We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا UK الرئيسية للمكتب على النحو المحدد في الحيوانات (إجراءات علمية) لعام (1986) تحت رخصة المشروع رقم 60/4435. لجمع الأجنة في مراحل نمو محددة، وضعت التزاوج توقيتها حتى O / N. تم تعيين ظهر اليوم من العثور على المكونات المهبلية اليوم الجنينية (E) 0.5. 1. تشريح E7.5 أو E8.5 Postimplantation الأجنة لفيفو السابقين الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية إناث الفئران الحوامل خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الرحم باستخدام مقص، وعقد مع ملقط، ووضع في صحن 30 ملم مليئة M2 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسيل للدموع بعناية بعيدا عضل الرحم باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعيدا الساقط، والحرص على عدم ثقب تجاويف خارج الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غشاء رايخرت عن طريق معسر مع ملقط وببطء يفصلها عن الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الأجنة تحت تشريحstereomicroscope لضمان أن الكيس المحي، السلى ومخروط المشيمة الظاهر وسليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى صحن نظيف من M2 باستخدام ماصة ومكان على 30 مم البلاستيك طبق بيتري غطاء على الجليد (في &#39;منصة الجليد&#39;) إلى الأجنة البرد جزئيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، الأجنة مخزن في M2 على منصة الجليد لمدة تصل إلى 1.5 ساعة، على سبيل المثال، أثناء إعداد وسائل الإعلام أو التلاعب في دفعات صغيرة من ~ 3-4 أجنة في RT. ملاحظة: انتعاش وصفت تشريح الأجنة القوارض بالتفصيل سابقا 7،8،16. </li></ol> 2. إعداد الأجنة الثقافة المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الطازج إما مصل الفئران المتاحة تجاريا (انظر جلانفيل جونز وآخرون. (13) لمواصفات)، أو مصل الفئران أعد في المنزل، وفقا لنفقات المنتجين حسب الغرض وكوكروفت 16 التي كانت المعطل الحرارة لمدة 30 دقيقة في 56 ج والمجمدة في 1 مل aliquots في -80 ج ملاحظة: مصل الفئران المتاحة تجاريا هو مقبول<html> لفترات ثقافة 24-36 ساعة، على الرغم من المصل أعد في المنزل، في تجربتنا، متفوقة لفترات ثقافة تصل إلى 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طازجة إعداد وجود فائض (على سبيل المثال، 10 مل) من المكملات محددة تتألف من غلاسكو الأساسية الدنيا والمتوسطة (GMEM) والأحماض الأمينية 1٪ غير الضرورية (NEAA)، 2 مم L-الجلوتامين و 1 ملي البيروفات الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حجم مستنبت ما هو مطلوب وفقا لعدد من الأجنة من كل المرحلة التي هي على وشك أن مثقف (انظر القسم 3). مزج مصل الفئران مع ملاحق محددة لتعويض 50٪ مستنبت (1: 1 (ت / ت) مصل الفئران: المكملات محددة) و / أو 75٪ مستنبت (3: 1 (ت / ت) مصل الفئران: تعريف المكملات الغذائية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير مستنبت الجنين من خلال 0.45 ميكرون تصفية وإضافة 10،000 وحدة دولية / مل البنسلين و 10 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. ملاحظة: إذابة طازجة L-الجلوتامين والبيروفات الصوديوم الحل الحاسم لتطور الجنين خلال الثقافة فيفو السابقين. </li></ol>ه &quot;&gt; 3. فيفو السابقين الظروف الثقافة لمراحل الجنينية مختلفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأجنة E7.5: ثقافة ثابتة باستخدام لوحات 4-جيدا في حاضنة المرفق مع 5٪ CO 2 في الهواء عند 37 مئوية لمدة 24 ساعة. ثقافة ما يصل الى اثنين الأجنة لكل بئر في 1 مل من 50٪ مستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لE8.5 الأجنة: استخدام الثقافة الجهاز بكرة 8 الدورية في 35 الدورات / دقيقة دمج بالغاز المستمر مع 5٪ CO 2 في الهواء عند 37 مئوية لمدة 24 ساعة (1 مل ​​50٪ مستنبت في الجنين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأجنة E9.5: استخدام جهاز الثقافة الأسطوانة الدوارة في 35 الدورات / دقيقة تتضمن الغازات المتوفرة مع 5٪ CO 2، 40٪ O 2 55٪ N 2 عند 37 مئوية لمدة 24 ساعة (1 مل ​​75٪ مستنبت في جنين). ملاحظة: الأجنة الثقافة ضمن 3 ساعات بعد القتل الرحيم الفئران كما فترات طويلة في M2 تؤثر سلبا على التنمية. رؤية نفقات المنتجين حسب الغرض وكوكروفت 16 للاطلاع على طريقة فيفو السابقين الثقافة الجنين. </li></ol> 4. Graftinز الخلايا المستزرعة في E7.5 E8.5 أو أجنة الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط جسديا EpiSCs، التي تعبر عن بتواجد مطلق GFP، من لوحة الثقافة 6-جيدا باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر ووضعها في صحن 30 ملم تحتوي على الأجنة ملاحظة: لإدراج كتل الخلايا في الأجنة والخلايا ينبغي حلها جسديا بدلا من trypsinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق تطعيم الشعرية سحبت يد لأنبوب الشافطة لجعل ماصة الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمتص بلطف ماصة الفم لرسم واحد أو أكثر من كتل الخلايا من حجم&gt; 20 الخلايا في الشعرية التطعيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضربة