 복제를 포함한다. </li><li> 비선형 최소 자승 회귀 분석으로 데이터를 분석하고 DT 50 (S)를 추정하기 위해 단순 일차 곡선들을 장착한다. 아래의 방정식 모델을 설명합니다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> 여기서,이 모델 (Y)으로 시간 t에서 나머지 상위 제초제의 비율을 나타내고, μ 나 각 DT 50waterhemp 인구 내가하고 매개 변수 C 0 T = 0 (12)의 부모 제초제 현재의 추정 금액입니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 절제 잎 방법은 옥수수가 15 나뭇잎에 primisulfuron 대사 연구에서 이전에 사용되었지만, 우리의 결과는이 프로토콜은 또한 쌍자엽 잡초 종 12 제초제 신진 대사를 측정하기위한 효과적인 정확하고 재현성이 있음을 입증. 전체 식물 연구에 비해 적출 잎 기술의 가장 큰 장점은 적출 잎은 전체 식물 전위의 출현 후 패턴, 전신 제초제 또는 식물 또는 인구 중 제초제 흡수...

잡초의 제초제 저항은 식품 및 섬유 1, 2의 글로벌 생산에 심각한 위협을 선물한다. 현재 백 이상 잡초 종에 강한 집단과 생물 형의 수천 전 세계적으로 문서화하고 3 연구되고있다. 식물에 제초제 저항성을 부여하는 주요 메커니즘은 제초제 - 단백질 결합 반응 속도 또는 대상 사이트 유전자 2의 증폭에 영향을 미치는 유전 적 변이를 포함하는 제초제 대상 사이트 유전자와 단백질의 변경입니다. 시토크롬 P450 모노 옥 시게나 제 (P450) 또는 글루타치온 S의 -transferase (GST) 효소의 높은 활동을 통해 대사 해독 대상 현장 기반 메커니즘 2에서 여러 가지 방법으로 구분된다 잡초의 제초제 저항성을 부여하는 또 다른 메커니즘입니다. 대사 기반의 저항 (피트니스 처벌 일명) 공장 피트니스 비용은 제초제 저항 메커니즘 정보 발생할 수 있는지 여부에 대한 상당한 파급 효과를 가지고m뿐만 아니라 잡초 개체군 1,2,4에서 교차 또는 다중 제초제 내성을 부여하는 단일 해독 메커니즘 전위에. 일반적으로 식물에 제초제 대사는 세 가지 단계 5로 나눌 수 있습니다. 증가 극성 부분 제초제 해독 5,6로 이어지는, 또는 O- 탈 알킬화 반응 - 단계 I는 방향족 고리 또는 알킬 그룹의 P450 매개 수산화, 또는 N으로 같은 제초제 변환 또는 활성화를 포함한다. 새로 나는 GSTs 감소 글루타티온에 결합에 대한 링크 사이트를 제공 할 수 있습니다 또는 단계 II 5,7에서 UDP에 의존하는 글리코에 의해 포도당 단계에 관능기를 도입했다. 예를 들어, 옥수수의 primisulfuron 메틸의 주요한 초기 대사 산물은 또한 하이드 록시 primisulfuron 글루코 내지 (단계 II)를 대사 후 장기간 저장 또는 상기 대사위한 액포로 이송 될 수 히드 록시 primisulfuron 메틸 8 인 찬성cessing 5,6 (단계 III). Waterhemp (Amaranthus의 tuberculatus)는 미국의 옥수수 생산 (ZEA이 메이), 콩 (글리신 최대), 면화을 (고십 피움 히르 수툼) 방해하기 어려운 제어, 쌍자엽 연간 잡초 종입니다. waterhemp의 유전 적 다양성의 높은 수준은 자웅 이주의 생물학 및 장거리 바람 수분에 의해 촉진되고, 하나의 여성 waterhemp 공장 만 씨앗 9 개까지 생성 할 수 있습니다. 이 씨는 자연스럽게 효과적인 분산 메커니즘 waterhemp을 부여하는, 작고 쉽게 확산됩니다. Waterhemp는 성장시기 (9)에 걸쳐 연속 발아를 표시하고, 그 씨앗은 휴면 몇 년 후 발아 할 수 있습니다. Waterhemp은 경작 할 작물 재배 시스템 (10)에있는 대부분의 잎이 넓은 잡초보다 더 높은 성장률을 가지고 C 4 식물입니다. 또한, 다수의 집단 waterhemp 여러 FAM에 내성제초제 3 ilies. 일리노이 waterhemp (MCR)의 이용의 인구는 4- 히드 록시 phenylpyruvate 시게나 제 (HPPD) 예컨대 메소 트리 온 등 -inhibiting 제초제 (11)뿐만 아니라, 아트라진 및 아세토 락 테이트 신타 제 (ALS)에, 제초제 -inhibiting primisulfuron 메틸을 포함하는 내성 비 대상 현장 기반 메커니즘 (12, 13)로 인해. 와 아트라진에 강한하지만 메소 트리 온에 민감하고, primisulfuron 메틸을 민감 WCS (14) 지정된 waterhemp 인구 (때문에 ALS 유전자의 돌연변이에) primisulfuron 메틸 내성 ACR (14) 지정 waterhemp의 다른 인구, 메소 트리 온 및 아트라진가 우리의 이전 연구 12, 현재 실험 MCR와 비교 하였다 (표 1에 요약 하였다). 