We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1. צמח חומר, תנאי גידול, וגטטיבי שיבוט שים לב: שלוש אוכלוסיות waterhemp נחקרו במחקר זה: MCR (ממחוז מקלין, IL), ACR (ממחוז אדאמס, IL), וWCS (ממחוז ויין, IL) (טבלת 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולהשעות זרעי waterhemp באגר 0.1 גרם -1 L: פתרון מים ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 ימים כדי לשפר את הנביטה. הערה: אוכלוסיות waterhemp חלקם רדומות, אך צעד זה עוזר להתגבר תרדמת ולעשות זרע לנבוט יותר אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנבוט זרעים של כל אוכלוסיית waterhemp (כמו בטבלה 1) ב -12 x 12 סנטימטר המכילים מגשים בינוני שתילה בחממה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תנאי חממה בטמפרטורות 28/22 יום / לילה מעלות צלזיוס בתוך photoperiod 16/8 שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספת אור טבעי בחממה עם אור ממנורות הליד הכספית לספק מינימום של 500 מ &#39;μmol -2 </sup&gt; שטף שניות -1 פוטון ברמת החופה צמח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלה צמחה שתילים כשהם 2 ס&quot;מ לסנטימטר 80 3 סירים בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילי השתלה לתוך 950 סנטימטר 3 סירים המכילים 3: תערובת 1 של תערובת שתילה:: 1: 1 אדמה: כבול: חול כאשר שתילי 4 ס&quot;מ. הוסף 5 גרם של גרגרי דשן בשחרור איטי לכל סיר ולערבב עם תערובת אדמה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך ולהסיר לירות meristem הפסגה מכיל שלושה עלים הצעירים מצמחים גבוהים 7 סנטימטר לחסל את הדומיננטיות הפסגה. הערה: צעד זה מבטיח כי כל צמח יגדל מספיק יורה 3 בבית השחי סנטימטר לשבט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמישה יורה הבלו בבית השחי (3 ס&quot;מ אורך) כאשר שתילים הם כ -14 ס&quot;מ מכל אוכלוסיית waterhemp (כמו בטבלה 1). הסר את רוב העלים על יורה בבית השחי אלה כדי להקטין אובדן מים על טיפול נוסף, אך נשמר שני עלים הצעירים, כדי לאפשר צמיחה נוספת על השתלה. <br/&gt; הערה: ידית בזהירות ולנסות לא לפגוע ביורה בעת הסרת העלים. תווית כל צמח עם כף המאזניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בית השחי השתלות יורה ל80 סנטימטר 3 סירים (שתיל אחד לכל סיר) לתוך מדיום שתילה, שהוא אותו בינוני המשמש לנביטה. בינוני שתילה צריך להיות רווי בתחילה עד צורת שורשים בתא הצמיחה, אז לשמור על סירים קבועים לחות ומקום בתא הצמיחה למשך 7 ימים להקים שורשים. הערה: הצמחים רגישים מאוד בשלב זה ולא צריך להיות לחוצים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תנאים קאמריים צמיחה בטמפרטורות 28/22 יום / לילה מעלות צלזיוס בתוך photoperiod 16/8 שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב של נורות ליבון והניאון יכול לשמש כדי לספק אור בתא הצמיחה וצריך לספק לפחות 550 מטר μmol -2 שניות -1 שטף פוטונים ברמת החופה צמח 12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג השתלות שוב לתוך 950 סנטימטר 3 סירים (שתיל אחד לכל סיר)ontaining 3: תערובת 1 של תערובת שתילה:: 1: 1 אדמה: כבול: חול (כולל גם גרגרי דשן בשחרור איטי 5 ז) כאשר צמחים משובטים הם 4 ס&quot;מ, ולאחר מכן להעביר חזרה לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את הצמחים בפעם שנייה על ידי שימוש באותה השיטה שתוארה לעיל (כלומר, חזור על שלבים 1.5-1.8, ולאחר מכן המשיכו לשלב 2.1). למחקר בזמן קורס טיפוסי, ליצור שיבוטים מלפחות שישה צמחים עצמאיים מכל אוכלוסיית waterhemp ולהקליט אותם כקווי MCR 1-6, 1-6 ACR וWCS 