برفق خارج الخلايا، لتفريق جزئيا كتل كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر واحدا أجمة الخلية التي تحتوي ~ 10-20 الخلايا وتمتص في الشعرية التطعيم مرة أخرى، والحفاظ عليها على مقربة من افتتاح الشعرية. يجب الحرص على عدم تحريك أجمة خلية داخل وخارج الشعرية مرارا وتكرارا، لتجنب تفكك إلى أجزاء أصغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الجنين فضفاضة في مكان مع زوج من ملقط وإدراج تطعيمالشعرية في المنطقة التي تهم خلق الافتتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد بلطف أجمة من الشعرية تطعيم، وترك سلسلة قصيرة من 10-20 الخلايا استقرت في الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء تطعيم للالعدد المرغوب فيه من الأجنة. استخدام أحجام دفعة من 3-4 أجنة للراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأجنة في نفس طبق من M2 المتوسطة، صورة الأجنة المطعمة باستخدام مركب مضان تشريح المجهر مع الكاميرا، وحفظ وقت التصوير إلى أدنى حد ممكن لتجنب تعرض الأجنة للضوء والحرارة المفرطة. ملاحظة: تحديد الأوقات التصوير تجريبيا وهذه سوف تعتمد على مواصفات الكاميرا والمجهر، وكذلك طبيعة ومضان شدة fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في pastette مع حجم الحد الأدنى من M2 المتوسطة إلى معايرتها مسبقا مستنبت (انظر القسم 3) مباشرة بعد التصوير. ملاحظة: التأني في دراسة مورفولوجية الأجنة بعد التطعيم. الوحيدة ثقافة intacر الأجنة. </li></ol> 5. اليدوية المواد Electroporation للوإعداد جهاز (إعداد وعقب مقدما من التجارب Electroporation لل): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لماصات حقن الحمض النووي: سحب ماصات حقن الحمض النووي باستخدام micropipette مجتذب الأفقي. يجب أن يكون ماصات حقن تلميح على ما يرام مع افتتاح أقل من 10 ميكرون لتجنب تلف الأنسجة عند حقن الحمض النووي في تجاويف الجنينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للزجاج الشعرية Electroporation لل: استخدام microforge لخفض افتتاح ماصات حقن الحمض النووي ليبلغ قطرها الداخلي 20 أو 30 ميكرون. لتجنب تلف الخلايا عندما الشعرية في اتصال مع الجنين ل electroporation، يجب قطع غيض من الزجاج الشعرية نظيفة وليس احتواء حادة، وحواف مكسورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقطب كهربائي الشعرية اليدوية (الأنود) (الشكل 1): إدراج 0.2 مم سلك البلاتين إلى الزجاج الشعرية Electroporation للمع افتتاح ثابت من 20 أو 30 ميكرون قطر لتركيز المنتخبريك الحالية وتسليم DNA البلازميد إلى منطقة صغيرة من الفائدة في الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمصنوعة يدويا على شكل L القطب (الكاثود) (الشكل 1): ثني 0.2 ملم قطر السلك البلاتين خلق &quot;L&quot; شكل، مع الجزء الأفقي من &quot;L&quot; حوالي 1 ملم في الطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق كل قطب البلاتين إلى سلك معزول رقيقة وأدخله حامل microinjection الإبرة بواسطة شريط العزل تغطيتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل أصحاب الإبرة على أصحاب الصك المجهرية القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الدائرة كما هو موضح في الشكل رقم 1: ربط الكهربائي الشعرية إلى القطب الموجب من التيار الكهربائي. ربط الكهربائي على شكل L إلى القطب الموجب من متعدد. توصيل السالب للmulimeter إلى الكاثود من امدادات الطاقة. </li></ol> 6. Electroporation للE7.5 E8.5 أو أجنة الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الزجاج الشعرية Electroporation للمع برنامج تلفزيوني لفي غضون 1-2 ملم من أعلى وإدراج الاجهادGHT الكهربائي البلاتين (الأنود) في الزجاج الشعرية حتى تصل إلى الجزء السفلي من الشعيرات الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرساة القطب على شكل L (الكاثود) على سطح طبق بتري 30 ملم مليئة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجنين من M2 المتوسطة في طبق Electroporation للPBS مملوءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة الحقن من الأديم الظاهر الجانبي في التجويف الذي يحيط بالجنين من الجنين. باستخدام مضخة هوائية بيكو، حقن محلول الحمض النووي (pCAG-لجنة المساواة العرقية: GFP أو pCAG-GFP 1-1.5 ميكروغرام / مل مع 0.01٪ المواد الغذائية الخضراء التلوين صبغة) في تجويف حتى يكون كامل تماما. لأجنة E7.5-E8.5، مطلوب حل DNA أقل من 5 ميكرولتر لجنين واحد. باستخدام الصبغة الخضراء كمؤشر، يجب الحرص على عدم انفجار الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعناية الجنين بين الأقطاب ونقل القطب الشعرية إلى الموقع الدقيق حيث DNA ليتم تسليمها. ملاحظة: توجه الجنين يعتمد على المنطقة حيث DNA هو أن electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electropoمعدل الجنين باستخدام 200 فولت (V) في 6 البقول، كل 50 مللي ثانية مدتها مع فاصل زمني 1 ثانية بين كل نبضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجنين إلى ما قبل معايرتها مستنبت مباشرة بعد Electroporation لل. إذا رغبت في ذلك، كرر