초기 연구는 MCR에, HPPD 유전자 서열 또는 발현 수준의 변화, 또는 감소 메소 트리 온의 흡수를 감지하지 않았다인구 때 메소 트리 온 민감한 인구 (12)와 비교. 그러나, 전체 식물 대사 연구는 11, 12 메소 이전 표현형의 반응과 상관 ACR과 WCS에 비해 MCR에서 부모 메소 트리 온 제초제의 상당히 낮은 수준을 보여 주었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp 인구 </td><td> 약어 </td><td> 메소에 표현형 </td><td> 메소 트리 온 저항 메커니즘 </td><td> Primisulfuron에 표현형 </td><td> Primisulfuron 저항 메커니즘 </td></tr><tr><td> 맥린 카운티 저항하는 </td><td> MCR </td><td> 저항하는 </td><td> 대사 * </td><td> 저항하는 </td><td> 대사 </td></tr><tr><td> 아담스 카운티 저항하는 </td><td> ACR </td><td> Sensit필자 </td><td> - </td><td> 저항하는 </td><td> ALS (14)에 대상 사이트 돌연변이 </td></tr><tr><td> 웨인 카운티에 민감한 </td><td> WCS </td><td> 민감한 </td><td> - </td><td> 민감한 </td><td> - </td></tr></tbody></table> * 향상된 대사 이외의 비 표적 사이트 저항 메커니즘은 또한 MCR 인구 (12) 메소 트리 온 저항을 부여 할 수있다. 표 1 : 본 연구에 사용 일리노이 waterhemp 개체군의 설명. 그대로 waterhemp 모종의 제초제 대사의 비율을 결정하는 것에 더하여, 다른 실험적 방법은 개발되었으며 절제 waterhemp 리프 세이 (12)뿐만 아니라 다양한 P450 억제제 (예 tetcyclacis 및 말라 티온)를 사용하여 대사를 조사하기 이전 연구에서 사용. 이 방법은 previ에서 waterhemp을 위해 특별히 적응했다적출 된 잎의 분석이 아직 쌍자엽 식물에 제초제 대사 연구를 수행보고되지 않은 때문에 절제 옥수수에 primisulfuron 메틸 대사의 OU를 조사, 15 나뭇잎. organophophosate 살충제 말라 티온 자주 생체에 사용 된 체외 제초제 대사 연구에서 P450의 참여 (16)를 나타냅니다. 예를 들어, 관용과 옥수수에 메소 트리 온의 빠른 대사는 말라 티온은 메소 트리 온 (17) 옥수수 감도를 증가 할 때 확인되었다 P450 - 촉매 링 수산화,에 기인한다. 마찬가지로, 말라 티온은 절제 옥수수에서 루게릭 병 억제제 primisulfuron 메틸 15 잎의 신진 대사를 억제 하였다. 식물 조직, 출현 후 제초제의 대사를 평가할 때 적출 리프 기술의 주요 이점은, 생성 된 데이터는 전체 플랜트 전위 패턴 무관하다는 것이다, 중요한 요인을 고려한다. 따라서,이 방법은 정량 할 수 있으며질적 대사는 단일 처리 리프 (12)에 초점을 분석한다. 식물 클로닝 전략은 적출 리프 프로토콜과 함께, 이전에 대사 과정 (12)을 실시 waterhemp에 이용 하였다. 때문에 waterhemp (별도의 남성과 여성의 식물)과 자웅 이주 Amaranthus 종 (9) 내에서 유전 적 다양성의 큰 정도의 이종간 교배 특성으로,이 프로토콜은 유 전적으로 동일한 waterhemp 모종 시간 코스 실험에서 분석 하였다 것을 보장. 이 문서는 쌍자엽 잡초 (waterhemp)에서 제초제 신진 대사의 속도를 측정하기위한 절제 잎 방법의 유틸리티를 보여줍니다. 부모 제초제의 양 (흡수 된 제초제의 50 %가 저하하는 시간을 추정하기 위해 단순 일차 곡선 적합 하였다 비선형 최소 제곱 회귀 분석에 의해 각각의 시간 점 (도 1)에서 측정 한 한 나머지 DT 50). 대리인역상 고속 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)에서 크로마토 내성 ALS-및 시간 과정 연구 중에 부모 제초제 및 극성 대사 산물 (들)의 병용 형성의 소실을 나타내는 과민 waterhemp 인구 (그림 표시되는 2). 우리 문서의 포커스가 균일 링 - 표지 (URL- 14 C) 제초제를 사용하여 설명하고 쌍자엽 식물 제초제 대사의 정확하고 재현 가능한 요금을 결정하기위한 식물 클로닝 방법과 조합 적출 리프 분석의 유용성을 입증하는 것이다 자신의 전체 식물의 반응에 차이가 세 waterhemp 인구는 HPPD-하고 루게릭 병 억제 제초제 (표 1).