1-6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים לפחות שישה קווים משובטים &quot;הורה&quot; ברורים כדי לחזור על הניסוי ומספק מייצג שונות גנטיות בתוך כל אוכלוסיית waterhemp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי כמה זמן נקודות ינותח, לייצר מספיק תת-שיבוטים מכל שורה &quot;הורה&quot; משובט לערוך מחקר בזמן קורס. </li></ol></li></ol> 2. מנהלת מחקר מטבוליזם עם נכרת Waterhemעלים עמ &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו העלים שלישיים-הצעירים (2 עד 3 ס&quot;מ אורך; כוללים 0.5 סנטימטר של פטוטרת המצורפת) כאשר צמחי waterhemp משובטים הם 10 עד 12 ס&quot;מ לחילוף חומרי קוטלי עשבים וDT 50 ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פטוטרות עלים גזור מכל צמח waterhemp פעם שנייה (0.3 סנטימטרים להבטיח כי של הפטוטרת נשאר) מתחת למים, ומניח את הקיצוץ אלה מסתיים לתוך 1.5 מיליליטר בקבוקוני פלסטיק (עלה אחד בכל בקבוקון) 15. הערה: חיתוך בפעם שנייה מתחת למים מונע בועות אוויר מיצירה וחיבור כלי עצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, באופן חלקי לטבול עלים ניכרים עם פטוטרת חתך חיץ מראש דגירה (200 μl) של 0.1 מ &#39;טריס-HCl (pH 6) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנית, להעביר כל עלה ל1.5 חדשים מיליליטר בקבוקון המכיל מאגר דגירה (200 μl) של 0.1 מ &#39;טריס-HCl (pH 6) בתוספת 150 מיקרומטר [URL- 14 C] קוטל עשבים, ולדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ל לאפשר לקליטת קוטל עשבים לעלים. הערה: שני 14 C-mesotrione ו <sעד&gt; 14 C-primisulfuron-מתיל שימש במחקרים שלנו בפעילות ספציפית של כ -20 mmol MCI -1. דיפוזיה שני וספיגים דרך זרם דיות עצה לתרום לסכום של קוטל עשבים נלקח לעלה. הערה: ההשפעה של מעכבי חילוף חומרים בחילוף חומרי קוטלי עשבים יכולה להיקבע על ידי שינוי 2.2.1 צעדים ו2.2.2 לעיל. להוסיף של המעכב למאגר מראש הדגירה 100 מיקרומטר ולתת דגירה עבור שעה 2, ולאחר מכן להעביר למאגר דגירה עם קוטל עשבים ושוב להוסיף 100 מעכב מיקרומטר. לדוגמא, מלתיון וtetcyclacis לעכב פעילות ציטוכרום P450 מסוימת בצמחי 15-17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלק השקוע של עלים נכרת עם מים ללא יונים ולהעביר עלים נכרת לרבע-כוח Murashige וSkoog פתרון (MS) מלחים (500 μl) לשעה 0, 5 שעות, 11 שעות, 23 שעות, או 35 שעות, בהתאמה, בתא הצמיחה למחקר חילוף חומרים בזמן קורס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר על ידי הסרת חופשהים מפתרון דגירה בנקודת הזמן המתאימה וידני לטחון כל רקמת עלה בחנקן נוזלי באמצעות צינור פוליפרופילן (15 מיליליטר) ועלי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ קוטל עשבים רדיואקטיבי ומטבוליטים שלו מכל עלה עם 7 מיליליטר של אצטון 90% עם homogenizer רקמות מעבדה באותו הצינור פוליפרופילן כאמור לעיל. יש לשטוף homogenizer רקמות עם 7 מיליליטר נוסף של אצטון 90%, ולהמשיך homogenize עד רקמה כתושה (בדרך כלל על 2 דקות) ביסודיות. הערה: אצטון 90% יכול לשמש להפקת רוב קוטלי עשבים מרקמות צמח. עם זאת, אם בשיטה זו היא מסוגלת לחלץ יותר מ -90% מתרכובות רדיואקטיבי נספגו, אז מתנול 90% או 90% אצטוניטריל ניתן להחליף כממס החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמציות לייבל 90% אצטון (14 מיליליטר סה&quot;כ) ולאחסן ב -4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות כדי לאפשר ללהתרחש חילוץ נוסף. הערה: לאחר מיצוי זה של עלים שטופלו, הסכום של רד הנשלףioactivity הוא בדרך כלל לפחות 98% של תרכובות רדיואקטיבי נקלטו על ידי העלה טופל. רדיואקטיביות ללא נשלפת (שאריות