العملية للجنين المقبل. ملاحظة: إضافة مستنبت في وعاء معقم ووضعه في الحاضنة الثقافة إلى ما قبل تتوازن المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن خلايا electroporated 2 ساعة بعد الثقافة، ونقل الأجنة إلى 30 مم طبق بتري نظيف من M2 المتوسطة باستخدام pastette. صورة الأجنة كما في الخطوة 5.9 باستخدام مركب مضان تشريح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى الثقافة باستخدام pastette مباشرة بعد التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن الخلايا الميتة تسبب بواسطة الصعق الكهربائي، وصمة عار على الأجنة مع خلية غشاء كتيمة الصبغة الحمراء بعيدة النووي (1: 200 في الجنين مستنبت) في 37 مئوية لمدة 10 دقيقة 2 ساعة بعد Electroporation لل(اختياري) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد خلايا electroporated، وتحديد امبريالسراج في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 2-4 ساعة على 4 ج، وصمة عار النواة مع الأشعة فوق البنفسجية أو تحت الحمراء بعيدة مباين النووية الفلورسنت وصورة أجنة باستخدام مجهر متحد البؤر (اختياري). ملاحظة: يتأثر نمو الأجنة سلبا إذا ما تركت لفترة طويلة جدا في برنامج تلفزيوني. لذلك، تأكد من أن الوقت الذي يستغرقه لelectroporate كل جنين إلى أدنى حد ممكن (&lt;5 دقائق في الجنين). </li></ol>

<ol>
	<li>O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+asthma+control+in+pediatric+patients+after+discontinuation+of+long-acting+Beta-agonists.">Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists.</a> Pulmonary med. , 894063 (2012).</li><li>Brons, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448, 191-195 (2007).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448, 196-199 (2007).</li><li>Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+differentiation+potential+of+epiblast+stem+cells+revealed+by+chimeric+embryo+formation.">In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation.</a> Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).</li><li>Sadik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+relationship+and+optimization+of+double-pulse+electroporation.">Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation.</a> Biophys. J. 106, 801-812 (2014).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).</li><li>Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+4+signaling+regulates+development+of+the+anterior+visceral+endoderm+in+the+mouse+embryo.">Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo.</a> Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).</li><li>Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+prepancreatic+endoderm+by+whole+embryo+electroporation.">Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation.</a> JOP. 6, 128-135 (2005).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+cell+markers+into+germ+layer+tissues+of+the+mouse+gastrula+by+whole+embryo+electroporation.">Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation.</a> Genesis. 35, 57-62 (2003).</li><li>Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-Mapping+Technique:+Targeted+Whole-Embryo+Electroporation+of+DNA+Constructs+into+the+Germ+Layers+of+Mouse+Embryos+7-7.5+Days+Post-coitum.">Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum.</a> CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Nolkrantz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+single+cells+and+tissues+with+an+electrolyte-filled+capillary.">Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary.</a> Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).</li><li>Mazari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdevice+to+locally+electroporate+embryos+with+high+efficiency+and+reduced+cell+damage.">A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage.</a> Development. 141, 2349-2359 (2014).</li><li>Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , (1990).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).</li><li>Wilson, V., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+and+morphogenetic+movement+in+the+late+mouse+primitive+streak.">Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak.</a> Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).</li><li>Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+progression+of+lineage+segregations+during+mammalian+embryogenesis+by+clonal+analysis.">Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis.</a> Dev Cell. 17, 365-376 (2009).</li><li>Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+in+mammalian+gastrulation:+the+ventral+node+and+notochord+are+relatively+quiescent.">Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent.</a> Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).</li><li>Tsakiridis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Wnt-driven+primitive+streak-like+populations+reflect+in+vivo+lineage+precursors.">Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors.</a> Development. 141, 1209-1221 (2014).</li><li>Gouti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+neuromesodermal+progenitors+reveals+distinct+roles+for+wnt+signalling+in+the+specification+of+spinal+cord+and+paraxial+mesoderm+identity.">In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity.</a> PLoS biology. 12, e1001937 (2014).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120, 613-620 (1994).</li></ol>

The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

تطعيم النبات في خطوة حاسمة لتجارب التطعيم الخلية ادراج سلسلة مترابطة من الخلايا في موقع مثالي في عمل واحد، لتجنب تفكك أجمة. وتتطلب هذه التقنية بعض الممارسات في السيطرة على ماصة الفم. إذا الخلايا المانحة تتضمن كذلك في البلد المضيف، ومشتقاتها تفريق في الجنين. لمزيد من تحديد ما إذا كان المتبرع فرقت الخلايا المشتقة من التفريق بشكل مناسب في البلد المضيف، المناعية يمكن أن يؤديها على أقسام الجنين. إذا الخلايا المانحة غير متوافقة مع البيئة المضيفة، لأنها إما لا يمكن الكشف عن (كما يتم طردهم من الجنين) أو تشكيل كتل غير مدمج في الأجنة بعد الثقافة. إذا لوحظت كل من الخلايا المتفرقة وكتل الخلايا، وهذا قد يشير إلى والمطعمة أن الكثير من الخلايا وأدى الخلايا المفرطة المانحة التي لا يمكن أن تتفاعل مع توضيح الخلايا المضيفة في تشكيل أجمة. في هذه الحالة، الطعوم إضافية تحتوي علىلا يمكن أن يؤديها عدد أقل من الخلايا. القيد الرئيسي للتقنية تطعيم خلية هو أنه ليس من الممكن تحديد الإمكانات الكاملة في الجسم الحي من خلايا منذ الماوس الثقافة فيفو السابقين على مدى فترات لم يتحقق أطول من 48 ساعة. ومع ذلك، إذا جنبا إلى جنب مع حقن الخلايا الموجهة بالأمواج فوق الصوتية، قد يكون من الممكن نقل الخلايا المستزرعة إلى الأجنة في الرحم. لتلخيص، وقد استخدمت الخلية تطعيم التجارب على نطاق واسع في مجموعتنا وأعطت لنا ادلة قيمة حول إمكانية في الجسم الحي من مختلف أنواع الخلايا 4،21،22. وهو أسلوب المنفعة العامة لتقييم إمكانات في الجسم الحي في المختبر الخلايا المستزرعة في الأجنة postimplantation مبكرة. Electroporation لل على الرغم من أن في هذه الدراسة قمنا يظهر فقط أنه من الأفضل لاستخدام تقنية Electroporation للالشعرية لاستهداف الأديم الظاهر، طتي الممكن أيضا أن تستهدف عمدا طبقات جرثومية أخرى مثل خلايا الأديم. في خطوة حاسمة لتقنية Electroporation للالشعرية هو تقليل الوقت الذي يستغرقه لelectroporate كل جنين (&lt;5 دقائق في الجنين) منذ PBS هو الأمثل للغاية لأجنة فئران في مراحلها المبكرة. بياناتنا أظهرت فوق ذلك، في معظم المناطق في الأجنة، Electroporation لللا يؤثر على نمو الجنين. ومع ذلك، Electroporation للفي عقدة تسبب نمو غير طبيعي وادت الى الوفاة المبكرة للجنين. هذا هو الأرجح بسبب تلف أو موت الخلايا التي تشكل مراكز إشارات هامة 23. وبالتالي، فإن هذه المنطقة لا بد من تجنبها مع هذه التقنية. A مزيد من التحذير هو أنه، على النحو المذكور في قسم النتائج، في حين استهدفت الأديم الظاهر أو خلايا متتالية بدائية، تم electroporated أيضا بعض خلايا الأديم. قد يكون هذا بسبب DNA يصل إلى الأديم الباطن من خلال الفجوات تحت الظهارة الأديم الظاهر. يتكون الأديم الباطن الخلايا الظهارية وتجربتنا عشرخلايا جنوب شرقي لديها الميل العالي لتولي DNA. ولذلك، عند تطبيق هذه التقنية لرسم الخرائط مصير، فمن المهم لتقييم الخلايا التي تتخذ في البداية حتى الحمض النووي. كما تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من pCAG-GFP وpCAG-لجنة المساواة العرقية: البلازميدات GFP يمكن تقديمها بكفاءة باستخدام المعلمات Electroporation للهو مبين في هذه الدراسة، وكفاءة البنى DNA أخرى قد تختلف وتحتاج الأمثل الفردية. ويمكن إجراء تغييرات في تركيز الحمض النووي، Electroporation للجهد أو عدد النبضات إذا تم العثور على البلازميدات من الصعب ل transfect. لتلخيص، يمكن أن لدينا الأمثل نظام Electroporation للالشعرية بكفاءة وبتكاثر تسليم GFP أو لجنة المساواة العرقية: البلازميدات GFP في عدد قليل جدا من الخلايا في الجنين مع موت الخلايا محدود. لأن هذا الأسلوب لا يتطلب معدات باهظة الثمن أو درجة عالية من التخصص، ويمكن ان تكون ذات فائدة كبيرة للدراسات تتبع الخلية أو في اختبار تأثير التعبير خارج الرحم أو الشرطي حذف سالجينات و الأجنة في وقت مبكر، ويتم تنفيذ إذا Electroporation للفي الأجنة التي تحمل floxed أليل متحولة المشروطة. لذلك، توفر هذه التقنية Electroporation للأداة وظيفية مفيدة لفهم على أساس خلية تلو خلية أدوار العوامل خلايا الجوهرية في سياق wildtype المترجمة بيئات الجنينية.

