We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com os Regulamentos do Reino Unido Escritório conforme especificado nas Animais (Scientific Procedures) Act (1986) sob o número 60/4435 Projeto de licença. Para a coleta de embriões em estágios específicos de desenvolvimento, acasalamentos cronometrados foram criadas O / N. Meio-dia no dia de encontrar um rolhão vaginal foi designado dia embrionário (E) 0.5. 1. Dissecando o E7.5 ou E8.5 pós-implantação de embriões para Ex Cultura Vivo <ol><li> Sacrificar os ratos fêmeas grávidas por deslocamento cervical. </li><li> Isolar o útero usando uma tesoura, segurando-o com uma pinça e coloque em um prato de 30 milímetros preenchido com meio M2. </li><li> Retire com cuidado para além do miométrio usando dois pares de fórceps finos. </li><li> Descascar a decídua, tomando cuidado para não perfurar as cavidades extraembryonic. </li><li> Remover a membrana de Reichert, apertando-a com uma pinça e, lentamente, separando-o do embrião. </li><li> Confira os embriões sob uma dissecaçãoestereomicroscópio para assegurar que o saco vitelino, âmnio e cone ectoplacental estão intactos. </li><li> Transferir os embriões para um prato limpo de M2 ​​usando uma pipeta e coloque em uma tampa de plástico 30 milímetros placa de Petri sobre gelo (a &#39;plataforma de gelo&#39;) para embriões parcialmente frio. </li><li> Se necessário, armazenar embriões em m2 sobre uma plataforma de gelo durante até 1,5 h, por exemplo., Durante a preparação ou a manipulação de pequenos lotes de meios de ~ 3-4 embriões à TA. Nota: Recuperação e dissecação de embriões de roedores tem sido descrito em detalhe anteriormente 7,8,16. </li></ol> 2. Prepare o embrião Meio de Cultura <ol><li> Recentemente descongelar quer comercialmente disponíveis-soro de rato (ver Glanville-Jones et ai. 13 de especificações) ou soro de rato preparado em casa de acordo com Copp Cockcroft e 16 que foi inactivado pelo calor durante 30 min a 56 ° C e congelado em 1 ml alíquotas a -80 ° C Nota: disponíveis comercialmente soro de rato é aceitável<html> por períodos de cultura de 24-36 horas, embora soro preparados em casa é, em nossa experiência, superior para períodos de cultura até 48 horas. </li><li> Recentemente preparar um excesso (por ex., 10 ml) de suplementos definidos que consistem em Meio Essencial Mínimo de Glasgow (GMEM), 1% de não-aminoácidos essenciais (NEAA), 2 mM de L-glutamina e piruvato de sódio 1 mM. </li><li> Calcular o volume de meio de cultura que é necessária de acordo com o número de embriões de cada fase que vão ser cultivadas (ver secção 3). Misturar o soro de rato com os suplementos definidos para perfazer 50% de meio de cultura (1: 1 (v / v) de soro de rato: suplementos definidos) e / ou 75% de meio de cultura (3: 1 (v / v) de soro de rato: definida suplementos). </li><li> Passar o meio de cultura de embriões através de um filtro de 0,45 um e adicionar 10.000 UI / ml de penicilina e 10 ug / ml de estreptomicina. Nota: solução de L-glutamina e piruvato de sódio recentemente descongelado é crucial para o desenvolvimento do embrião durante a cultura ex vivo. </li></ol>e &quot;&gt; 3. ex vivo Cultura Condições para diferentes estágios embrionários <ol><li> Para os embriões E7.5: cultura estática utilizando placas de 4 poços em uma incubadora fornecido com 5% de CO2 em ar a 37 ° C durante 24 h. Cultura até dois embriões por poço em 1 ml de 50% de meio de cultura. </li><li> Para os embriões E8.5: utilizar um aparelho de cultura de rolos 8 que roda a 35 rotações / min incorporando gaseificação contínua com 5% de CO 2 no ar a 37 ° C durante 24 horas (1 ml de 50% de meio de cultura por embrião). </li><li> Para os embriões E9.5: utilizar um aparelho de cultura de rotação do rolo em 35 rotações / min incorporando gases fornecidos com 5% de CO2, 40% de O 2 55% de N2 a 37 ° C durante 24 horas (1 ml de 75% de meio