We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.

1.植物材料、成長条件、および栄養クローニング注意：三waterhemp集団は、本研究で調査した。MCR（アダムス郡、イリノイ州から）、ACR、およびWCS（マクリーン郡、イリノイ州）から（ 表1）（ウェイン郡、イリノイ州から）。 <ol><li> 0.1グラムのL -1の寒天でwaterhempの種子を収集し、一時停止：発芽を強化するために、少なくとも30日間4℃の水溶液を。注：一部のwaterhemp集団が休止しているが、このステップは休眠を克服し、種子がより均一に発芽するために役立ちます。 </li><li>温室内のポッティング培地を含む12×12センチメートルトレイに（ 表1のように）各waterhemp集団の種子を発芽。 <ol><li> 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で温室条件を維持します。 </li><li> 500マイクロモルmの最小値を提供するためにハロゲン化水銀ランプからの光が温室内で自然光を補足-2 </SUP&gt; 秒 -1プラントキャノピーレベルでの光子束。 </li></ol></li><li>彼らは温室では80 cm 3のポットに2センチメートル背が高いときには、移植苗を浮上しました。 </li><li> 1：1：ポッティングミックスの1：1混合土：ピート：砂の苗を4センチある950センチメートル3を含む3ポットに移植苗。各ポットに徐放性肥料顆粒5gのを追加し、この土壌の混合物と混合。 </li><li>頂芽優勢を排除は7センチの植物からの3つの最も若い葉を含む茎頂分裂組織をカットし、削除します。 注：この手順は、各植物がクローンするのに十分な3センチメートル腋窩の芽を育てることが保証されます。 </li><li>消費税5腋窩の芽（長さ3センチ）苗は、（ 表1のように）各waterhemp集団から約14センチです。さらに取り扱い時に水分の損失を低減するために、これらの腋窩の芽の葉の大部分を削除したが、移植時にさらなる成長を可能にするために2つの最も若い葉を保持しています。 <br/&gt;注：慎重に処理し、葉を削除するときに芽を損傷しないようにしてください。出資して各工場にラベルを付けます。 </li><li>移植腋窩は、発芽のために使用されるのと同じ媒体であるポッティング媒体に80センチメートル3ポット（1ポット当たり1苗）に撮影します。ポッティング媒体は、最初に飽和成長チャンバ内の根が形成されるまで、その根を確立するために、7日間成長チャンバー内の一定の水分と場所ポットを維持する必要があります。 注意：植物はこの時点で非常に敏感であり、強調されるべきではありません。 <ol><li> 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で成長チャンバ条件を維持します。 </li><li>白熱灯や蛍光灯の組み合わせは、成長チャンバ内の光を提供するために使用することができ、少なくとも550マイクロモルのM -2プラントキャノピーレベル12で秒 -1光子束を実現する必要があります。 </li></ol></li><li> 950センチメートル3ポット（1ポット当たり1苗）のCに再び移植1：1：ポッティングミックスの1：1混合土：ピート：3 ontainingクローン化された植物を4センチあるときに砂を戻し、温室に移し、（また、5グラムの徐放性肥料顆粒を含みます）。 </li><li> （ すなわち、1.5から1.8までの手順を繰り返し、その後、2.1に進み）上記と同様の方法を用いて植物をもう一度複製します。典型的な時間経過の研究のために、各waterhemp集団から少なくとも6つの独立した植物からクローンを作製し、ラインMCR 1-6、1-6 ACRおよびWCS 1-6としてそれらを記録します。 <ol><li>実験を繰り返し、十分に各waterhemp集団内の遺伝的多様性を表現するために、少なくとも6つの異なる「親」クローン株を確立します。 </li><li>分析されますどのように多くの時間のポイントに応じて、経時的研究を行うために、各「親」クローン株から十分なサブクローンを生成します。 </li></ol></li></ol> 2.