تم زراعة الخلايا المستخدمة على نطاق واسع في دراسات البيولوجيا التطورية. الماوس الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) والخلايا الجذعية الأديم الظاهر (EpiSCs) يمكن أن تفرق في جميع الطبقات الجرثومية الثلاث في المختبر، وتمثل نموذجا مفيدا للتمايز الخلايا في أوائل مرحلة التطور الجنيني الثدييات. وقد فتحت اشتقاق هذه خطوط الخلايا يصل فرصة للفي المختبر التلاعب وتحقيق مفصل للالمترجمة يشير الأحداث وشبكات النسخي تعمل في وقت مبكر خلال الزخرفة الجنينية. ومع ذلك، فإنه لا يزال من المهم تحديد أهميتها في الجسم الحي من أي تلاعب يؤديها في مجال الثقافة. وقد تم تقييم الإمكانيات في الجسم الحي من قبل الغرس المستمدة الجنين المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس عن طريق تعريفهم مرة أخرى إلى سابق للانغراس الأجنة (morulae أو الكيسات الأريمية) 1. ومع ذلك، يمكن EpiSCs التي تمثل خلايا الأديم الظاهر في الأجنة postimplantation لا تدمج بكفاءة في الأجنة سابق للانغراس 2،3. لدينا previoلنا النتائج أظهرت أن EpiSCs يمكن أن تولد بكفاءة الوهم والمساهمة في كل طبقات جرثومية، وعندما المطعمة إلى الأجنة postimplantation 4. وبالتالي، فإن أفضل طريقة لتقييم الخلايا المستزرعة في المختبر هي لتعريفهم بالبيئة يناظرها في الجسم الحي. Electroporation للهو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لتقديم جزيئات الخارجية في الخلايا المستهدفة في كل المجراة في التجارب المختبرية. الطاقة الكهربائية يمكن أن يولد عدد كبير من المسام في غشاء الخلية، والذي يسمح حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين خارجي (DNA) الحمض النووي الريبي أو (RNA) من دخول الخلايا. واحدة من أكبر التحديات التي تواجه هذا الأسلوب هو الجمع بين بقاء الخلية الأمثل مع electrotransfection عالية الكفاءة 5،6. ل electroporation من الأحماض النووية في الأنسجة الجنينية، والأكثر شيوعا استخدمت أقطاب مطلية بالذهب، مما يسمح استهداف الخلايا في نطاق المكاني الواسع 7-9. لتحقيق المزيد من المحلىنقل الجينات lized، وقد استخدمت القطب على شكل إبرة لتحقيق الحقل الكهربائي البؤري 10،11. باستخدام هذه الطريقة، أظهرت الكتاب أنه بعد Electroporation لل، حوالي 30-60 الخلايا قد اتخذت حتى DNA بناء 11. ومع ذلك، يبدو أن ضبط بدقة عدد الخلايا electroporated يزال من الصعب مع القطب ذو عرض ثابت. وقد استخدمت هذه التقنية Electroporation للالشعرية لتقديم البلازميدات إلى الخلايا واحدة 12-14. ومع ذلك، لم يتم تطبيق هذه التقنية لelectroporating البلازميدات إلى الأجنة خارج الجسم الحي. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن microdevice لمحليا electroporate عدد قليل من الخلايا البعيدة الحشوية الأديم الباطن (أقل من 4 خلايا) في postimplantation مبكرة أجنة الفئران 15. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كان هذا الجهاز يمكن أن تستهدف بكفاءة الأديم الظاهر والأديم المتوسط ​​خارج الحي. في هذه الدراسة وصفنا طريقتين جديدة لتقييم وظيفة الخلوية والجينات في آخر في وقت مبكر-implantation الأجنة. علينا أن نبرهن أولا كيفية الكسب غير المشروع في المختبر الخلايا المستزرعة في مواقع محددة في أجنة الفئران في وقت مبكر لتقييم قدراتهم في الجسم الحي. دمج الخلايا المطعمة وأحفادهم، كل وصفت من قبل العلامة الوراثية (على سبيل المثال، وهو البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، يمكن فحص مزيدا من المناعية بروتينات معينة الأنسجة 4. ثانيا، نحن تصف طريقة محسنة لتقديم بالضبط DNA لمواقع محلية في جنين عبر Electroporation لل. وبدلا من استخدام القطب على شكل إبرة، ونحن إدخال سلك رفيع داخل غرامة ذات الرؤوس الزجاج الشعرية، وإثبات أن هذا التعديل يمكن أن يحقق الحمض النووي لعدد صغير من الخلايا مع كفاءة عالية ومحدودة خلية الموت. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أنه باستخدام الشعيرات الدموية الزجاج بأحجام مختلفة الافتتاح، نتمكن من السيطرة على عدد الخلايا electroporated. ولذلك، فإننا نعتقد أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة لدراسة مبكرة الزخرفة الجنينية التي تضم عدد قليل سخلايا F.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Forceps</td>
			<td style="width:275px;">Dumostar</td>
			<td style="width:275px;">T5390</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Dissecting stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">&#160;Zeiss</td>
			<td style="width:275px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Stereomicroscope system with fluorescence&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Nikon</td>
			<td style="width:275px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted microscope with a digital camera</td>
			<td style="width:275px;">Olympus</td>
			<td style="width:275px;">Olympus BX61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:275px;">Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Low melting point agarose&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">11397863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">30mm Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">121V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4-well plates</td>
			<td style="width:275px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:275px;">179820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">10010015&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">NICHIRYO</td>
			<td style="width:275px;">Nichipet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:275px;">685280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">SANYO</td>
			<td style="width:275px;">MCO-17AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Roller culture apparatus&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTC Engineering</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Syringe filters 0.45&#181;m, sterile&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">10462100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30549.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30239.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:275px;">DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN&#160;</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:347px;">Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:275px;">640798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">A5177-5EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Flaming/Brown micropipette puller&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:275px;">P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">De Fonbrune</td>
			<td style="width:275px;">BS030301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pneumatic pico pump&#160;</td>
			<td style="width:275px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:275px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microloader tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:275px;">5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">ECM 830 square wave pulse generator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTX</td>
			<td style="width:275px;">45-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Green food coloring dye</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">C.I. 42053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td>
			<td style="width:275px;">Biotium</td>
			<td style="width:275px;">40060-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-Cre:GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#13776&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Multimeter</td>
			<td style="width:275px;">Excel</td>
			<td style="width:275px;">XL830L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Micromanipulators&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leitz&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">0.2mm diameter platinum wire&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:275px;">E404-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:275px;">Abcam</td>
			<td style="width:275px;">ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Goat anti-Chicken IgY, HRP</td>
			<td style="width:275px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:275px;">sc-2428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Dako</td>
			<td style="width:275px;">K3467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red fluorescence nuclear counterstain</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

التلاعب وثقافة أجنة فئران في مراحلها المبكرة هي قوية إلى حد كبير غير المستغلة تكنولوجيا تعزيز قيمة هذا النظام النموذجي. على العكس من ذلك، فقد تم زراعة الخلايا تستخدم على نطاق واسع في دراسات البيولوجيا التطورية. ومع ذلك، فمن المهم تحديد ما إذا كان في المختبر الخلايا المستزرعة تمثل حقا في أنواع الخلايا الجسم الحي. تطعيم الخلايا في الأجنة، يعقبه تقييم مساهمتها خلال تطوير طريقة مفيدة لتحديد إمكانات في المختبر الخلايا المستزرعة. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة لترقيع الخلايا إلى موقع محدد من أجنة الفئران postimplantation الأولى، تليها الثقافة فيفو السابقين. كما نقدم طريقة Electroporation للالأمثل يستخدم الشعيرات الدموية كوب من القطر المعروف، مما يسمح للتوطين الدقيق وتعديل عدد الخلايا المستقبلة الحمض النووي الخارجية مع كل من عالية الكفاءة ترنسفكأيشن وموت الخلايا منخفضة. هذه التقنيات، والتي لا تتطلب أي ليرة سوريةمعدات ecialized، وتجعل التلاعب التجريبية لتكون المعيدة وأوائل مرحلة توالد جنين الفأر ممكن، مما يسمح للتحليل الالتزام في القطعان خلايا مستنبتة وتأثير التلاعب الجيني في الموقع على تمايز الخلايا.