de cultura por embrião). Nota: embriões cultura dentro de 3 horas após a eutanásia dos ratos como períodos prolongados em M2 afetar adversamente o desenvolvimento. Ver Copp Cockcroft e 16 para o método de cultura ex vivo embrião. </li></ol> 4. Grafting células cultivadas em E7.5 ou E8.5 embriões de camundongos <ol><li> Fisicamente raspar EpiSCs, que expressam GFP ubiquamente, a partir de uma placa de cultura de 6 poços utilizando uma pipeta de ponta de 20-200 ul e colocá-los em um prato 30 de mM contendo os embriões Nota: Para inserir aglomerados de células nos embriões, as células devem ser fisicamente sucateados em vez de tripsina. </li><li> Anexar um enxerto capilar mão-puxado para o tubo do aspirador para fazer uma pipeta de boca. </li><li> Gentilmente sugar a pipeta de boca para chamar um ou mais aglomerados de células de tamanho&gt; 20 células no capilar enxertia. </li><li> Suavemente soprar as células, para dispersar parcialmente grandes aglomerações. </li><li> Selecione um amontoado de células contendo ~ 10-20 células e chupar no capilar enxerto de novo, mantendo-o perto da abertura do capilar. Tenha cuidado para não mover o amontoado de células dentro e fora do capilar repetidamente, para evitar a ruptura em pedaços menores. </li><li> Segurar frouxamente o embrião no lugar com um par de pinças e inserir o enxertocapilar na região de interesse para criar uma abertura. </li><li> Gentilmente expulsar o moita fora do enxerto capilar, deixando a seqüência curta de 10-20 células apresentados no embrião. </li><li> Repetir o procedimento de enxerto para o número desejado de embriões. Use o tamanho dos lotes de embriões 3-4 por conveniência. </li><li> Deixando de embriões no mesmo prato de meio M2, imagem os embriões enxertados usando um composto de fluorescência dissecando microscópio com câmera, mantendo o tempo de imagem ao mínimo, para evitar a exposição dos embriões à luz e calor excessivos. Nota: determinar os tempos de imagem empiricamente como estes dependerá das especificações da câmara e microscópio, assim como a natureza e a intensidade de fluorescência do fluoróforo. </li><li> Transferir o embrião num pastette com um volume mínimo de meio M2 para pré-equilibrada meio de cultura (ver secção 3) imediatamente depois de imagiologia. Nota: Examine cuidadosamente a morfologia dos embriões após a enxertia. Só a cultura INTACembriões t. </li></ol> 5. Materiais Handmade Eletroporação e Configuração Aparelho (Prepare os seguintes itens antecipadamente de Experimentos eletroporação): <ol><li> Para ADN pipetas de injeção: puxe pipetas de injeção de DNA usando uma micropipeta extrator horizontal. Pipetas de injecção devem ter uma ponta fina com uma abertura inferior a 10 um, para evitar danos nos tecidos quando se injecta o DNA no interior das cavidades embrionárias. </li><li> Por electroporação de vidro capilar: utilizar um microforge para cortar a abertura de pipetas de injecção de ADN para um diâmetro interno de 20 ou 30 um. Para evitar o dano celular quando o capilar está em contacto com o embrião por electroporação, a ponta do capilar de vidro deve ser cortado de forma limpa e não conter bordas afiadas, quebradas. </li><li> Para eléctrodo capilar artesanal (ânodo) (Figura 1): inserir um diâmetro de fio de platina 0,2 mm num capilar de vidro de electroporação com uma abertura fixa de 20 ou de 30 um de diâmetro para focar os eleitosric corrente e entregar o ADN de plasmídeo de uma pequena região de interesse no embrião. </li><li> Para eléctrodo em forma de L artesanal (cátodo) (Figura 1): curvar um fio de platina diâmetro 0,2 mm a criação de um &quot;L&quot;, com a parte horizontal do &quot;L&quot; de cerca de 1 mm de comprimento. </li><li> Prenda cada eletrodo de platina a um fio isolado fina e inseri-lo em um suporte de agulha microinjeção coberta por fita isolante. </li><li> Monte os suportes da agulha