Name: measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay at JoVE.com

We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1.植物材料、成長条件、および栄養クローニング注意：三waterhemp集団は、本研究で調査した。MCR（アダムス郡、イリノイ州から）、ACR、およびWCS（マクリーン郡、イリノイ州）から（ 表1）（ウェイン郡、イリノイ州から）。 <ol><li> 0.1グラムのL -1の寒天でwaterhempの種子を収集し、一時停止：発芽を強化するために、少なくとも30日間4℃の水溶液を。注：一部のwaterhemp集団が休止しているが、このステップは休眠を克服し、種子がより均一に発芽するために役立ちます。 </li><li>温室内のポッティング培地を含む12×12センチメートルトレイに（ 表1のように）各waterhemp集団の種子を発芽。 <ol><li> 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で温室条件を維持します。 </li><li> 500マイクロモルmの最小値を提供するためにハロゲン化水銀ランプからの光が温室内で自然光を補足-2 </SUP&gt; 秒 -1プラントキャノピーレベルでの光子束。 </li></ol></li><li>彼らは温室では80 cm 3のポットに2センチメートル背が高いときには、移植苗を浮上しました。 </li><li> 1：1：ポッティングミックスの1：1混合土：ピート：砂の苗を4センチある950センチメートル3を含む3ポットに移植苗。各ポットに徐放性肥料顆粒5gのを追加し、この土壌の混合物と混合。 </li><li>頂芽優勢を排除は7センチの植物からの3つの最も若い葉を含む茎頂分裂組織をカットし、削除します。 注：この手順は、各植物がクローンするのに十分な3センチメートル腋窩の芽を育てることが保証されます。 </li><li>消費税5腋窩の芽（長さ3センチ）苗は、（ 表1のように）各waterhemp集団から約14センチです。さらに取り扱い時に水分の損失を低減するために、これらの腋窩の芽の葉の大部分を削除したが、移植時にさらなる成長を可能にするために2つの最も若い葉を保持しています。 <br/&gt;注：慎重に処理し、葉を削除するときに芽を損傷しないようにしてください。出資して各工場にラベルを付けます。 </li><li>移植腋窩は、発芽のために使用されるのと同じ媒体であるポッティング媒体に80センチメートル3ポット（1ポット当たり1苗）に撮影します。ポッティング媒体は、最初に飽和成長チャンバ内の根が形成されるまで、その根を確立するために、7日間成長チャンバー内の一定の水分と場所ポットを維持する必要があります。 注意：植物はこの時点で非常に敏感であり、強調されるべきではありません。 <ol><li> 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で成長チャンバ条件を維持します。 </li><li>白熱灯や蛍光灯の組み合わせは、成長チャンバ内の光を提供するために使用することができ、少なくとも550マイクロモルのM -2プラントキャノピーレベル12で秒 -1光子束を実現する必要があります。 </li></ol></li><li> 950センチメートル3ポット（1ポット当たり1苗）のCに再び移植1：1：ポッティングミックスの1：1混合土：ピート：3 ontainingクローン化された植物を4センチあるときに砂を戻し、温室に移し、（また、5グラムの徐放性肥料顆粒を含みます）。 </li><li> （ すなわち、1.5から1.8までの手順を繰り返し、その後、2.1に進み）上記と同様の方法を用いて植物をもう一度複製します。典型的な時間経過の研究のために、各waterhemp集団から少なくとも6つの独立した植物からクローンを作製し、ラインMCR 1-6、1-6 ACRおよびWCS 1-6としてそれらを記録します。 <ol><li>実験を繰り返し、十分に各waterhemp集団内の遺伝的多様性を表現するために、少なくとも6つの異なる「親」クローン株を確立します。 </li><li>分析されますどのように多くの時間のポイントに応じて、経時的研究を行うために、各「親」クローン株から十分なサブクローンを生成します。 </li></ol></li></ol> 2.摘出Waterhemで代謝研究を実施p個の葉<ol><li>クローン化されたwaterhempの植物は除草剤の代謝及びDT 50分析のための背の高い10〜12センチメートルである場合には、サード最も若い葉（添付葉柄の0.5cmに含まれる長さ2〜3センチ）を切り出します。 </li><li>水の下で（葉柄0.3 CMが残っていることを保証する）は、第2回ずつwaterhemp植物から葉の葉柄をカットし、これらのカットは1.5ミリリットルにプラスチックバイアル（1バイアルあたり1枚の葉）15を終了置きます。 注意：水中で二時間をカットすると、形成し、木部血管を塞ぐから気泡を防ぐことができます。 <ol><li>まず、部分的に1時間、0.1MのTris-HCl（pHが6）のプレインキュベーション緩衝液（200μL）にカット葉柄で切除した葉を浸します。 </li><li>第二に、0.1 Mトリス塩酸（pHが6）に加えて、150μM[URL-14 C]除草剤のインキュベーション緩衝液（200μl）を含む新しい1.5ミリリットルバイアルに各リーフを移動し、1時間に28℃でインキュベート葉への除草剤の吸収を可能にします。 注：両方の14 C-メソトリオンと<s&gt; 14 C-プリミスルフロンメチル、最大約20 mCiのミリモルの具体的な活動に私たちの研究に使用した-1。拡散と木部蒸散ストリームを介して取り込みの両方が葉ごとに取り上げ除草剤の量に寄与する。 注：除草剤代謝に対する代謝阻害剤の効果は、ステップ2.2.1および2.2.2上記を変更することによって決定することができます。プレインキュベーション緩衝液に阻害剤の、100μMを添加し、2時間インキュベートさせ、その後、除草剤とのインキュベーションバッファに転送して、再度、100μMの阻害剤を追加します。例えば、マラチオンとtetcyclacisは、植物15-17で特定のシトクロムP450活性を阻害します。 </li><li>脱イオン水で切除された葉の浸漬部分を洗浄し、四分の一強ムラシゲ・スクーグ（MS）塩溶液（500μl）をそれぞれ0時間、5時間、11時間、23時間、または35時間、のために切除した葉を転送し、時間経過代謝研究のための成長室インチ</li></ol></li><li>休暇を除去することにより、収穫手動で適切な時点で、インキュベーション溶液からのSとは、ポリプロピレンチューブ（15 mL）およびガラス乳棒を用いて液体窒素中で各葉組織を挽きます。 </li><li>上記と同じポリプロピレンチューブ中の実験室の組織ホモジナイザーで90％のアセトンの7ミリリットルを各葉から放射性標識された除草剤とその代謝物を抽出します。 90％のアセトンをさらに7 mlの組織ホモジナイザーをすすぎ、そして組織が完全に粉砕されるまで均質化を続ける（通常約2分）。注：90％アセトンは、植物組織から、ほとんどの除草剤の抽出のために使用することができます。この方法は、吸収された放射性標識化合物の90％以上を取り出すことができない場合には、その後、90％メタノール、または90％のアセトニトリルを抽出溶媒として置換することができます。 </li><li>発生する追加の抽出を可能にするために、16時間で-4℃のラベル90％のアセトン（合計14ミリリットル）を抽出して保存します。 注：処理された葉のこの抽出後、抽出RADの量ioactivityは、処理した葉に吸収さ放射性標識化合物の少なくとも98％、典型的です。切除した葉の非抽出放射能（バインドされた残基）は、私たちの以前の研究12で全ての時点全体のわずか0.3％で平均が、この量を調べ使用除草剤および時刻に応じて変化することができます。 </li><li>遠心分離は10分間5000×gで試料を0.5 mlの最終容積が得られるまで、ロータリーエバポレーターを用いて40℃、上清を濃縮します。 2.0ミリリットルのプラスチックチューブにこのボリュームを転送します。 </li><li>植物の最終容量が1.25ミリリットルに抽出調整し、再遠心10,000×gで10分間、任意の微粒子を除去するために：（体積で1、1）水：アセトニトリルを追加します。 </li><li> （DPMμL-1）、液体シンチレーション分光法（LSS）12によって、各サンプルから採取したアリコート中の総放射能を測定し、量を正規化する（例えば、HPLC分析のために注入された化合物、10,00 [14 C標識]結果をグラフ時0総DPM /サンプル/ラン）ので、y軸は、サンプル間で均一になります。 </li></ol>切除した葉における除草剤代謝の3 HPLC分析注：以下のRP-HPLC条件12を使用して親除草剤や除草剤の代謝物に総抽出放射能を解決します。 <ol><li> 1ミリリットル分の流速で、C 18カラム （4.6×250ミリメートル、分析用HPLCのための5μmの粒子サイズ）で、RP-HPLCを行い-1ほとんどの非極性除草剤のために。 注：C 4またはC 12 RP-HPLCカラムは、その代謝物から親除草剤の分離を最適化するために使用することができます。プレカラムフィルターおよび/またはガードカラムも保護し、RPカラムの寿命を延ばすために使用されてもよいです。 <ol><li>溶離液A、水中0.1％ギ酸（v / v）であり、溶離液B 100％HPLCグレードのアセトニトリル：RP-HPLCは、以下の移動相を使用してください。 注：HPLCグレードのメタノールはエルとして使用することができuentのより極性の化合物および代謝産物を解決するためのBが、保持時間も変更される可能性があることに注意してください。 注：私たちの研究12での極性代謝物からメソトリオンまたはプリミスルフロンメチルを解決するために使用される溶出プロファイルは、次のとおりです。ステップ1、A：B（4：1、V / V）に：B（3：2、V / V ）の直線勾配（12分）で、ステップ2、A：B（3：2、v / v）にする：B（3：7、v / v）の直線勾配（5分）で、ステップ3、A：B（3：7、v / v）での：B（1：9、v / v）の（19分の合計を含む）、2分間の線形勾配。 注：勾配とアイソクラチックステップは、解像度を最適化するために、母材の物理的特性に基づいて調整する必要があります。 </li><li> B（1：9、v / v）での：直線勾配（3分）であり、A：B（1、V / V 4）：B（4：1、vで上記の線形勾配の手順に従ってください/ v）を少なくとも2分間のイソクラティック段階（）次のエキス12を注入する前にRPカラムを再平衡化します。 </li></ol></li><li>フローシンチで放射性標識化合物を検出し、視覚化しますllationアナライザ。時間経過中に各waterhemp集団における除草剤の代謝の速度を決定するために、（製造業者の説明書に従って、フローシンチレーションアナライザによって検出および定量）各試料中の全放射能の割合として各サンプルに残っている親除草剤の量を記録します。 </li></ol> 4.統計処理<ol><li>完全にランダム化された設計（または統計分析のための他の適切な配置）で治療を配置します。 </li><li>各実験のための3つの生物学的複製物から成る各処置、2つの独立した実験を行います。 2つの独立した実験では、合計で6生物学的複製が含まれています。実験の効果は有意でない（α= 0.05）である場合、それぞれの独立した実験からのデータを組み合わせて解析します。実験の効果が顕著である場合には、個別の実験を分析します。 注：私は最初の3つの生物学的複製物を含みますnは実験1と実験2の次の3つの生物学的複製物はそれぞれの生物学的複製は（MCR 1-6、ACR 1-6、およびWCS 1-6）各集団由来クローン株となるよう明確な「親」を表し、各タイムコー​​スの分析は、遺伝的に同一の植物を利用しています。 2つの独立した実験では、各waterhemp人口の中央値DT 50の遺伝的変異性と決意を十分に表現することが可能合計6生物学的複製が含まれます。 </li><li>非線形最小二乗回帰分析を用いてデータを分析し、DT 50を推定するために、単純な一次曲線でそれらをフィット。以下の式は、モデルについて説明します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li>このモデル yに時刻 tの残りの親除草剤の割合を表し、μiがそれぞれのために、DT 50ですwaterhempの人口は、I、およびパラメータC 0は、T = 0〜12で、親除草剤存在の推定量です。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