摘出Waterhemで代謝研究を実施p個の葉<ol><li>クローン化されたwaterhempの植物は除草剤の代謝及びDT 50分析のための背の高い10〜12センチメートルである場合には、サード最も若い葉（添付葉柄の0.5cmに含まれる長さ2〜3センチ）を切り出します。 </li><li>水の下で（葉柄0.3 CMが残っていることを保証する）は、第2回ずつwaterhemp植物から葉の葉柄をカットし、これらのカットは1.5ミリリットルにプラスチックバイアル（1バイアルあたり1枚の葉）15を終了置きます。 注意：水中で二時間をカットすると、形成し、木部血管を塞ぐから気泡を防ぐことができます。 <ol><li>まず、部分的に1時間、0.1MのTris-HCl（pHが6）のプレインキュベーション緩衝液（200μL）にカット葉柄で切除した葉を浸します。 </li><li>第二に、0.1 Mトリス塩酸（pHが6）に加えて、150μM[URL-14 C]除草剤のインキュベーション緩衝液（200μl）を含む新しい1.5ミリリットルバイアルに各リーフを移動し、1時間に28℃でインキュベート葉への除草剤の吸収を可能にします。 注：両方の14 C-メソトリオンと<s&gt; 14 C-プリミスルフロンメチル、最大約20 mCiのミリモルの具体的な活動に私たちの研究に使用した-1。拡散と木部蒸散ストリームを介して取り込みの両方が葉ごとに取り上げ除草剤の量に寄与する。 注：除草剤代謝に対する代謝阻害剤の効果は、ステップ2.2.1および2.2.2上記を変更することによって決定することができます。プレインキュベーション緩衝液に阻害剤の、100μMを添加し、2時間インキュベートさせ、その後、除草剤とのインキュベーションバッファに転送して、再度、100μMの阻害剤を追加します。例えば、マラチオンとtetcyclacisは、植物15-17で特定のシトクロムP450活性を阻害します。 </li><li>脱イオン水で切除された葉の浸漬部分を洗浄し、四分の一強ムラシゲ・スクーグ（MS）塩溶液（500μl）をそれぞれ0時間、5時間、11時間、23時間、または35時間、のために切除した葉を転送し、時間経過代謝研究のための成長室インチ</li></ol></li><li>休暇を除去することにより、収穫手動で適切な時点で、インキュベーション溶液からのSとは、ポリプロピレンチューブ（15 mL）およびガラス乳棒を用いて液体窒素中で各葉組織を挽きます。 </li><li>上記と同じポリプロピレンチューブ中の実験室の組織ホモジナイザーで90％のアセトンの7ミリリットルを各葉から放射性標識された除草剤とその代謝物を抽出します。 90％のアセトンをさらに7 mlの組織ホモジナイザーをすすぎ、そして組織が完全に粉砕されるまで均質化を続ける（通常約2分）。注：90％アセトンは、植物組織から、ほとんどの除草剤の抽出のために使用することができます。この方法は、吸収された放射性標識化合物の90％以上を取り出すことができない場合には、その後、90％メタノール、または90％のアセトニトリルを抽出溶媒として置換することができます。 </li><li>発生する追加の抽出を可能にするために、16時間で-4℃のラベル90％のアセトン（合計14ミリリットル）を抽出して保存します。 注：処理された葉のこの抽出後、抽出RADの量ioactivityは、処理した葉に吸収さ放射性標識化合物の少なくとも98％、典型的です。切除した葉の非抽出放射能（バインドされた残基）は、私たちの以前の研究12で全ての時点全体のわずか0.3％で平均が、この量を調べ使用除草剤および時刻に応じて変化することができます。 </li><li>遠心分離は10分間5000×gで試料を0.5 mlの最終容積が得られるまで、ロータリーエバポレーターを用いて40℃、上清を濃縮します。 2.0ミリリットルのプラスチックチューブにこのボリュームを転送します。 </li><li>植物の最終容量が1.25ミリリットルに抽出調整し、再遠心10,000×gで10分間、任意の微粒子を除去するために：（体積で1、1）水：アセトニトリルを追加します。 </li><li> （DPMμL-1）、液体シンチレーション分光法（LSS）12によって、各サンプルから採取したアリコート中の総放射能を測定し、量を正規化する（例えば、HPLC分析のために注入された化合物、10,00 [14 C標識]結果をグラフ時0総DPM /サンプル/ラン）ので、y軸は、サンプル間で均一になります。 </li></ol>切除した葉における除草剤代謝の3 HPLC分析注：以下のRP-HPLC条件12を使用して親除草剤や除草剤の代謝物に総抽出放射能を解決します。 <ol><li> 1ミリリットル分の流速で、C 18カラム （4.6×250ミリメートル、分析用HPLCのための5μmの粒子サイズ）で、RP-HPLCを行い-1ほとんどの非極性除草剤のために。 注：C 4またはC 12 RP-HPLCカラムは、その代謝物から親除草剤の分離を最適化するために使用することができます。プレカラムフィルターおよび/またはガードカラムも保護し、RPカラムの寿命を延ばすために使用されてもよいです。 <ol><li>溶離液A、水中0.1％ギ酸（v / v）であり、溶離液B 100％HPLCグレードのアセトニトリル：RP-HPLCは、以下の移動相を使用してください。 注：HPLCグレードのメタノールはエルとして使用することができuentのより極性の化合物および代謝産物を解決するためのBが、保持時間も変更される可能性があることに注意してください。 注：私たちの研究12での極性代謝物からメソトリオンまたはプリミスルフロンメチルを解決するために使用される溶出プロファイルは、次のとおりです。ステップ1、A：B（4：1、V / V）に：B（3：2、V / V ）の直線勾配（12分）で、ステップ2、A：B（3：2、v / v）にする：B（3：7、v / v）の直線勾配（5分）で、ステップ3、A：B（3：7、v / v）での：B（1：9、v / v）の（19分の合計を含む）、2分間の線形勾配。 注：勾配とアイソクラチックステップは、解像度を最適化するために、母材の物理的特性に基づいて調整する必要があります。 </li><li> B（1：9、v / v）での：直線勾配（3分）であり、A：B（1、V / V 4）：B（4：1、vで上記の線形勾配の手順に従ってください/ v）を少なくとも2分間のイソクラティック段階（）次のエキス12を注入する前にRPカラムを再平衡化します。 </li></ol></li><li>フローシンチで放射性標識化合物を検出し、視覚化しますllationアナライザ。時間経過中に各waterhemp集団における除草剤の代謝の速度を決定するために、（製造業者の説明書に従って、フローシンチレーションアナライザによって検出および定量）各試料中の全放射能の割合として各サンプルに残っている親除草剤の量を記録します。 </li></ol> 4.統計処理<ol><li>完全にランダム化された設計（または統計分析のための他の適切な配置）で治療を配置します。 </li><li>各実験のための3つの生物学的複製物から成る各処置、2つの独立した実験を行います。 2つの独立した実験では、合計で6生物学的複製が含まれています。実験の効果は有意でない（α= 0.05）である場合、それぞれの独立した実験からのデータを組み合わせて解析します。実験の効果が顕著である場合には、個別の実験を分析します。 注：私は最初の3つの生物学的複製物を含みますnは実験1と実験2の次の3つの生物学的複製物はそれぞれの生物学的複製は（MCR 1-6、ACR 1-6、およびWCS 1-6）各集団由来クローン株となるよう明確な「親」を表し、各タイムコー​​スの分析は、遺伝的に同一の植物を利用しています。 2つの独立した実験では、各waterhemp人口の中央値DT 50の遺伝的変異性と決意を十分に表現することが可能合計6生物学的複製が含まれます。 </li><li>非線形最小二乗回帰分析を用いてデータを分析し、DT 50を推定するために、単純な一次曲線でそれらをフィット。以下の式は、モデルについて説明します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li>このモデル yに時刻 tの残りの親除草剤の割合を表し、μiがそれぞれのために、DT 50ですwaterhempの人口は、I、およびパラメータC 0は、T = 0〜12で、親除草剤存在の推定量です。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