מחויבות) בעלים נכרת בממוצע רק 0.3% בכל נקודות הזמן במחקר הקודם שלנו 12, אבל סכום זה יכול להשתנות בהתאם לקוטל העשבים המשמשים ונקודת זמן שנבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות XG 5000 עבור 10 דקות וsupernatants להתרכז ב 40 ° C עם מאייד סיבובי עד נפח סופי של 0.5 מיליליטר מתקבלות. העבר את הנפח זה לצינור פלסטיק 2.0 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אצטוניטריל: מים (1: 1, לפי נפח) כדי להתאים את הנפח הסופי של תמציות הצמחים לרמה של 1.25 מיליליטר מחדש צנטריפוגות ב 10,000 XG במשך 10 דקות כדי להסיר כל חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד רדיואקטיביות כוללת בaliquot נלקח מכל מדגם (DPM μl -1) על ידי ספקטרוסקופיה נצנץ הנוזלית (LSS) 12 ולנרמל סכומים [14 C כותרת] תרכובות מוזרקות לניתוח HPLC (לדוגמא, 10,000 DPM / מדגם / ריצה כוללת) כך y-צירים יהיו אחידות בין דגימות כאשר גרפים תוצאות. </li></ol> 3. ניתוח HPLC של קוטל העשבים מטבוליזם בעלים נכרת הערה: לפתור רדיואקטיביות לחילוץ כוללת למטבוליטים קוטל עשבים הורה ועשבים באמצעות תנאי RP-HPLC הבא 12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RP-HPLC עם עמודת C 18 (4.6 x 250 מ&quot;מ, 5 מיקרומטר גודל חלקיקים לHPLC אנליטי) בקצב זרימה של 1 דקות מיליליטר -1 עבור רוב קוטלי עשבים הלא-קוטביים. הערה: גם טורי C 4 או 12 C-RP HPLC ניתן להשתמש כדי לייעל את ההפרדה של קוטל העשבים ההורה מהמטבוליטים שלה. גם מסנן מראש טור ו / או עמודת שומר ניתן להשתמש כדי להגן ולהאריך את חייו של טור RP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשלב הנייד הבא לRP-HPLC: eluent, חומצה פורמית 0.1% (V / V) במים, ו- 100% אצטוניטריל HPLC הכיתה eluent B. הערה: גם מתנול HPLC הכיתה יכול לשמש כאלהשוטפת B לפתרון תרכובות ומטבוליטים קוטביות יותר, אבל להיות מודע לכך פעמים שמירה עשויות גם לשנות. הערה: פרופיל elution משמש כדי לפתור mesotrione או primisulfuron-מתיל ממטבוליטים הקוטביים שלהם במחקר שלנו היא 12: שלב 1,: B (4: 1, נ / V) ל: B (3: 2, V / V ) בשיפוע ליניארית (12 דקות); שלב 2,: B (3: 2, נ / V) ל: B (3: 7, נ / V) בשיפוע ליניארית (5 דקות); שלב 3,: B (3: 7, נ / V) ל: B (1: 9, נ / V) בשיפוע ליניארית 2 דקות (כולל סך של 19 דקות). הערה: מילויים וצעדי isocratic ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים המבוססים על התכונות הפיסיקליות של חומר ההורה על מנת לייעל את הרזולוציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו את השלבים שלעיל ליניארי שיפוע עם: B (1: 9, נ / V) ל: B (4: 1, נ / V) בשיפוע ליניארית (3 דקות) ו: B (4: 1, נ &#39; צעד isocratic (לפחות 2 דקות / V)) מחדש לאזן את עמודת RP לפני הזרקת התמצית הבאה 12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ולדמיין תרכובות radiolabeled עם Scinti זרימהllation Analyzer. רשום את כמות העשבים הורה שנותרו בכל דגימה כאחוז מסך רדיואקטיביות בכל דגימה (זוהה ולכמת ידי זרימת נצנץ מנתח על פי הוראות היצרן) כדי לקבוע שיעורים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בכל אוכלוסיית waterhemp במהלך הזמן. </li></ol> 4. נהלים סטטיסטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארגן טיפולים בעיצוב אקראי לחלוטין (או הסדר מתאים אחר לניתוח סטטיסטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שני ניסויים בלתי תלויים עם כל טיפול, מורכב משלושה משכפל ביולוגי עבור כל ניסוי. שני ניסויים בלתי תלויים כוללים שישה משכפל ביולוגי בסך הכל. במידה והשפעת הניסוי היא לא משמעותית (α = 0.05), לשלב ולנתח נתונים מכל ניסוי עצמאי. במידה והשפעת הניסוי היא משמעותית, ולאחר מכן לנתח כל ניסוי בנפרד. הערה: כולל שלושה משכפל הביולוגי הראשון שn ניסוי 1 ושלושה משכפל הביולוגי הבא בניסוי 2. כל לשכפל ביולוגי מייצג &quot;הורה&quot; ברור קו משובט נגזר מכל אוכלוסייה (1-6 MCR, ACR 1-6, וWCS 1-6), כך שכל גוזלים זמן ניתוח כמובן מנצל צמחים גנטי זהים. שני ניסויים בלתי תלויים כוללים שישה משכפל ביולוגי בסך הכל, המאפשר לייצוג הולם של השתנות ונחישות גנטיות של חציון 50 DT לכל אוכלוסיית waterhemp. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים עם ניתוח רגרסיה ריבועים לפחות שאינו ליניארי ולהתאים אותם עם עקומה מסדר הראשון פשוט כדי להעריך DT 50 של. המשוואה הבאה מתארת ​​את המודל: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבו בy מודל זה מייצג את אחוז קוטל העשבים ההורה שנותרו בזמן t, μ i היא DT 50 לכלהאוכלוסייה אני, והפרמטר C waterhemp 0 הוא הסכום המשוער של הווה קוטל עשבים הורה בזמן t = 0 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Yu, Q., Powles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism-based+herbicide+resistance+and+cross-resistance+in+crop+weeds:+A+threat+to+herbicide+sustainability+and+global+crop+production.">Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production.</a> Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).</li><li>Powles, S. B., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+in+action:+plants+resistant+to+herbicides.">Evolution in action: plants resistant to herbicides.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).</li><li>Heap, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+perspective+of+herbicide-resistant+weeds.">Global perspective of herbicide-resistant weeds.</a> Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).</li><li>D&#233;lye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-target-site-based+resistance+should+be+the+centre+of+attention+for+herbicide+resistance+research:+Alopecurus+myosuroides+as+an+illustration.">Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration.</a> Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).</li><li>Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+enzymes+for+a+new+job.+Herbicide+detoxification+in+plants.">Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants.</a> Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).</li><li>Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+without+intoxication:+herbicide+safeners+activate+plant+defense+gene+expression.">Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression.</a> Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).</li><li>Siminszky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cytochrome+P450-mediated+herbicide+metabolism.">Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism.</a> Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).</li><li>Fonn&#233;-Pfister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxylation+of+primisulfuron+by+an+inducible+cytochrome+P450-dependent+monooxygenase+system+from+maize.">Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).</li><li>Steckel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dioecious+Amaranthus+spp.:+here+to+stay.">The dioecious Amaranthus spp.: here to stay.