تطعيم النبات EpiSCs التي تعبر عن بتواجد مطلق EGFP (R04-GFP، والمستمدة من E6.5 الأديم الظاهر، وC2، مستمدة في المختبر من mESCs) 4 تم كشط يدويا من الطبق الثقافة والمطعمة في مواقع مختلفة من الأجنة E7.5 (الشكل 2A). كان المثقف الأجنة خارج الجسم الحي وتحليلها بعد 24 ساعة. تم تقييم توزيع الخلايا المانحة بواسطة المجهر مضان. إذا أدرجت الخلايا المانحة، وأنها انتشرت ومشتقاتها فرقت داخل الأجنة المضيفة (الشكل 2B). وقد لوحظ أن الطعوم التي تحتوي على 10-16 الخلايا أدرجت بكفاءة في الأجنة المضيفة (الشكل 2A، 2B و)، ومع ذلك، تطعيم أكثر من الخلايا لا يؤدي إلى أفضل chimaerism. بدلا من ذلك، أنتجت خلايا المطعمة كتل الفردية (الشكل 2C و 2D). Electroporation لل لssess كفاءة نظام Electroporation لللدينا، ونحن تسليم، معربا عن GFP البلازميدات (pCAG-GFP وpCAG-لجنة المساواة العرقية: GFP) إلى مواقع محددة في الجنين. وتمشيا مع دراسة سابقة 11، تم الكشف عن خلايا GFP + في الأجنة 1-2 ساعة بعد Electroporation لل(الشكل 2E و2G). عندما تم electroporated خلايا الأديم الظاهر البعيدة في أواخر مرحلة بدائية خط الجنين، أسهمت الخلايا المسمى إلى الأديم الظاهر العصبي بعد 24 ساعة في الثقافة (الشكل 2E و2F). هذه النتيجة تتطابق تماما لخرائط مصير معروفة من خلايا الأديم الظاهر في تكون المعيدة مرحلة الأجنة 17. وبالمثل، عندما تم electroporated البلازميد GFP التعبير في خط البدائي في E8.5 (2-5 القطع البدنية النمطية)، GFP + الخلايا ساهمت في الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور (الشكل 2G و 2H)، بما يتفق مع خرائط مصير المعروفة المغفور له خط بدائي 18 . وعلاوة على ذلك، لاحظنا مساهمة إلى كل الطبقات الجرثومية الثلاث من خلايا electroporated (الشكل 2I-K)،مما يشير إلى أن هذا الإجراء Electroporation لللا يضر سلوك الخلية في الجسم الحي. ومع ذلك، لاحظنا أيضا أنه بينما الأديم الظاهر (E7.5) أو خلايا متتالية البدائية (E8.5) استهدفت، تم electroporated بعض خلايا الأديم أيضا (الشكل 3C والجدول 1). واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام نظام الكهربائي الشعري هو أن عدد الخلايا electroporated يمكن السيطرة، وذلك ببساطة عن طريق تغيير قطر من افتتاحه. لتحديد عدد الخلايا electroporated، والأجنة ثابتة 2 ساعة بعد Electroporation للوتصوير في wholemount على المجهر متحد البؤر. وقد أحصى عدد الخلايا GFP + يدويا في مبائر ض المداخن. ويبين الجدول 1، بالنسبة للمرحلة معينة، وزيادة حجم افتتاح الزجاج الشعرية 20-30 ميكرومتر النتائج في امتصاص الحمض النووي عن طريق المزيد من الخلايا. عندما تم مقارنة حجم فتحة واحدة بين المراحل (E7.5 مقابل E8.5)، تم العثور على أكثر من الخلايا إلى أن electroporated في المرحلة الأخيرة. قد يكون راجعا إلى تركيز أعلى من الحاضر DNA في التجويف الذي يحيط بالجنين في E8.5 هذا التأثير. لأنه تم خلط محلول الحمض النووي مع صبغة الطعام الخضراء، يمكننا استخدام اللون الأخضر لتقييم تركيز الحمض النووي في التجويف الذي يحيط بالجنين. في المجهر، فمن الواضح أن، بالمقارنة مع الأجنة E8.5، واللون الأخضر بعد حقن الحمض النووي هو أخف بكثير في تجويف الأجنة E7.5. وعلى الرغم من حقن نفسه تركيز محلول الحمض النووي في E7.5 E8.5 والأجنة، كان أكثر محلول الحمض النووي في التجويف الذي يحيط بالجنين من الأجنة E8.5 من أجل ملئه تماما لأنها أكبر في الحجم. بعد سحب إبرة الحقن، هناك دائما درجة من تسرب محلول الحمض النووي من تجويف الذي يحيط بالجنين، ومنذ ثقب ثقب أكبر بالمقارنة مع حجم التجويف الذي يحيط بالجنين في الأجنة السابقة، فمن المرجح أن هناك متناسب المزيد من التسرب من E7.5 من الأجنة E8.5، مما يؤدي إلى تركيز الحمض النووي أقل. عدد مختلف من transfectedيمكن أن تكون خلايا أيضا يرجع إلى أقطار مختلفة أو الناجم عن الجهد عبر الغشاء (ITV) عتبات الخلايا في مراحل مختلفة. ومن عيوب Electroporation للهو موت الخلايا المرتبطة بها. وعلى غرار الذهب مطلي التقليدي أو الأقطاب الكهربائية على شكل إبرة، Electroporation للاستخدام القطب الشعرية يسبب أيضا موت الخلية. بعد Electroporation للبدت المنطقة