本明細書中に記載の切除した葉の方法は、トウモロコシが15を残すにプリミスルフロン代謝の研究で以前に使用されてきたが、我々の結果は、このプロトコルはまた、双子葉雑草種12に除草剤の代謝を測定するための、効果的かつ正確で再現性があることを示しています。全植物の研究と比較して、切除した葉の技術の主な利点は、切除された葉が発芽後の全植物転パターン?...

雑草除草剤抵抗性は食料や繊維1,2のグローバル生産に深刻な脅威を提示します。現在、世界中で百以上の雑草種から耐性個体群と生物型の何千もの文書化され、3を検討されています。植物に除草剤耐性を付与する主要なメカニズムは、ターゲットサイトの遺伝子2の除草剤-タンパク質結合動態または増幅に影響を与える遺伝子変異を含む除草剤の標的部位の遺伝子やタンパク質の変化です。シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450）またはグルタチオン Sトランスフェラーゼ（GST）酵素の上昇活動を介した代謝解毒は、ターゲット・サイトベースのメカニズム2からいくつかの点で異なっているれ、雑草に除草剤耐性を付与する別のメカニズムです。代謝系の抵抗は（フィットネス罰則別名 ）植物の適応度コストは除草剤耐性mechanisから生じ得るかどうかに大きな影響を持っていますメートルだけでなく、雑草集団1,2,4におけるクロスまたは複数の除草剤耐性を付与するための単一の解毒メカニズムの可能性について。一般に、植物における除草剤の代謝は、3つの異なるフェーズ5に分割することができます。増加の極性と部分除草剤解毒5,6につながる、またはO-脱アルキル化反応-第I相は、芳香環またはアルキル基のP450媒介ヒドロキシル化、 または Nなどによる除草剤の変換や活性化を含みます。フェーズで新たに導入された官能基私のGSTによって還元型グルタチオンとの結合のための結合部位を提供することができますまたはフェーズII 5,7にUDP依存の糖転移酵素によってグルコースに。例えば、トウモロコシにおけるプリミスルフロンメチルの主要な初期の代謝物は、さらにヒドロキシプリミスルフロングルコシドする（フェーズII）を代謝して、長期保存またはさらなる代謝のための液胞に輸送することができるヒドロキシプリミスルフロンメチル8であり、プロcessing 5,6（フェーズIII）。 Waterhemp（ アマランサスのtuberculatus）は、米国で（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ）難コントロールトウモロコシの生産（ トウモロコシ）を妨げ、双子葉植物の年間雑草種、大豆（ ダイズ ）、綿です。 waterhempの遺伝的多様性の高度は、雌雄異株の生物学と長距離風受粉によって促進され、1つの女性waterhemp工場は百万種子9まで生成することができます。これらの種子は、自然に効果的な分散機構をwaterhempを付与する、小型で容易に広がります。 Waterhempは生育期9を通して連続発芽が表示され、その種子は休眠の数年後に発芽することができます。 Waterhempは耕地作付体系10の中で最も広葉雑草よりも高い成長率を有しているC 4植物です。加えて、多数のwaterhemp集団は、複数のFAMに耐性であります除草剤3のilies。 イリノイ州からwaterhemp（MCR指定）の人口は、4-ヒドロキシフェニルピルジオキシゲナーゼ（HPPD）などメソトリオンなど-inhibiting除草剤11、だけでなく、アトラジン及びアセト乳酸合成酵素（ALS）に、除草剤を-inhibitingプリミスルフロンメチルを含むことに耐性があります、非標的サイトベースのメカニズム12,13に起因します。アトラジン耐性が、メソトリオンに敏感であり、プリミスルフロンメチルをに敏感である、WCS 14指定waterhemp人口（によるALS遺伝子の変異に）プリミスルフロンメチル抵抗性があるACR 14指定waterhempの異なる人口、メソトリオン、及びアトラジンは、事前の研究12と現在の実験におけるMCRとの比較に使用した（ 表1に要約 ）。初期の研究は、MCRに、HPPD遺伝子配列または発現レベル、または減少しメソトリオンの取り込みの変化を検出しませんでしたメソトリオンに敏感な集団12と比較して人口。しかし、植物全体での代謝試験は、11,12メソトリオンするために、前の表現型応答と相関ACRおよびWCS、と比較してMCRの親メソトリオンの除草剤の有意に低いレベルを示しました。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp人口 </td><td> 略語 </td><td> メソトリオンの表現型 </td><td> メソトリオン耐性機構 </td><td> プリミスルフロンの表現型 </td><td> プリミスルフロン抵抗性機構 </td></tr><tr><td>マクリーン郡耐性</td><td> MCR </td><td>耐性</td><td>代謝* </td><td>耐性</td><td>代謝作用</td></tr><tr><td>アダムズ郡耐性</td><td> ACR </td><td> Sensitアイブ</td><td> - </td><td>耐性</td><td> ALS 14における標的部位の突然変異</td></tr><tr><td>ウェイン郡感受性</td><td> WCS </td><td>敏感</td><td> - </td><td>敏感</td><td> - </td></tr></tbody></table> *強化代謝以外の非標的部位の耐性機構は、また、MCR集団12メソトリオン耐性を付与することができます。 表1：本研究で用いたイリノイ州からwaterhemp集団の説明。 そのままwaterhemp苗に除草剤の代謝の速度を決定することに加えて、別の実験的なアプローチを切除waterhemp葉アッセイ12だけでなく、様々なP450 阻害剤（例えば、tetcyclacisとマラチオン）を使用して代謝を調査するために私たちのこれまでの研究で開発し、採用しました。この方法は、previからwaterhempのために特別に適応されました切除した葉のアッセイは、まだ双子葉植物に除草剤の代謝研究を行うために報告されていなかったため、切除したトウモロコシにおけるプリミスルフロンメチル代謝のOUの調査は、15を残します。 organophophosate殺虫剤マラチオンはしばしばP450の関与16を示すために 、インビボおよびインビトロ除草剤代謝研究に使用されてきました。例えば、トウモロコシにおける寛容とメソトリオンの急速な代謝がマラチオンがメソトリオン17にトウモロコシの感度を増加させた際に確認されたP450-触媒リングヒドロキシル化、によるものです。同様に、マラチオンは15を残し切除したトウモロコシにALS阻害プリミスルフロンメチルの代謝を阻害しました。切除した葉の技術の主な利点は、生成されたデータは、植物における全身、発芽後除草剤の代謝を評価する際に考慮すべき重要な要因全植物転パターンとは無関係であるということです。したがって、この方法は、定量可能と定性的な代謝は、単一の処理した葉12に注力して分析します。 栄養クローニング戦略は、切除された葉のプロトコルと組み合わせて、以前に代謝試験12を実施する waterhemp利用しました。他殖のwaterhemp（男女別の植物）の性質、および雌雄異株アマランサスの種内の遺伝的多様性の大幅9に、このプロトコルは、遺伝的に同一waterhempの苗は、時間経過実験内で分析されたことを確実にしました。