sobre detentores do instrumento micromanipulação padrão. </li><li> Ligue o circuito como mostrado na Figura 1: ligar o eléctrodo capilar para o ânodo da fonte de alimentação; ligar o eléctrodo em forma de L para o ânodo do multímetro; conectar o cátodo do mulimeter para o cátodo da fonte de alimentação. </li></ol> 6. Eletroporação E7.5 ou E8.5 embriões de camundongos <ol><li> Encher o capilar de vidro electroporação com PBS para dentro de 1-2 mm do topo e inserir o straiGHT eléctrodo de platina (ânodo) para o capilar de vidro até atingir a parte inferior do tubo capilar. </li><li> Ancorar o eléctrodo em forma de L (cátodo) na superfície de uma placa de Petri 30 milímetros cheio com PBS. </li><li> Transferir o embrião do meio M2 para o prato eletroporação PBS-cheia. </li><li> Insira a agulha de injeção de epiblasto de lateral para dentro da cavidade amniótica do embrião. Usando uma bomba pneumática pico, injetar solução de ADN (pCAG-Cre: GFP ou pCAG-GFP 1-1,5 ug / ml, com 0,01% de corante corante alimentar verde) dentro da cavidade até que esteja completamente cheio. Para os embriões E7.5-E8.5, solução de ADN inferior a 5 ul é necessário para um embrião. Usando o corante verde como um indicador, tenha cuidado para não estourar o embrião. </li><li> Posicionar cuidadosamente o embrião entre os eléctrodos e mover o eléctrodo capilar para o local exacto em que o ADN é para ser entregue. Nota: A orientação do embrião depende da região na qual o ADN é para ser electroporadas. </li><li> Electropoavaliar o embrião usando 200 volts (V) em 6 pulsos, cada um dos 50 ms de duração com um intervalo de 1 segundo entre cada pulso. </li><li> Transferir o embrião de pré-equilibrada meio de cultura imediatamente após a electroporação. Se desejado, repetir o processo para o próximo embrião. Nota: Adicione o meio de cultura em um recipiente estéril e colocá-lo na incubadora de cultura de pré-equilibrar o meio. </li><li> Para detectar células electroporated 2 horas após cultura, transferir os embriões para uma limpeza 30 milímetros placa de Petri de meio M2 usando uma pastette. Imagem os embriões como no passo 5,9 utilizando um composto de fluorescência dissecando microscópio. </li><li> Transferir os embriões de volta para a cultura utilizando um pastette imediatamente depois de imagiologia. </li><li> Para detectar células mortas causadas por electroporação, manchar os embriões com uma célula de corante vermelho-extremo impermeável à membrana nuclear (1: 200 em meio de cultura de embriões) a 37 ° C durante 10 min, 2 horas após a electroporação (Opcional) </li><li> Para contar as células electroporadas, corrigir o Embryos em 4% de paraformaldeído (PFA) para 2-4 horas a 4 ° C, manchar o núcleo com um ultravioleta ou vermelho-extremo contraste nuclear fluorescente e imagem os embriões utilizando um microscópio confocal (Opcional). Nota: o crescimento embrionário é adversamente afetada se deixado muito tempo em PBS. Portanto, certifique-se de que o tempo necessário para electroporate cada embrião é minimizado (&lt;5 min por embrião). </li></ol>

<ol>
	<li>O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+asthma+control+in+pediatric+patients+after+discontinuation+of+long-acting+Beta-agonists.">Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists.</a> Pulmonary med. , 894063 (2012).</li><li>Brons, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448, 191-195 (2007).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448, 196-199 (2007).</li><li>Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+differentiation+potential+of+epiblast+stem+cells+revealed+by+chimeric+embryo+formation.">In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation.</a> Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).</li><li>Sadik, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+relationship+and+optimization+of+double-pulse+electroporation.">Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation.</a> Biophys. J. 106, 801-812 (2014).</li><li>Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conceptual+and+technical+aspects+of+transfection+and+gene+delivery.">Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).</li><li>Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein+4+signaling+regulates+development+of+the+anterior+visceral+endoderm+in+the+mouse+embryo.">Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo.</a> Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).</li><li>Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+prepancreatic+endoderm+by+whole+embryo+electroporation.">Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation.</a> JOP. 6, 128-135 (2005).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+cell+markers+into+germ+layer+tissues+of+the+mouse+gastrula+by+whole+embryo+electroporation.">Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation.</a> Genesis. 35, 57-62 (2003).</li><li>Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-Mapping+Technique:+Targeted+Whole-Embryo+Electroporation+of+DNA+Constructs+into+the+Germ+Layers+of+Mouse+Embryos+7-7.5+Days+Post-coitum.">Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum.</a> CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Nolkrantz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+single+cells+and+tissues+with+an+electrolyte-filled+capillary.">Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary.</a> Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).</li><li>Mazari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdevice+to+locally+electroporate+embryos+with+high+efficiency+and+reduced+cell+damage.">A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage.</a> Development. 141, 2349-2359 (2014).</li><li>Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , (1990).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).</li><li>Wilson, V., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+and+morphogenetic+movement+in+the+late+mouse+primitive+streak.">Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak.</a> Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).</li><li>Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+progression+of+lineage+segregations+during+mammalian+embryogenesis+by+clonal+analysis.">Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis.</a> Dev Cell. 17, 365-376 (2009).</li><li>Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+in+mammalian+gastrulation:+the+ventral+node+and+notochord+are+relatively+quiescent.">Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent.</a> Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).</li><li>Tsakiridis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Wnt-driven+primitive+streak-like+populations+reflect+in+vivo+lineage+precursors.">Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors.</a> Development. 141, 1209-1221 (2014).</li><li>Gouti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+neuromesodermal+progenitors+reveals+distinct+roles+for+wnt+signalling+in+the+specification+of+spinal+cord+and+paraxial+mesoderm+identity.">In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity.</a> PLoS biology. 12, e1001937 (2014).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120, 613-620 (1994).</li></ol>

The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