本明細書中に記載の切除した葉の方法は、トウモロコシが15を残すにプリミスルフロン代謝の研究で以前に使用されてきたが、我々の結果は、このプロトコルはまた、双子葉雑草種12に除草剤の代謝を測定するための、効果的かつ正確で再現性があることを示しています。全植物の研究と比較して、切除した葉の技術の主な利点は、切除された葉が発芽後の全植物転パターン?...

雑草除草剤抵抗性は食料や繊維1,2のグローバル生産に深刻な脅威を提示します。現在、世界中で百以上の雑草種から耐性個体群と生物型の何千もの文書化され、3を検討されています。植物に除草剤耐性を付与する主要なメカニズムは、ターゲットサイトの遺伝子2の除草剤-タンパク質結合動態または増幅に影響を与える遺伝子変異を含む除草剤の標的部位の遺伝子やタンパク質の変化です。シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450）またはグルタチオン Sトランスフェラーゼ（GST）酵素の上昇活動を介した代謝解毒は、ターゲット・サイトベースのメカニズム2からいくつかの点で異なっているれ、雑草に除草剤耐性を付与する別のメカニズムです。代謝系の抵抗は（フィットネス罰則別名 ）植物の適応度コストは除草剤耐性mechanisから生じ得るかどうかに大きな影響を持っていますメートルだけでなく、雑草集団1,2,4におけるクロスまたは複数の除草剤耐性を付与するための単一の解毒メカニズムの可能性について。一般に、植物における除草剤の代謝は、3つの異なるフェーズ5に分割することができます。増加の極性と部分除草剤解毒5,6につながる、またはO-脱アルキル化反応-第I相は、芳香環またはアルキル基のP450媒介ヒドロキシル化、 または Nなどによる除草剤の変換や活性化を含みます。フェーズで新たに導入された官能基私のGSTによって還元型グルタチオンとの結合のための結合部位を提供することができますまたはフェーズII 5,7にUDP依存の糖転移酵素によってグルコースに。例えば、トウモロコシにおけるプリミスルフロンメチルの主要な初期の代謝物は、さらにヒドロキシプリミスルフロングルコシドする（フェーズII）を代謝して、長期保存またはさらなる代謝のための液胞に輸送することができるヒドロキシプリミスルフロンメチル8であり、プロcessing 5,6（フェーズIII）。 Waterhemp（ アマランサスのtuberculatus）は、米国で（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ）難コントロールトウモロコシの生産（ トウモロコシ）を妨げ、双子葉植物の年間雑草種、大豆（ ダイズ ）、綿です。 waterhempの遺伝的多様性の高度は、雌雄異株の生物学と長距離風受粉によって促進され、1つの女性waterhemp工場は百万種子9まで生成することができます。これらの種子は、自然に効果的な分散機構をwaterhempを付与する、小型で容易に広がります。 Waterhempは生育期9を通して連続発芽が表示され、その種子は休眠の数年後に発芽することができます。 Waterhempは耕地作付体系10の中で最も広葉雑草よりも高い成長率を有しているC 4植物です。加えて、多数のwaterhemp集団は、複数のFAMに耐性であります除草剤3のilies。 イリノイ州からwaterhemp（MCR指定）の人口は、4-ヒドロキシフェニルピルジオキシゲナーゼ（HPPD）などメソトリオンなど-inhibiting除草剤11、だけでなく、アトラジン及びアセト乳酸合成酵素（ALS）に、除草剤を-inhibitingプリミスルフロンメチルを含むことに耐性があります、非標的サイトベースのメカニズム12,13に起因します。アトラジン耐性が、メソトリオンに敏感であり、プリミスルフロンメチルをに敏感である、WCS 14指定waterhemp人口（によるALS遺伝子の変異に）プリミスルフロンメチル抵抗性があるACR 14指定waterhempの異なる人口、メソトリオン、及びアトラジンは、事前の研究12と現在の実験におけるMCRとの比較に使用した（ 表1に要約 ）。初期の研究は、MCRに、HPPD遺伝子配列または発現レベル、または減少しメソトリオンの取り込みの変化を検出しませんでしたメソトリオンに敏感な集団12と比較して人口。