هذا هو بديل وسهلة الاستخدام طريقة لتقديم الجينات ذات الأهمية لبيض الماوس المخصبة عن طريق ثقب الليزر من zona pellucida وتسليم الجينات العدسي. وقد ينطبق أيضاً إنثقاب الماوس بمساعدة الليزر على البيض المخصب لأنواع أخرى لتيسير إدخال أنواع أخرى من الفيروسات أو الكواشف المُنْوعة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب مهارات متخصصة للصغر الحقن الدقيق وصغر حجم بويضات الفأر المخصبة.
سوف يدل على إجراء عزل بيضة الماوس المخصبة يكون الصفحة مايرز، وهو عالم أبحاث من فرع الطب المقارن في NIEHS. 16 إلى 24 ساعة بعد التزاوج، وعزل المبيضين وovaducts من الفئران الإناث مع المقابس المهبلية، وفقا للبروتوكولات القياسية. عندما يتم جمع جميع الأنسجة ، المسيل للدموع أمبولا كل المبيض وبصرف النظر ، والإفراج عن البويضات المخصبة ، وتحيط بها الخلايا الكمولية ، ونقل البيض في الخلايا الكمية إلى طبق 35 ملليمتر تحتوي على واحد x hyaluronidase في M2 المتوسطة الطازجة ، لمدة ثلاث إلى خمس دقائق الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
الماصات البيض عدة مرات للافراج عن الخلايا الكمونة، ونقل البيض إلى طبق جديد 35 ملليمتر يحتوي على M2 المتوسطة، مع الأنابيب لغسل قبالة الانزيم. بعد ذلك، نقل البيض غسلها في طبق 35 ملليمتر تحتوي على البوتاسيوم البسيط المتوسطة الأمثل، أو KSOM، وماصة لغسل قبالة M2 المتوسطة المتبقية وhyaluronidase. ثم, نقل البيض إلى 35 ملليمتر الأنسجة ثقافة لوحات المعالجة بذر مع 50 ميكرولترات من KSOM واثنين من ملليلتر من dimethylpolysiloxane لمدة ساعتين التوازن في 37 درجة مئوية, 5٪ ثاني أكسيد الكربون والأكسجين, و 90٪ النيتروجين.
في حين أن البيض في الحاضنة، وإعداد ومعايرة ليزر XYClone، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. عندما البيض على استعداد، وضع أول لوحة قطرة على مرحلة المجهر الليزر، والتركيز يدويا في pellucida زونا. بعد التأكد من أن ضوء LED الليزر مرئي من خلال الهدف، حرك مرحلة المجهر لاستهداف الزونا بالليزر LED، واستخدام برنامج الكمبيوتر لتعيين ليزر XYClone إلى 250 ميكرو ثانية.
ضبط حجم ضوء LED إلى الأبعاد المناسبة، وثقب pellucida زونا من كل بيضة ثلاث مرات مع الليزر لإنتاج ثلاثة ثقوب 10 ميكرومتر. من المهم إجراء ثقب بسرعة ، ولكن بعناية ، حيث لا يمكن للبويضات المخصبة الاحتفاظ بها خارج الحاضنة لأكثر من 15 دقيقة. ثم، إعادة البيض المثقب إلى الحاضنة لمدة ساعتين اخرين.
في نهاية الحضانة الثانية، علاج 50 ميكرولتر KSOM قطرة مع اثنين من microliters من فيروس العدس المركزة دون خلط. وإرجاع البيض إلى الحاضنة لمدة أربعة أيام. عندما تطورت البويضات إلى الكيسات الأرومية، استخدم جهاز نقل الأجنة غير الجراحي، لإيداع ما يقرب من 10-15 جنينًا في حوالي جهازين ميكرولتر من KSOM.
بعد 17 يوما من نقل الجنين، اسمح للفأر الحامل بالولادة بشكل طبيعي أو جمع حديثي الولادة عن طريق العملية القيصرية حسب الضرورة. ثم، وجمع الأنسجة من الجراء لgenotyping، لتحديد معدل تسيس. يمكن فحص تطوير البويضة المخصبة بالماوس المعزولة والمتحولة تحت المجهر يوميًا.
60 إلى 70٪ من الأجنة الصحية غير المعالجة تتطور إلى الكيسات الأرمستية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام. في حين أن حوالي 47٪ من الأجنة المثقوبة بالليزر، والمتحولة تتطور إلى الكيسات الأرمثة، 85٪ منها تعبر عن الجين المُزَنَّق من الاهتمام. تهدف الليزر إلى رقيقة زونا، بدلا من خلق ثقب، ويسمح للأجنة النامية للاستفادة من سليمة، وتغليف زونا pellucida في حين تبقى متساهلة إلى تحويل فيروسات عدسي.
تحويل مع فيروس عدس المؤتلف، والتعبير عن copepod GFP من عامل استطالة 1 A المروج يحفز التكاملات العدسي متعددة، وتعبيرا عاليا من GFP تحت مصباح الصمام الأزرق. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أنه ، في حين أن قدرة فيروسات العدس على الاندماج في الجينوم المضيف يجعلها أداة قوية لتسليم الجينات المستقرة ، ولكن التكامل العشوائي قد يدخل أيضًا طفرات ادخائية. ويمكن لهذه التقنية أن تمكن الباحثين في مجال علم الوراثة من تطوير نماذج حيوانية محورة وراثيا بسرعة لدراسة المرض لإنتاج البروتين في الجسم الحي، أو لدراسات الجينات الوظيفية.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية على عينات الأنسجة المعزولة من الجراء المستحثة للإجابة على أسئلة إضافية حول موقع ومدى التعبير الجيني في الأنسجة المختلفة ذات الاهتمام. لا تنسى أن العمل مع فيروسات العدس يمكن أن تكون خطرة للغاية. لذلك يرجى اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية الخاصة بك للعمل مع فيروسات العدس.
ارتداء الملابس الواقية الشخصية وإزالة التلوث جميع النفايات قبل التخلص منها.