Enxerto O passo crítico para os experimentos de enxerto de células é a inserção de uma seqüência coerente de células idealmente em uma única ação, para evitar a dissolução da moita. Esta técnica requer alguma prática no controle da pipeta boca. Se as células doadoras incorporar bem no hospedeiro, os seus derivados irá dispersar no embrião. Para determinar adicionalmente se as células derivadas de dadores diferenciar apropriadamente disperso no hospedeiro, pode ser realizada a imunocoloração nas secções de embrião. Se as células doadoras não são compatíveis com o meio de acolhimento, ou eles podem não ser detectados (como eles são expelidos a partir do embrião), ou formar aglomerados não incorporados nos embriões após cultura. Se foram observados tanto em células dispersas e aglomerados de células, isso pode indicar que muitas células foram enxertados e excessivas células dadoras que não pode interagir com células hospedeiras circundantes resultaram em formação moita. Neste caso, os enxertos contendo adicionaisum menor número de células pode ser realizada. A principal limitação da técnica de enxerto de células é que não é possível determinar o potencial in vivo de células de rato desde cultura ex vivo durante períodos mais longos do que 48 horas não foi alcançado. No entanto, se combinado com a injecção das células guiada por ultra-sons, pode ser possível a transferência de células de cultura para os embriões no útero. Para resumir, experimentos com células do miocárdio têm sido amplamente utilizados em nosso grupo e nos deram pistas valiosas sobre o potencial in vivo de vários tipos de células 4,21,22. É uma técnica de utilidade geral para avaliar o potencial in vivo de células cultivadas in vitro em embriões precoces após a implantação. Eletroporação Embora neste estudo mostraram apenas que é eficaz para utilizar a técnica de electroporação capilar para direccionar o epiblast, it também é possível atingir intencionalmente outras camadas germinativas, tais como células da endoderme. O passo crítico para a técnica de electroporação capilar é minimizar o tempo necessário para electroporar cada embrião (&lt;5 minutos por embrião) desde PBS é muito abaixo do ideal para embriões de rato. Nossos dados acima mostrou que, na maioria das áreas em que os embriões, eletroporação não afeta o crescimento do embrião. No entanto, a electroporação no nó desenvolvimento anormal causado e levou à morte prematura do embrião. Isto é provavelmente devido a danos ou morte das células que formam centros de sinalização importantes 23. Assim, esta região teria de ser evitado com esta técnica. Outra ressalva é que, como mencionado na seção de resultados, enquanto epiblasto ou células linha primitiva foram alvo, algumas células da endoderme foram também electroporado. Isso pode ser porque DNA chega à endoderme através de vãos sob o epitélio epiblasto. Endoderme é composto por células epiteliais e na nossa experiência these células têm uma maior propensão para assumir DNA. Portanto, ao aplicar esta técnica para o mapeamento de destino, é importante avaliar quais as células inicialmente ocupar DNA. Deve também ser notado que embora pCAG-GFP e pCAG-Cre: plasmídeos de GFP pode ser eficientemente entregues usando os parâmetros de electroporação mostrado neste estudo, a eficácia de outros arquétipos de ADN pode variar e optimização precisa indivíduo. As alterações na concentração de DNA, electroporação tensão ou o número de impulsos pode ser feita se plasmídeos encontram-se a ser difíceis de transfectar. Para resumir, o nosso sistema de electroporação capilar de forma eficiente e optimizada pode proporcionar de forma reprodutível GFP ou Cre: plasmídeos GFP em muito poucas células do embrião com a morte celular limitada. Uma vez que este método não requer equipamento caro ou altamente especializado, que pode ser de grande utilidade para os estudos de seguimento de células ou em testar o efeito da expressão ectópica ou o apagamento condicionalf genes em embriões precoces, se a electroporação é realizada de embriões portadores de alelos mutantes condicionais floxed. Portanto, esta técnica de electroporação fornece uma ferramenta útil para a compreensão funcional numa base de célula-por-célula os papéis de factores de células-intrínseca no contexto de ambientes embrionárias de tipo selvagem localizada.