しかし、植物全体での代謝試験は、11,12メソトリオンするために、前の表現型応答と相関ACRおよびWCS、と比較してMCRの親メソトリオンの除草剤の有意に低いレベルを示しました。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp人口 </td><td> 略語 </td><td> メソトリオンの表現型 </td><td> メソトリオン耐性機構 </td><td> プリミスルフロンの表現型 </td><td> プリミスルフロン抵抗性機構 </td></tr><tr><td>マクリーン郡耐性</td><td> MCR </td><td>耐性</td><td>代謝* </td><td>耐性</td><td>代謝作用</td></tr><tr><td>アダムズ郡耐性</td><td> ACR </td><td> Sensitアイブ</td><td> - </td><td>耐性</td><td> ALS 14における標的部位の突然変異</td></tr><tr><td>ウェイン郡感受性</td><td> WCS </td><td>敏感</td><td> - </td><td>敏感</td><td> - </td></tr></tbody></table> *強化代謝以外の非標的部位の耐性機構は、また、MCR集団12メソトリオン耐性を付与することができます。 表1：本研究で用いたイリノイ州からwaterhemp集団の説明。 そのままwaterhemp苗に除草剤の代謝の速度を決定することに加えて、別の実験的なアプローチを切除waterhemp葉アッセイ12だけでなく、様々なP450 阻害剤（例えば、tetcyclacisとマラチオン）を使用して代謝を調査するために私たちのこれまでの研究で開発し、採用しました。この方法は、previからwaterhempのために特別に適応されました切除した葉のアッセイは、まだ双子葉植物に除草剤の代謝研究を行うために報告されていなかったため、切除したトウモロコシにおけるプリミスルフロンメチル代謝のOUの調査は、15を残します。 organophophosate殺虫剤マラチオンはしばしばP450の関与16を示すために 、インビボおよびインビトロ除草剤代謝研究に使用されてきました。例えば、トウモロコシにおける寛容とメソトリオンの急速な代謝がマラチオンがメソトリオン17にトウモロコシの感度を増加させた際に確認されたP450-触媒リングヒドロキシル化、によるものです。同様に、マラチオンは15を残し切除したトウモロコシにALS阻害プリミスルフロンメチルの代謝を阻害しました。切除した葉の技術の主な利点は、生成されたデータは、植物における全身、発芽後除草剤の代謝を評価する際に考慮すべき重要な要因全植物転パターンとは無関係であるということです。したがって、この方法は、定量可能と定性的な代謝は、単一の処理した葉12に注力して分析します。 栄養クローニング戦略は、切除された葉のプロトコルと組み合わせて、以前に代謝試験12を実施する waterhemp利用しました。他殖のwaterhemp（男女別の植物）の性質、および雌雄異株アマランサスの種内の遺伝的多様性の大幅9に、このプロトコルは、遺伝的に同一waterhempの苗は、時間経過実験内で分析されたことを確実にしました。この記事では、双子葉雑草（waterhemp）で除草剤代謝の速度を測定するための切除した葉の方法の有用性を示します。親の除草剤の量は、（吸収された除草剤の50％が分解する時間を推定するために、単純な一次曲線でフィッティングし、非線形最小二乗回帰分析によって、各時点（ 図1）で決定し、そして残りましたDT 50）。代表的な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）のクロマトグラムは、親の除草剤及び経時試験中の極性代謝物（単数または複数）の同時形成（ 図の消失を示すALS耐性および感受性waterhemp集団のために表示されています2）。私たちの記事の焦点は中に均一にリング標識（URL-14 C）除草剤を使用し、説明し、双子葉植物における除草剤の代謝の正確で再現率を決定するための栄養クローニング法との組み合わせで切除された葉のアッセイの有用性を実証することです彼らの全体のプラントHPPD-への対応と、ALS阻害除草剤（ 表1）が異なる3 waterhemp集団。