</a> Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).</li><li>Horak, M. J., Loughin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+analysis+of+four+Amaranthus+species.">Growth analysis of four Amaranthus species.</a> Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).</li><li>Hausman, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+HPPD-inhibiting+herbicides+in+a+population+of+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus)+from+Illinois,+United+States.">Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States.</a> Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).</li><li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+detoxi&#64257;cation+mechanisms+confer+resistance+to+mesotrione+and+atrazine+in+a+population+of+waterhemp.">Distinct detoxi&#64257;cation mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp.</a> Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-target-site+resistance+to+ALS+inhibitors+in+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus).">Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus).</a> Weed Science. in press, (2015).</li><li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterhemp+(Amaranthus+tuberculatus)+biotype+with+multiple+resistance+across+three+herbicide+sites+of+action.">A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action.</a> Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).</li><li>Kreuz, K., Fonn&#233;-Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbicide-insecticide+interaction+in+maize:+malathion+inhibits+cytochrome+P450-dependent+primisulfuron+metabolism.">Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).</li><li>Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. , 247-322 (2005).</li><li>Hawkes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesotrione:+mechanism+of+herbicidal+activity+and+selectivity+in+corn.">Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn.</a> Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference &#8211; Weeds. 2, 563-568 (2001).</li><li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+herbicide+responses+among+Illinois+waterhemp+(Amaranthus+rudis+and+A.+tuberculatus)+populations.">Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations.</a> Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).</li><li>Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+resistance+across+glufosinate,+glyphosate,+paraquat+and+ACCase-inhibiting+herbicides+in+an+Eleusine+indica+population.">Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.</a> Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).</li><li>Iwakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+CYP81A12+and+CYP81A21+are+associated+with+resistance+to+two+acetolactate+synthase+inhibitors+in+Echinochloa+phyllopogon.">Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon.</a> Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה נכרת העלים המתוארים במסמך זה נעשתה שימוש בעבר במחקר חילוף החומרים primisulfuron בתירס משאיר 15, אבל התוצאות שלנו מראות כי בפרוטוקול זה הוא גם יעיל, מדויק, ושחזור למדידת חילוף חומרים קוטלי עשבים במיני עשבי dicot 12. יתרון עיקרי של טכניקת העלה נכרתה בהשוואה למחק?...