A cultura de células tem sido amplamente utilizado em estudos de biologia do desenvolvimento. Mouse células estaminais embrionárias (CES) e de células estaminais (EpiSCs epiblast) pode diferenciar-se em todas as três camadas germinais in vitro e são um modelo útil para a diferenciação de células de mamífero na embriogénese precoce. A derivação destas linhas celulares, abriu uma oportunidade para a manipulação in vitro e investigação detalhada dos eventos localizada sinalização e redes de transcrição que operam durante a modelagem embrionária precoce. No entanto, continua a ser importante para determinar a relevância in vivo de quaisquer manipulações realizadas em cultura. O potencial in vivo de rato CES derivadas de embriões pré-implantação foi avaliada através da introdução-los de volta em embriões pré-implantação (mórulas ou blastocistos) 1. No entanto, EpiSCs que representam as células do epiblasto em embriões postimplantation não pode integrar de forma eficiente em embriões pré-implantação 2,3. Nossa previonos resultados demonstraram que EpiSCs pode gerar de forma eficiente quimeras e contribuir para todas as camadas germinativas, quando enxertados em embriões postimplantation 4. Assim, a melhor maneira de avaliar as células cultivadas in vitro é apresentá-los ao seu ambiente in vivo correspondente. A electroporação é um método amplamente utilizado para entregar moléculas exógenas em células alvo em tanto in vivo como em experiências in vitro. A energia eléctrica pode gerar um grande número de poros na membrana celular, o que permite que o ácido exógeno desoxirribonucleico (ADN) ou de ácido ribonucleico (ARN) para entrar nas células. Um dos maiores desafios para esta técnica é combinar viabilidade celular ideal com alta eficiência electrotransfection 5,6. Por electroporação de ácidos nucleicos em tecidos embrionários, banhados a ouro eléctrodos foram mais comumente utilizado, permitindo que a segmentação das células em uma ampla gama espacial 7-9. Para conseguir um mais locatransferência de genes lized, um eléctrodo em forma de agulha tem sido utilizada para obter um campo eléctrico focal 10,11. Usando este método, os autores demonstraram que, após a electroporação, células a cerca de 30-60 tinha tomado a construção de ADN 11. No entanto, parece que ajustar com precisão o número de células electroporadas permanece difícil, com um eléctrodo de largura fixa. A técnica de electroporação capilar foi usado para entregar os plasmídeos para células individuais 12-14. No entanto, esta técnica não foi aplicada para electroporating plasmídeos aos embriões ex vivo. Mais recentemente, um microdispositivo foi relatado para alguns localmente electroporar células distais viscerais endoderme (menos de 4 células) em embriões de ratinho após a implantação precoce 15. No entanto, ainda não se sabe se este dispositivo pode eficientemente alvo ectoderma e mesoderma ex vivo. Neste estudo, descrevemos dois novos métodos para avaliar a função celular e gênica em pós cedo-implantation embriões. Nós primeiro demonstrar como enxertar células cultivadas in vitro em locais definidos em embriões de rato para avaliar seu potencial in vivo. A integração das células enxertadas e seus descendentes, todas marcadas por uma marcação genética (por exemplo, uma proteína fluorescente verde (GFP), podem ser adicionalmente examinados por imunocoloração de proteínas específicas de tecidos 4. Em segundo lugar, descreve-se um método aperfeiçoado para entregar precisamente ADN a locais localizados no embrião através de electroporação. Em vez de utilizar um eléctrodo em forma de agulha, que inserido um fio fino dentro de uma ponta fina capilar de vidro, e demonstrar que esta modificação pode entregar o ADN a um pequeno número de células com elevada eficiência e limitada morte celular. Além disso, mostramos que utilizando capilares de vidro com diferentes tamanhos de abertura, podemos controlar o número de células electroporated. Portanto, acreditamos que este método pode ser de grande utilidade para estudar a modelagem embrionária precoce envolvendo um pequeno número océlulas f.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1172">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Forceps</td>
			<td style="width:275px;">Dumostar</td>
			<td style="width:275px;">T5390</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Dissecting stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">&#160;Zeiss</td>
			<td style="width:275px;">Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Stereomicroscope system with fluorescence&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Nikon</td>
			<td style="width:275px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted microscope with a digital camera</td>
			<td style="width:275px;">Olympus</td>
			<td style="width:275px;">Olympus BX61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Inverted confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:275px;">Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Low melting point agarose&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">11397863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">30mm Petri dishes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">121V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4-well plates</td>
			<td style="width:275px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:275px;">179820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">10010015&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">NICHIRYO</td>
			<td style="width:275px;">Nichipet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:275px;">685280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">SANYO</td>