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>for pre-germinating seeds</td></tr><tr><td>Potting medium</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>49040233</td><td>for plant growth</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&amp;nbsp;</td><td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td><td>slow-release fertilizer</td></tr><tr><td>Growth chamber E15</td><td>Controlled Environments Limited</td><td>20207</td><td>plant culturing</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>buffer for excised leaves</td></tr><tr><td>HCl (concentrated)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144500</td><td>adjust pH of buffer</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) salts&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>incubation of excised leaves</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>leaf washes after incubation</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>plant extractions</td></tr><tr><td>Acetonitrile (HPLC grade)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MKH07610</td><td>HPLC mobile phase</td></tr><tr><td>Formic acid&amp;nbsp;</td><td>Mallinckrodt Analytical</td><td>MK259205</td><td>acidify mobile phase pH</td></tr><tr><td>Micro-centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>1.5 or 2.0 ml tubes</td></tr><tr><td>Centrifuge (temperature controlled)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>15 or 50 ml tubes</td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tube</td><td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, sterile</td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;Uuml;CHI</td><td>R200</td><td>concentrate plant samples</td></tr><tr><td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>quantify &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>High-performance liquid chromatography</td><td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>resolve herbicide metabolites</td></tr><tr><td>Flow scintillation analyzer&amp;nbsp;</td><td>LabLogic System</td><td>1103303</td><td>for HPLC analysis of &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Hypersil Gold C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt; column&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Scientific</td><td>03-050-522&amp;nbsp;</td><td>reversed phase</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M cocktail</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>for Flow-scintillation analyzer</td></tr><tr><td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>for LSS; biodegradable</td></tr><tr><td>Laboratory homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>CH-6010&amp;nbsp;</td><td>homogenize leaf samples</td></tr></tbody></table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