התנגדות קוטל עשבים בעשבים מהווה איום רציני לייצור העולמי של 1,2 מזון והסיבים. נכון לעכשיו, אלפי אוכלוסיות וbiotypes עמידות מלמעלה ממאה מיני עשבים בעולם תועדו ולמד 3. מנגנון עיקרי שמקנה עמידות קוטל עשבים בצמחים הוא השינוי של גני קוטל עשבים יעד אתר וחלבונים, כוללים מוטציות גנטיות המשפיעות על קינטיקה מחייבת קוטל עשבים-חלבון או הגברה של גן מטרת אתר 2. ניקוי רעלים מטבוליים באמצעות פעילות מוגברת של monooxygenase ציטוכרום P450 (P450) או אנזימי -transferase S גלוטתיון (GST) הוא מנגנון אחר שמקנה עמידות קוטל עשבים בעשבים, שהוא נבדל במספר דרכים ממנגנונים מבוססי יעד אתר 2. יש התנגדות מבוססת חילוף חומרים השלכות משמעותיות עבור האם עלויות כושר צמח (aka עונשי כושר) יכולות לנבוע מmechanis קוטל עשבים-ההתנגדותמ &#39;, כמו גם לגבי הפוטנציאל למנגנון ניקוי רעלים יחיד להקנות עמידות צולבת או מרובה-קוטל עשבים באוכלוסיות עשב 1,2,4. בדרך כלל, חילוף חומרים קוטלי עשבים בצמחים יכולים להיות מחולק לשלושה שלבים ברורים 5. שלב I כרוך המרת קוטל עשבים או הפעלה כגון hydroxylation תיווך P450 של טבעות ריחניות או קבוצות אלקיל, או על ידי N - או תגובות dealkylation O-, שהוביל לקוטביות גדלה ועשבים חלקיים גמילה 5,6. חדש הציג קבוצות פונקציונליות בשלב שאני יכול לספק אתרי הצמדה לנטייה לגלוטתיון מופחת על ידי GSTs או לגלוקוז על ידי glycosyltransferases UDP תלוי בשלב II 5,7. לדוגמא, המטבוליט הראשוני העיקרי של primisulfuron-מתיל בתירס הוא הידרוקסי-מתיל-primisulfuron 8, שבו ניתן מטבוליזם נוסף להידרוקסי-primisulfuron-glucoside (Phase II) ולאחר מכן הועבר לvacuole לאחסון לטווח ארוך או חילוף חומרים נוספים פרוcessing 5,6 (Phase III). Waterhemp (tuberculatus Amaranthus) הוא מין קשה לשליטה, dicot שנתי עשב שמעכב את הייצור של תירס (Zea Mays), סויה (מקסימום גליצין), וכותנה (Gossypium hirsutum) בארצות הברית. הרמה הגבוהה של מגוון הגנטי של waterhemp היא הקלה על ידי האבקת רוח הביולוגיה dioecious ומרחקים ארוכים שלה, וצמח waterhemp נקבה אחת יכול לייצר עד מיליון זרעים 9. זרעים אלה הם קטנים ולהתפשט בקלות, אשר באופן טבעי להעניק waterhemp עם מנגנון פיזור יעיל. Waterhemp מציג נביטה רציפה לאורך כל עונת גידול 9, וזרעיו יכולים לנבוט לאחר מספר שנים של תרדמת. Waterhemp הוא צמח C 4 שבעל שיעור צמיחה גבוה מרוב עשבי broadleaf במערכות חיתוך לעיבוד 10. בנוסף, אוכלוסיות waterhemp רבות עמידים בפני Fam מרובהilies של קוטלי עשבים 3. אוכלוסייה של waterhemp (מיועד MCR) מאילינוי היא עמידה ל4-הידרוקסי-phenylpyruvate dioxygenase (HPPD) קוטלי עשבים -inhibiting 11, כגון mesotrione, כמו גם לאטרזין וsynthase acetolactate (ALS) -inhibiting קוטלי עשבים, כולל primisulfuron-מתיל , בשל מנגנונים מבוססים היעד הלא-אתר 12,13. אוכלוסייה שונה של waterhemp המיועדת 14 ACR, שהוא primisulfuron-מתיל-עמיד (עקב מוטציה בגן ALS) ואטרזין עמיד אבל רגיש לmesotrione, ואוכלוסיית waterhemp המיועדת 14 WCS שהוא רגיש לprimisulfuron-מתיל, mesotrione, ואטרזין שמשו בהשוואה לMCR במחקר שלנו לפני 12 וניסויים הנוכחיים (מסוכם בטבלה 1). מחקרים ראשוניים לא לזהות שינויים ברמות רצף גן HPPD או ביטוי, או ספיגת mesotrione מופחתת, בMCRאוכלוסייה בהשוואה לאוכלוסיות mesotrione רגישה 12. עם זאת, מחקרי חילוף חומרים עם כל צמחים הפגינו רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של קוטל העשבים mesotrione ההורה בMCR לעומת ACR וWCS, אשר מתואם עם תגובות פנוטיפי קודמות לmesotrione 