المستهدفة أكثر قتامة في اللون بالمقارنة مع المناطق المجاورة (3A الشكل و3B)، مشيرا إلى أن درجة معينة من موت الخلايا يجب أن يكون حدث في هذا المجال. لمزيد من تحديد عدد من الخلايا الميتة التي تسببها الإجراء Electroporation لل، كانت ملطخة الأجنة مع خلية غشاء كتيمة صبغة الفلورسنت النووي. وصفت نوى الخلايا الميتة مع بعيدة الحمراء صبغ مضان غشاء كتيم. أكد تلطيخ أن هذه التقنية Electroporation للالشعرية النتائج إلا في عدد قليل من الخلايا الميتة بالقرب من موقع Electroporation لل(الشكل 3D وتابلي 1). لاحظنا أنه على الرغم من الخلايا الميتة تظهر في موقع Electroporation لل، GFP + الخلايا والخلايا الميتة هي أيضا الأكثر تميزا من كل منهما (الشكل 3E و3F). وعلاوة على ذلك، عندما تم electroporated في الأديم الظاهر الجانبي الذيلية في E8.5 مع pCAG-GFP وفتح الزجاج الشعرية من 20μm، وعدد كبير من الخلايا GFP + تم الكشف بعد 48 ساعة في الثقافة (الشكل الجيل الثالث 3G و3H). معا، وهذه النتائج تشير معظم GFP + الخلايا المكتشفة 2 ساعة بعد Electroporation لللا تزال قابلة للحياة خلال ثقافة أخرى. سجلنا عدد GFP + الخلايا بعد 24 ساعة فيفو السابقين الثقافة. تم electroporated ستة أجنة مع pCAG-GFP في E7.5، وذلك باستخدام افتتاح الشعرية بقطر 20μm. 107 ± 31 (يعني ± SD) تم الكشف عن GFP + خلية / جنين. منذ في بداية ثقافة (2 ساعة)، تم electroporated 9 خلايا في المتوسط ​​في الجنين ( <s<html> ترونج&gt; الجدول 1)، وهذا يشير إلى أن الخلايا electroporated خضعت 3-4 الانقسامات داخل 2 ساعة. متوسط ​​الخلية مضاعفة الوقت من E7.5 إلى الأجنة E8.5 حوالي 6-7 ساعة في جميع الخلايا وبصرف النظر عن تلك الموجودة في العقدة بطني 19،20. وهذا يشير إلى أن هذا الإجراء Electroporation لللا يعيق نمو الخلايا العادية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> الشكل 1. الدائرة رسم بياني يظهر الإعداد Electroporation للتم وضع الحل DNA الجنين تحتوي في تجويف لها السلوي بين القطبين. التيار في اختيار المعلمات تم توفيرها من قبل مولد نبض موجة مربع (التيار الكهربائي). تم توصيل المتعدد في سلسلة للكشف عن التيار الكهربائي يمر الجنين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> jove_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> الشكل 2. توزيع الخلايا المطعمة أو electroporated في الأجنة المضيفة. (AH) تراكب GFP مضان (الأخضر) على الصور brightfield الأجنة wholemount (الرمادي) (A) والمطعمة 10-16 GFP + EpiSCs في المنطقة البعيدة في وقت متأخر والمطعمة -streak مرحلة الجنين. (C) A أجمة أكبر من GFP + EpiSCs في المنطقة البعيدة من جنين مرحلة منتصف متتالية. (B و D) توزيع EpiSCs الخلايا المشتقة (الأخضر) في الأجنة المضيفة (كما هو موضح في وأسفرت وC) بعد 24 ساعة في الثقافة. (B) GFP + الخلايا المتفرقة في الجنين المضيف، مما يدل على التكامل الصحيح من الخلايا المانحة. (D) تطعيم أكبر كتل الخلايا في تشكيل أجمة غير مدمج في الجنين المضيف. (EK) pCAG-لجنة المساواة العرقية: GFP البلازميد ايلى<html> ctroporated في مجالات محددة من الأجنة wildtype. Electroporating المنطقة البعيدة من مرحلة الجنين برعم المبكر (E) أو خط بدائي من 2-5 الجسيدة مرحلة الجنين (G) أسفرت عن GFP + الخلايا في هذه المناطق 2 ساعة بعد العملية. (F و H) توزيع GFP + الخلايا في الأجنة المضيف بعد 24 ساعة في الثقافة، والتي تبين أن الخلايا electroporated تساهم في الأديم الظاهر العصبي (السهم الأسود) (F) والأديم المتوسط ​​المجاور للمحور (السهم الأبيض) (H). (IK) DAB المناعية للGFP + الخلايا تبين أن الخلايا electroporated يمكن أن تؤدي إلى الأديم الظاهر العصبي (I)، الأديم المتوسط ​​(J) والأديم الباطن (J و K) بعد 24 ساعة في الثقافة. شريط النطاق (AH) = 250 ميكرون. شريط النطاق (IK) = 100 ميكرون. ملاحظة: يتم طبع 1A الشكل و1B من وجهة نظرنا نشر السابق 4.