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>for pre-germinating seeds</td></tr><tr><td>Potting medium</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>49040233</td><td>for plant growth</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&amp;nbsp;</td><td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td><td>slow-release fertilizer</td></tr><tr><td>Growth chamber E15</td><td>Controlled Environments Limited</td><td>20207</td><td>plant culturing</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>buffer for excised leaves</td></tr><tr><td>HCl (concentrated)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144500</td><td>adjust pH of buffer</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) salts&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>incubation of excised leaves</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>leaf washes after incubation</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>plant extractions</td></tr><tr><td>Acetonitrile (HPLC grade)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MKH07610</td><td>HPLC mobile phase</td></tr><tr><td>Formic acid&amp;nbsp;</td><td>Mallinckrodt Analytical</td><td>MK259205</td><td>acidify mobile phase pH</td></tr><tr><td>Micro-centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>1.5 or 2.0 ml tubes</td></tr><tr><td>Centrifuge (temperature controlled)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>15 or 50 ml tubes</td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tube</td><td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, sterile</td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;Uuml;CHI</td><td>R200</td><td>concentrate plant samples</td></tr><tr><td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>quantify &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>High-performance liquid chromatography</td><td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>resolve herbicide metabolites</td></tr><tr><td>Flow scintillation analyzer&amp;nbsp;</td><td>LabLogic System</td><td>1103303</td><td>for HPLC analysis of &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Hypersil Gold C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; column&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Scientific</td><td>03-050-522&amp;nbsp;</td><td>reversed phase</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M cocktail</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>for Flow-scintillation analyzer</td></tr><tr><td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>for LSS; biodegradable</td></tr><tr><td>Laboratory homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>CH-6010&amp;nbsp;</td><td>homogenize leaf samples</td></tr></tbody></table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