メソトリオン代謝率の大きな違いは、WCSまたはACRとMCR（図1）のいずれかとの間で検出されました。各時点で、MCRはより迅速に、以前の全植物の表現型応答11と相関する2メソトリオンに敏感な集団、WCSおよびACR、よりメソトリオンを代謝していました。各集団からの単一の親植物から十分な植物をクローニングすることによって、除草剤代謝の経時的分析は、原因で、各?...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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Research

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Environment

11.9K ビュー.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

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Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

環境学

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing plant metabolites because it provides molecular weights with high sensitivity and specificity. Leaf spray MS is an ambient ionization technique where plant tissue is used for direct chemical analysis via electrospray, eliminating chromatography from the process. This approach to sampling metabolites allows for a wide range of chemical classes to be detected simultaneously from intact plant tissues, minimizing the amount of sample preparation needed. When used with a high-resolution, accurate mass MS, leaf spray MS facilitates the rapid detection of metabolites of interest. It is also possible to collect tandem mass fragmentation data with this technique to facilitate a compound identification. The combination of accurate mass measurements and fragmentation is beneficial in confirming compound identities. The leaf spray MS technique requires only minor modifications to a nanospray ionization source and is a useful tool to further expand the capabilities of a mass spectrometer. Here, fresh leaf tissue from Sceletium tortuosum (Aizoaceae), a traditional medicinal plant from South Africa, is analyzed; numerous mesembrine alkaloids are detected with leaf spray MS.

Leaf spray mass spectrometry is a direct chemical analysis technique that minimizes the sample preparation and eliminates chromatography, allowing for the rapid detection of small molecules from plant tissues.

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

生化学

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

生物工学

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form loose callus on Murashige and Skoog (MS) basal media with the plant hormones 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, 1.0 mg L-1) and kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus formed after 3 or 4 rounds of subculturing, each lasting 28 days. Loose callus (about 3 g) was then inoculated into B5 liquid media containing the same plant hormones and was cultured in a shaking incubator (120 rpm) in the dark at 25 &#177; 1 &#176;C. After 3&#8722;4 subcultures, a cell suspension derived from tea leaf was established at a subculture ratio ranging between 1:1 and 1:2 (suspension mother liquid: fresh medium). Using this platform, six insecticides (5 &#181;g mL-1 each thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, and omethoate) were added into the tea leaf-derived cell suspension culture. The metabolism of the insecticides was tracked using liquid chromatography and gas chromatography. To validate the usefulness of the tea cell suspension culture, the metabolites of thiamethoxan and dimethoate present in treated cell cultures and intact plants were compared using mass spectrometry. In treated tea cell cultures, seven metabolites of thiamethoxan and two metabolites of dimethoate were found, while in treated intact plants, only two metabolites of thiamethoxam and one of dimethoate were found. The use of a cell suspension simplified the metabolic analysis compared to the use of intact tea plants, especially for a difficult matrix such as tea.