أ href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; الهدف = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> الشكل 3. توزيع GFP + الخلايا والخلايا الميتة في الأجنة بعد Electroporation لل(AC) pCAG-لجنة المساواة العرقية: GFP البلازميد electroporated إلى خلايا الأديم الظاهر الجانبية الذيلية من E8.5 (2-5 مرحلة الجسيدة) الجنين (الشعرية حجم الافتتاح : 20 ​​ميكرون) (A) 2 ساعة بعد العملية، أظهرت المنطقة المستهدفة داكنة اللون (أبيض السهم) بالمقارنة مع أجزاء أخرى من الجنين. يظهر أقحم لتوسيع المنطقة electroporated. (B) صورة Brightfield (الرمادي) مضافين مع قناة الفلورية الخضراء تظهر الخلايا electroporated (الأخضر). (C) A متحد البؤر Z-شريحة تبين أناستغرق خليتين الأديم الباطن (الأخضر) أيضا البلازميد عندما تم استهداف خلايا الأديم الظاهر الجانبية الذيلية. وتظهر نواة الخلية باللون الأحمر (DF) pCAG-لجنة المساواة العرقية: تم electroporated البلازميد GFP في الجانب الذيلية للعقدة من جنين E8.5 (الشعرية حجم الافتتاح: 30 ميكرون). تم تربيتها الجنين لمدة 2 ساعة. وتظهر الخلايا Electroporated في الخلايا الخضراء والميتة باللون الأحمر. (D) وتحتوي المنطقة على حد سواء electroporated GFP + الخلايا وكذلك الخلايا الميتة. تم تحليل المجال في مربع أبيض أيضا في المجهر متحد البؤر. أظهر العد والفرز اليدوي لض المكدس أن هناك 33 GFP + الخلايا و23 الخلايا الميتة في هذا المجال. وكانت خليتين فقط إيجابية لكلا fluorophores. (E و F) عرض XYZ من مبائر Z-شريحة من منطقة محاصر البيضاء في D تظهر الخلايا GFP + منفصلة من الخلايا الميتة. وتظهر نوى في الزرقاء (G و H) pCAG-لجنة المساواة العرقية: تم electroporated GFP البلازميد في عدد قليل من سلليرة سورية في الأديم الظاهر الجانبي الذيلية للجنين E8.5 (الشعرية حجم الافتتاح: 20 ميكرون)، وتصويرها بعد يومين (G) و 48 (H) ساعة فيفو السابقين الثقافة ملاحظة: قطعت (H) الجنين في اثنين بعد الثقافة. تم إزالة مناطق الرأس والقلب. شريط النطاق (A، B، D، G و H) = 250 ميكرون. شريط النطاق (C، E و F) = 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> قطر افتتاح أنبوب شعري </td><td> مرحلة الجنين </td><td> كفاءة Electroporation لل: لا. أجنة تحتوي على GFP + الخلايا بعد 2H / مجموع لا. أجنة electroporated (رقم GFP + الأجنة التي وضعت بشكل طبيعي بعد 24 أو ثقافة 48H) </td><td> متوسط ​​عدد GFP + الخلايا في الجنين ± SD (ن = عدد الأجنة فحص) </td><td> عددGFP + الأديم الباطن الخلايا في كل جنين ± SD (ن = عدد الأجنة فحص) </td></tr><tr><td> 20μm </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (ن = 4) </td><td> 4 ± 2 (ن = 4) </td></tr><tr><td> 30μm </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 13/15 (12) </td><td> 17 ± 2 (ن = 4) </td><td> 6 ± 1 (ن = 4) </td></tr><tr><td> 20μm </td><td> E8.5 (2-5 القطع البدنية النمطية) </td><td> 12/13 (10) </td><td> 21 ± 4 (ن = 4) </td><td> 11 ± 4 (ن = 4) </td></tr><tr><td> 30μm </td><td> E8.5 (2-5 القطع البدنية النمطية) </td><td> 02/02 (2) </td><td> 33 و 26 (ن = 2) </td><td> 14 و 16 (ن = 2) </td></tr></tbody></table> الجدول 1. كفاءة Electroporation للمن pCAG-لجنة المساواة العرقية: البلازميد GFP في أجنة الفئران. اختصار: LS، أواخر مرحلة متتالية البدائي؛ LB: مرحلة أواخر مهدها. ونظموا الأجنة وفقا لوهبوطا ديفيز 12

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

methods-for-precisely-localized-transfer-cells-or-dna-into-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Views.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Video: Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى Electroporation لل

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة<em&gt; خنفساء الدقيق الحمراء</em&gt; الأجنة

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

استخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد ثلاثي الأبعاد رواية لتوصيف الحمل المبكر في الماوس

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

تحليل عيوب القلب الخلقية في أجنة الفئران باستخدام أساليب النسيج النوعي والكمي

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...