この記事では、双子葉雑草（waterhemp）で除草剤代謝の速度を測定するための切除した葉の方法の有用性を示します。親の除草剤の量は、（吸収された除草剤の50％が分解する時間を推定するために、単純な一次曲線でフィッティングし、非線形最小二乗回帰分析によって、各時点（ 図1）で決定し、そして残りましたDT 50）。代表的な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）のクロマトグラムは、親の除草剤及び経時試験中の極性代謝物（単数または複数）の同時形成（ 図の消失を示すALS耐性および感受性waterhemp集団のために表示されています2）。私たちの記事の焦点は中に均一にリング標識（URL-14 C）除草剤を使用し、説明し、双子葉植物における除草剤の代謝の正確で再現率を決定するための栄養クローニング法との組み合わせで切除された葉のアッセイの有用性を実証することです彼らの全体のプラントHPPD-への対応と、ALS阻害除草剤（ 表1）が異なる3 waterhemp集団。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td>for pre-germinating seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting medium</td>
			<td>Sun Gro Horticulture</td>
			<td>49040233</td>
			<td>for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutricote</td>
			<td>Agrivert&#160;</td>
			<td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td>
			<td>slow-release fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber E15</td>
			<td>Controlled Environments Limited</td>
			<td>20207</td>
			<td>plant culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>buffer for excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (concentrated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144500</td>
			<td>adjust pH of buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog (MS) salts&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0404</td>
			<td>incubation of excised leaves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>leaf washes after incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>plant extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (HPLC grade)</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MKH07610</td>
			<td>HPLC mobile phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt Analytical</td>
			<td>MK259205</td>
			<td>acidify mobile phase pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>1.5 or 2.0 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (temperature controlled)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>15 or 50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>430790</td>
			<td>15 mL, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#220;CHI</td>
			<td>R200</td>
			<td>concentrate plant samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation spectrometry (LSS)</td>
			<td>Packard Instruments</td>
			<td>104470</td>
			<td>quantify 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N2910401</td>
			<td>resolve herbicide metabolites</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow scintillation analyzer&#160;</td>
			<td>LabLogic System</td>
			<td>1103303</td>
			<td>for HPLC analysis of 14C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column&#160;</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>03-050-522&#160;</td>
			<td>reversed phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo M cocktail</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013579</td>
			<td>for Flow-scintillation analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SX18</td>
			<td>for LSS; biodegradable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>CH-6010&#160;</td>
			<td>homogenize leaf samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring rates of herbicide metabolism in dicot weeds with an excised leaf assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