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Waterhemp אוכלוסייה </td><td> קיצור </td><td> הפנוטיפ לMesotrione </td><td> מנגנון Mesotrione התנגדות </td><td> הפנוטיפ לPrimisulfuron </td><td> מנגנון Primisulfuron התנגדות </td></tr><tr><td> מקלין קאונטי-עמיד </td><td> MCR </td><td> עמיד </td><td> חילוף חומרים * </td><td> עמיד </td><td> חילוף חומרים </td></tr><tr><td> אדמס קאונטי-עמיד </td><td> ACR </td><td> Sensitאייב </td><td> - </td><td> עמיד </td><td> מוטציה יעד אתר ב -14 ALS </td></tr><tr><td> וויין קאונטי-רגיש </td><td> WCS </td><td> רגיש </td><td> - </td><td> רגיש </td><td> - </td></tr></tbody></table> * מנגנונים ללא יעד אתר התנגדות, מלבד חילוף חומרים משופרים, עשויים גם להעניק התנגדות mesotrione באוכלוסיית MCR 12. טבלת 1: תיאור של אוכלוסיות waterhemp מאילינוי השתמשו במחקר זה. בנוסף לקביעת תעריפים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בשתילי waterhemp שלמים, גישה ניסויית שונה פותחה ומועסק במחקר הקודם שלנו כדי לחקור את חילוף החומרים באמצעות assay נכרת waterhemp עלה 12 כמו גם מעכבי P450 שונים (לדוגמא, tetcyclacis ומלתיון). שיטה זו הותאמה במיוחד עבור waterhemp מpreviחקירת היחידות הארגוניות של חילוף חומרים primisulfuron-מתיל בתירס נכרת משאירה 15, מאז assay העלה נכרת עדיין לא דווח לביצוע מחקר חילוף חומרים קוטלי עשבים במפעל dicot. מלתיון החרקים organophophosate כבר משמש לעתים קרובות לin vivo ובמחקר קוטל עשבים-חילוף חומרים מבחנה כדי לציין את מעורבות P450 16. לדוגמא, סובלנות וחילוף חומרים מהירים של mesotrione בתירס נובעים hydroxylation טבעת זרז-P450, אשר אומת כאשר מלתיון רגישות מוגברת לתירס mesotrione 17. באופן דומה, מלתיון עכבות חילוף חומרים של מעכב primisulfuron-מתיל ALS בתירס נכרת משאיר 15. יתרון עיקרי של טכניקת העלה נכרתה הוא שהנתונים שנוצרו אינם תלויים בדפוסי טרנסלוקציה-שלם צמח, גורם חשוב להביא בחשבון כאשר בוחנים את חילוף החומרים של קוטלי עשבים מערכתיים, postemergence בצמחים. כתוצאה מכך, שיטה זו מאפשרת כמותיים וחילוף חומרים איכותיים מנתחים להתמקד בעלה טופל יחיד 12. אסטרטגית שיבוט וגטטיבי, בשילוב עם פרוטוקול העלה הניכר, נוצלה בעבר בwaterhemp לבצע מחקרי חילוף חומרים 12. בשל אופי outcrossing של waterhemp (זכר נפרד וצמחי נקבה), ומידה רבה של שונות גנטיות בתוך מיני Amaranthus dioecious 9, פרוטוקול זה הבטיח כי שתילי waterhemp גנטי זהים נותחו בניסויים בזמן הקורס. מאמר זה מדגים את התועלת של שיטת העלה נכרת למדידת שיעורים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בעשב dicot (waterhemp). כמות העשבים הורה שנותרה הייתה נחוש בכל נקודת זמן (איור 1) על ידי ניתוח רגרסיה ריבועים לפחות שאינו ליניארי, והייתה בכושר עם עקומה מסדר הראשון פשוט כדי להעריך את הזמן עבור 50% מקוטלי עשבים נקלטו להשפיל ( DT 50). נציגchromatograms מכרומטוגרפיה הפוך-שלב ביצועים גבוהים נוזלית (RP-HPLC) מוצגים לALS עמיד ואוכלוסיות waterhemp -sensitive, המצביעות על היעלמותו של קוטל עשבים הורה והיווצרות נלווית של המטבוליט קוטבי (ים) במהלך מחקר בזמן קורס (איור 2). המוקד של המאמר שלנו הוא לתאר ולהדגים את התועלת של assay העלה נכרת בשילוב עם שיטת שיבוט וגטטיבי לקביעת שיעורים מדויקים ושחזור של חילוף חומרים קוטלי עשבים בצמחי dicot, באמצעות קוטלי עשבים באופן אחיד שכותרתו טבעת (14 URL- C) ב שלוש אוכלוסיות waterhemp שונות בתגובות-הצמח כולם לHPPD- וקוטלי עשבים עיכוב ALS (טבלת 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