메소 트리 온 신진 대사의 속도에 큰 차이는 WCS 또는 ACR과 MCR (그림 1) 중 하나를 사이에 검출되었다. 각각의 시점에서, MCR은 더 빠른 속도로 이전의 전체 공장의 표현형 응답 (11)과 상관이 메소 트리 온 민감한 인구, WCS 및 ACR보다 메소 트리 온을 물질 대사로 변화했다. 각 집단에서 단일 부모의 공장에서 충분히 식물을 복제하여, 제초제 대사 시간 코스 분석에 의한마다 코스 <s...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

절제 잎 분석과 쌍자엽 잡초의 제초제 대사의 요금을 측정

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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Research

JoVE Journal

Environment

11.9K 조회수.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

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Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

다른 잡초 종의 강력한 제초제 저항 테스트를위한 프로토콜

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

연구

환경과학

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing plant metabolites because it provides molecular weights with high sensitivity and specificity. Leaf spray MS is an ambient ionization technique where plant tissue is used for direct chemical analysis via electrospray, eliminating chromatography from the process. This approach to sampling metabolites allows for a wide range of chemical classes to be detected simultaneously from intact plant tissues, minimizing the amount of sample preparation needed. When used with a high-resolution, accurate mass MS, leaf spray MS facilitates the rapid detection of metabolites of interest. It is also possible to collect tandem mass fragmentation data with this technique to facilitate a compound identification. The combination of accurate mass measurements and fragmentation is beneficial in confirming compound identities. The leaf spray MS technique requires only minor modifications to a nanospray ionization source and is a useful tool to further expand the capabilities of a mass spectrometer. Here, fresh leaf tissue from Sceletium tortuosum (Aizoaceae), a traditional medicinal plant from South Africa, is analyzed; numerous mesembrine alkaloids are detected with leaf spray MS.

Leaf spray mass spectrometry is a direct chemical analysis technique that minimizes the sample preparation and eliminates chromatography, allowing for the rapid detection of small molecules from plant tissues.

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

생화학

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

생체공학

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form loose callus on Murashige and Skoog (MS) basal media with the plant hormones 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, 1.0 mg L-1) and kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus formed after 3 or 4 rounds of subculturing, each lasting 28 days. Loose callus (about 3 g) was then inoculated into B5 liquid media containing the same plant hormones and was cultured in a shaking incubator (120 rpm) in the dark at 25 &#177; 1 &#176;C. After 3&#8722;4 subcultures, a cell suspension derived from tea leaf was established at a subculture ratio ranging between 1:1 and 1:2 (suspension mother liquid: fresh medium). Using this platform, six insecticides (5 &#181;g mL-1 each thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, and omethoate) were added into the tea leaf-derived cell suspension culture. The metabolism of the insecticides was tracked using liquid chromatography and gas chromatography. To validate the usefulness of the tea cell suspension culture, the metabolites of thiamethoxan and dimethoate present in treated cell cultures and intact plants were compared using mass spectrometry. In treated tea cell cultures, seven metabolites of thiamethoxan and two metabolites of dimethoate were found, while in treated intact plants, only two metabolites of thiamethoxam and one of dimethoate were found. The use of a cell suspension simplified the metabolic analysis compared to the use of intact tea plants, especially for a difficult matrix such as tea.

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

This work presents a protocol for establishing a cell suspension culture derived from tea (Camellia sinensis L.) leaves that can be used to study the metabolism of external compounds that can be taken up by the whole plant, such as insecticides.