メソトリオン代謝率の大きな違いは、WCSまたはACRとMCR（図1）のいずれかとの間で検出されました。各時点で、MCRはより迅速に、以前の全植物の表現型応答11と相関する2メソトリオンに敏感な集団、WCSおよびACR、よりメソトリオンを代謝していました。各集団からの単一の親植物から十分な植物をクローニングすることによって、除草剤代謝の経時的分析は、原因で、各?...

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Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

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Research

JoVE Journal

Environment

11.9K ビュー.  University of Illinois. This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

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Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

放射性トレーサーで植物にミネラル栄養素や毒性物質のフラックスを測定する

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

環境学

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges widely over sub-Saharan Africa and in parts of the Middle East. Cheetah conservationists face two major challenges, conflict with landowners over the killing of domestic livestock, and concern over range contraction. Understanding of the latter remains particularly poor2. Namibia is believed to support the largest number of cheetahs of any range country, around 30%, but estimates range from 2,9053 to 13,5204. The disparity is likely a result of the different techniques used in monitoring.
Current techniques, including invasive tagging with VHF or satellite/GPS collars, can be costly and unreliable. The footprint identification technique5 is a new tool accessible to both field scientists and also citizens with smartphones, who could potentially augment data collection. The footprint identification technique analyzes digital images of footprints captured according to a standardized protocol. Images are optimized and measured in data visualization software. Measurements of distances, angles, and areas of the footprint images are analyzed using a robust cross-validated pairwise discriminant analysis based on a customized model. The final output is in the form of a Ward's cluster dendrogram. A user-friendly graphic user interface (GUI) allows the user immediate access and clear interpretation of classification results.
The footprint identification technique algorithms are species specific because each species has a unique anatomy. The technique runs in a data visualization software, using its own scripting language (jsl) that can be customized for the footprint anatomy of any species. An initial classification algorithm is built from a training database of footprints from that species, collected from individuals of known identity. An algorithm derived from a cheetah of known identity is then able to classify free-ranging cheetahs of unknown identity. The footprint identification technique predicts individual cheetah identity with an accuracy of &gt;90%.

The cheetah (Acinonyx jubatus) is an iconic, endangered species, but conservation efforts are challenged by habitat shrinkage and conflict with commercial farmers. The footprint identification technique, a robust, accurate and cost-effective image classification system, is a new approach to monitoring cheetahs.

彼らの足跡によって識別個人：チータースポッティング

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropod populations in rice. When used in combination with an enclosure, application of this sampling device provides absolute estimates of the populations of arthropods as numbers per standardized sampling area. The sampling efficiency depends critically on the sampling duration. In a mature rice crop, a two-minute sampling in an enclosure of 0.13 m2 yields more than 90% of the arthropod population. The device also allows sampling of arthropods dwelling on the water surface or the soil in rice paddies, but it is not suitable for sampling fast flying insects, such as predatory Odonata or larger hymenopterous parasitoids. The modified blower-vac is simple to construct, and cheaper and easier to handle than traditional suction sampling devices, such as D-vac. The low cost makes the modified blower-vac also accessible to researchers in developing countries.