הבדלים גדולים בשיעורים של חילוף החומרים mesotrione התגלו בין שני WCS או ACR וMCR (איור 1). בכל נקודת זמן, MCR שחילוף חומרי mesotrione מהירות רב יותר מאשר אוכלוסיות שתי mesotrione רגיש, WCS וACR, אשר בקורלציה עם תגובות פנוטיפי-כל מפעל קודם 11. על ידי שיבוט מספיק צמחי מצמח הורים יחיד...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay at JoVE.com

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

מדידת מחירים של קוטל העשבים מטבוליזם בעשבי Dicot עם Assay נכרת עלה

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

measuring-rates-herbicide-metabolism-dicot-weeds-with-an-excised-leaf

Research

JoVE Journal

Environment

11.9K Views.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Video: Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

מדידת שטפים של חומרים מזינים ומינרליים רעלים בצמחים עם חומרים רדיואקטיביים

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

פרוטוקולים לקוטל עשבים חזקים התנגדות בדיקה במיני עשבים שונים

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

מעבדה ופרוטוקול שדה עבור הערכת גיליון שחיקת המחירים מ- Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to bacteria control the amount that will accumulate in staple food crops. The bioavailability of these metals is dependent on their speciation in solution, but more particularly under anoxic conditions where Hg is methylated to toxic monomethylmercury (MeHg) and Cd persists in the rhizosphere. Whole-cell microbial biosensors give a quantifiable signal when a metal enters the cytosol and therefore are useful tools to assess metal bioavailability. Unfortunately, most biosensing efforts have so far been constrained to oxic environments due to the limited ability of existing reporter proteins to function in the absence of oxygen. In this study, we present our effort to develop and optimize a whole-cell biosensor assay capable of functioning anaerobically that can detect metals under anoxic condition in quasi-real time and within hours. We describe how the biosensor can help assess how chemical variables relevant to the environmental cycling of metals affect their bioavailability. The following protocol includes methods to (1) prepare Hg and Cd standards under anoxic conditions, (2) prepare the biosensor in the absence of oxygen, (3) design and execute an experiment to determine how a series of variable affects Hg or Cd bioavailability, and (4) to quantify and interpret biosensor data. We show the linear ranges of the biosensors and provide examples showing the method's ability to distinguish between metal bioavailability and toxicity by utilizing both metal-inducible and constitutive strains.

Here, we present a protocol to use an anaerobic whole-cell microbial biosensor to evaluate how different environmental variables affect the bioavailability of Hg and Cd to bacteria in anoxic environments.

Assay ביוסנסור אנאירובית איתור כספית, קדמיום

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

הערכת משקעים Denitrification המחירים באמצעות ליבות ו- N2O רחוקים

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

מדידת לצורה ולגודל החלקיקים בוצה מופעל מרותק למיטה בטיפול אגר עם צינור תוכנה קוד פתוח

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

טיפוח של ירוק Microalgae בועה עמודה Photobioreactors ואת וזמינותו עבור ליפידים נייטרלי

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

שערוך אינדקס אזור העלה באמצעות שלוש שיטות נפרדות בדוכנים נשירים טהור

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a non-targeted approach, plant metabolites and xenobiotics of interest are identified and localized in plant tissues to uncover&#160;specific distribution patterns. Then, in silico prediction of potential metabolites (i.e., catabolites and conjugates) from the identified xenobiotics is performed. When a xenobiotic metabolite is located in the tissue, the type of enzyme involved in its alteration by the plant is recorded. These results were used to describe different types of biological reactions occurring in S. alba leaves in response to xenobiotic accumulation in the leaves. The metabolites were predicted in two generations, allowing the documentation of successive biological reactions to transform xenobiotics in the leaf tissues.

Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging

This method uses mass spectrometry imaging (MSI) to understand metabolic processes in S. alba leaves when exposed to xenobiotics. The method allows the spatial localization of compounds of interest and their predicted metabolites within specific, intact tissues.

חקירת חילוף החומרים של קסנוביוטיקה בעלי אלבה סליקס באמצעות הדמיה ספקטרומטרית מסה

The method presented uses mass spectrometry imaging (MSI) to establish the metabolic profile of S. alba leaves when exposed to xenobiotics. Using a ...