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

This work presents a protocol for establishing a cell suspension culture derived from tea (Camellia sinensis L.) leaves that can be used to study the metabolism of external compounds that can be taken up by the whole plant, such as insecticides.

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential human exposure through the consumption of pollutant-accumulated foods. Elucidating the uptake and metabolism of xenobiotics in crops is essential for the assessment of dietary exposure risk in humans. However, for such experiments, the use of intact plants requires long-term experiments and complex sample preparation protocols that can be affected by various factors. Plant callus cultures combined with high-resolution mass spectrometry (HRMS) may provide a solution for the accurate and time-saving identification of metabolites of xenobiotics in plants, as it can avoid interference from the microbial or fungal microenvironment, shorten the treatment duration, and simplify the matrix effect of intact plants. 2,4-dibromophenol, a typical flame retardant and endocrine disrupter, was chosen as the model substance due to its widespread occurrence in soil and its uptake potential by plants. Herein, plant callus was generated from asepsis seeds and exposed to sterile 2,4-dibromophenol-containing culture medium. The results showed that eight metabolites of 2,4-dibromophenol were identified in the plant callus tissues after 120 h of incubation. This indicates that 2,4-dibromophenol was rapidly metabolized in&#160;the plant callus tissues. Thus, the plant callus culture platform is an effective method to evaluate the uptake and metabolism of xenobiotics in plants.

The present protocol describes a simple and efficient method for the identification of 2,4-dibromophenol metabolites in plants.

植物における2,4-ジブロモフェノールの代謝を解明

Crops can be extensively exposed to organic pollutants, since soil is a major sink for pollutants discarded into the environment. This creates potential ...

<meta charset="utf8"></head><body>植物におけるトリアゾール系農薬の総合代謝物細胞毒性の推定

Assessing Cytotoxicity of Metabolites of Typical Triazole Pesticides in Plants

Various organic pollutants have been released into the environment because of anthropogenic activities. These pollutants can be taken up by crop plants, causing potential threats to the ecosystem and human health throughout the food chain. The biotransformation of pollutants in plants generates a number of metabolites that may be more toxic than their parent compounds, implying that the metabolites should be taken into account during the toxicity assessment. However, the metabolites of pollutants in plants are extremely complex, making it difficult to comprehensively obtain the toxicological information of all metabolites. This study proposed a strategy to assess the integral cytotoxicity of pollutant metabolites in plants by treating them as a whole during toxicological tests. Triazole pesticides, a class of broad-spectrum fungicides, have been widely applied in agricultural production. Their residue pollution in farmland has drawn increasing attention. Hence, four triazole pesticides, including flusilazole, diniconazole, tebuconazole, and propiconazole, were selected as the tested pollutants. The metabolites were generated by the treatment of carrot callus with tested triazole pesticides. After treatment of 72 h, the metabolites of pesticides in carrot callus were extracted, followed by toxicological tests using the Caco-2 cell line. The results showed that the metabolites of tested pesticides in carrot callus did not significantly inhibit the viability of Caco-2 cells (P>0.05), demonstrating no cytotoxicity of pesticide metabolites. This proposed method opens a new avenue to assess the cytotoxicity of pollutant metabolites in plants, which is expected to provide valuable data for precise toxicity assessment.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:植物中のトリアゾール系農薬の包括的な代謝物細胞毒性評価のための新しい効率的な方法

The protocol describes a new method to assess the integral cytotoxicity of metabolites of triazole pesticides in plants.

植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

Various organic pollutants have been released into the environment because of anthropogenic activities. These pollutants can be taken up by crop plants, ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

要約

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別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

リーフスプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

植物における2,4-ジブロモフェノールの代謝を解明

植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

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植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

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リーフスプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法