Assessment of arthropod abundance in crops is critical for investigating population dynamics and species interactions. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropods in rice.

節足動物のフィールドサンプリングのためのリーフブロワー-VACの変更と応用

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

実験室およびフィールド プロトコル Dendrogeomorphology からシート侵食速度の推定

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has become particularly relevant for assessing the anthropogenic-altered global nitrogen cycle and the emission of greenhouse gases (i.e., N2O). Several methods are available for measuring denitrification, but none of them are completely satisfactory. Problems with existing methods include their insufficient sensitivity, and the need to modify the substrate levels or alter the physical configuration of the process using disturbed samples.This work describes a method for estimating sediment denitrification rates that combines coring, acetylene inhibition, and microsensor measurements of the accumulated N2O. The main advantages of this method are a low disturbance of the sediment structure and the collection of a continuous record of N2O accumulation; these enable estimates of reliable denitrification rates with minimum values up to 0.4-1 &#181;mol N2O m-2 h-1. The ability to manipulate key factors is an additional advantage for obtaining experimental insights. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate. The method is appropriate for estimating denitrification rates in any aquatic system with retrievable sediment cores. If the N2O concentration is above the detection limit of the sensor, the acetylene inhibition step can be omitted to estimate the N2O emission instead of denitrification. We show how to estimate both actual and potential denitrification rates by increasing nitrate availability as well as the temperature dependence of the process. We illustrate the procedure using mountain lake sediments and discuss the advantages and weaknesses of the technique compared to other methods. This method can be modified for particular purposes; for instance, it can be combined with 15N tracers to assess nitrification and denitrification or field in situ measurements of denitrification rates.

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

This method estimates sediment denitrification rates in sediment cores using the acetylene inhibition technique and microsensor measurements of the accumulated N2O. The protocol describes procedures for collecting the cores, calibrating the sensors, performing the acetylene inhibition, measuring the N2O accumulation, and calculating the denitrification rate.

コアと N2O マイクロ センサーを使用して土砂脱窒率を推定

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and shape of activated sludge flocs can indicate the conditions at the microscale, and also directly affect how well the sludge settles in a clarifier.
Particle size and shape are both misleadingly &#39;simple&#39; measurements. Many subtle issues, often unaddressed in informal protocols, can arise when sampling, imaging, and analyzing particles. Sampling methods may be biased or not provide enough statistical power. The samples themselves may be poorly preserved or undergo alteration during immobilization. Images may not be of sufficient quality; overlapping particles, depth of field, magnification level, and various noise can all produce poor results. Poorly specified analysis can introduce bias, such as that produced by manual image thresholding and segmentation.
Affordability and throughput are desirable alongside reproducibility. An affordable, high throughput method can enable more frequent particle measurement, producing many images containing thousands of particles. A method that uses inexpensive reagents, a common dissecting microscope, and freely-available open source analysis software allows repeatable, accessible, reproducible, and partially-automated experimental results. Further, the product of such a method can be well-formatted, well-defined, and easily understood by data analysis software, easing both within-lab analyses and data sharing between labs.
We present a protocol that details the steps needed to produce such a product, including: sampling, sample preparation and immobilization in agar, digital image acquisition, digital image analysis, and examples of experiment-specific figure generation from the analysis results. We have also included an open-source data analysis pipeline to support this protocol.

The size and shape of particles in activated sludge are important parameters that are measured using varying methods. Inaccuracies arise from non-representative sampling, suboptimal images, and subjective analysis parameters. To minimize these errors and ease measurement, we present a protocol specifying every step, including an open source software pipeline.

オープン ソース ソフトウェア パイプラインによる寒天培地に固定化活性汚泥粒子径・形状を測定

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

純粋な落葉スタンドにおける3つの異なる方法を用いてリーフエリア指数推定

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...