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential human exposure through the consumption of pollutant-accumulated foods. Elucidating the uptake and metabolism of xenobiotics in crops is essential for the assessment of dietary exposure risk in humans. However, for such experiments, the use of intact plants requires long-term experiments and complex sample preparation protocols that can be affected by various factors. Plant callus cultures combined with high-resolution mass spectrometry (HRMS) may provide a solution for the accurate and time-saving identification of metabolites of xenobiotics in plants, as it can avoid interference from the microbial or fungal microenvironment, shorten the treatment duration, and simplify the matrix effect of intact plants. 2,4-dibromophenol, a typical flame retardant and endocrine disrupter, was chosen as the model substance due to its widespread occurrence in soil and its uptake potential by plants. Herein, plant callus was generated from asepsis seeds and exposed to sterile 2,4-dibromophenol-containing culture medium. The results showed that eight metabolites of 2,4-dibromophenol were identified in the plant callus tissues after 120 h of incubation. This indicates that 2,4-dibromophenol was rapidly metabolized in&#160;the plant callus tissues. Thus, the plant callus culture platform is an effective method to evaluate the uptake and metabolism of xenobiotics in plants.

The present protocol describes a simple and efficient method for the identification of 2,4-dibromophenol metabolites in plants.

식물에서 2,4-dibromophenol의 대사 해명

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

<meta charset="utf8"></head><body>식물에서 Triazole 살충제의 통합 대사 산물 세포 독성 추정

Assessing Cytotoxicity of Metabolites of Typical Triazole Pesticides in Plants

Various organic pollutants have been released into the environment because of anthropogenic activities. These pollutants can be taken up by crop plants, causing potential threats to the ecosystem and human health throughout the food chain. The biotransformation of pollutants in plants generates a number of metabolites that may be more toxic than their parent compounds, implying that the metabolites should be taken into account during the toxicity assessment. However, the metabolites of pollutants in plants are extremely complex, making it difficult to comprehensively obtain the toxicological information of all metabolites. This study proposed a strategy to assess the integral cytotoxicity of pollutant metabolites in plants by treating them as a whole during toxicological tests. Triazole pesticides, a class of broad-spectrum fungicides, have been widely applied in agricultural production. Their residue pollution in farmland has drawn increasing attention. Hence, four triazole pesticides, including flusilazole, diniconazole, tebuconazole, and propiconazole, were selected as the tested pollutants. The metabolites were generated by the treatment of carrot callus with tested triazole pesticides. After treatment of 72 h, the metabolites of pesticides in carrot callus were extracted, followed by toxicological tests using the Caco-2 cell line. The results showed that the metabolites of tested pesticides in carrot callus did not significantly inhibit the viability of Caco-2 cells (P>0.05), demonstrating no cytotoxicity of pesticide metabolites. This proposed method opens a new avenue to assess the cytotoxicity of pollutant metabolites in plants, which is expected to provide valuable data for precise toxicity assessment.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 식물의 트리아졸 살충제에 대한 포괄적인 대사산물 세포독성 평가를 위한 새롭고 효율적인 방법

The protocol describes a new method to assess the integral cytotoxicity of metabolites of triazole pesticides in plants.

식물에서 전형적인 Triazole 살충제의 대사 산물의 세포 독성 평가

Various organic pollutants have been released into the environment because of anthropogenic activities. These pollutants can be taken up by crop plants, ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

절제 잎 분석과 쌍자엽 잡초의 제초제 대사의 요금을 측정

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사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

식물에서 2,4-dibromophenol의 대사 해명

식물에서 전형적인 Triazole 살충제의 대사 산물의 세포 독성 평가

식물에서 전형적인 Triazole 살충제의 대사 산물의 세포 독성 평가

식물에서 전형적인 Triazole 살충제의 대사 산물의 세포 독성 평가

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석