			<td style="width:275px;">MCO-17AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Roller culture apparatus&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTC Engineering</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Syringe filters 0.45&#181;m, sterile&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">10462100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30549.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:275px;">SH30239.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:275px;">DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN&#160;</td>
			<td style="width:275px;">COLEMAN 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:347px;">Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:275px;">640798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">A5177-5EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Flaming/Brown micropipette puller&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:275px;">P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microforge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">De Fonbrune</td>
			<td style="width:275px;">BS030301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Pneumatic pico pump&#160;</td>
			<td style="width:275px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:275px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Microloader tips&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:275px;">5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">ECM 830 square wave pulse generator&#160;</td>
			<td style="width:275px;">BTX</td>
			<td style="width:275px;">45-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Green food coloring dye</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:275px;">C.I. 42053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td>
			<td style="width:275px;">Biotium</td>
			<td style="width:275px;">40060-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-Cre:GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#13776&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">pCAG-GFP&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Addgene</td>
			<td style="width:275px;">#16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Multimeter</td>
			<td style="width:275px;">Excel</td>
			<td style="width:275px;">XL830L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Micromanipulators&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Leitz&#160;</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">0.2mm diameter platinum wire&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:275px;">E404-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:275px;">Abcam</td>
			<td style="width:275px;">ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Goat anti-Chicken IgY, HRP</td>
			<td style="width:275px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:275px;">sc-2428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Dako</td>
			<td style="width:275px;">K3467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:347px;">A far-red fluorescence nuclear counterstain</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:275px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

Manipulação e cultura de embriões de rato é um poderoso contudo largamente subutilizadas tecnologia aumentando o valor deste sistema modelo. Por outro lado, a cultura de células tem sido amplamente utilizado em estudos de biologia do desenvolvimento. No entanto, é importante para determinar se as células cultivadas in vitro realmente representam em tipos de células in vivo. A enxertia em embriões de células, seguido por uma avaliação da sua contribuição durante o desenvolvimento é um método útil para determinar o potencial de células cultivadas in vitro. Neste estudo, descrevemos um método de enxerto de células para um local definido de embriões de ratos após a implantação inicial, seguida por cultura ex vivo. Apresentamos também um método de electroporação optimizado que utiliza capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a localização precisa e ajustamento do número de células que receberam ADN exógeno com tanto alta eficiência de transfecção e da morte celular baixo. Estas técnicas, que não necessitam de qualquer spequipamentos ecialized, render manipulações experimentais da gastrulação e organogénese embrião de rato em fase de arranque possível, permitindo a análise de compromisso em subpopulações de células cultivadas e o efeito de manipulações genéticas in situ na diferenciação celular.

Enxerto EpiSCs que expressam EGFP ubiquamente (R04-GFP, a partir de derivados E6.5 epiblast, e C2, derivados in vitro a partir mESCs) 4 foram raspadas manualmente a partir do prato de cultura e enxertados em diferentes locais de embriões E7.5 (Figura 2A). Os embriões foram cultivados ex vivo e analisadas após 24 horas. A distribuição das células do doador foi avaliada por microscopia de fluorescência. Se as células doadoras incorporada, elas proliferaram e seus derivados disperso dentro dos embriões hospedeiras (Figura 2B). Tem sido observado que os enxertos contendo 10-16 células incorporadas eficazmente nos embriões hospedeiras (Figura 2A, 2B) e, no entanto, mais do miocárdio células não resulta em melhor chimaerism. Em vez disso, as células enxertadas produzidos aglomerados não constituídas em sociedade (Figura 2C e 2D). Eletroporação Para umssess a eficiência de nosso sistema de eletroporação, entregamos-expressando GFP plasmídeos (pCAG-GFP e pCAG-Cre: GFP) para locais específicos do embrião. Consistente com um estudo anterior 11, as células GFP + foram detectados em embriões de 1-2 horas após a electroporação (Figura 2E e 2G). Quando as células do epiblasto distais na tarde primitivo embrião estágio raia foram electroporadas, células marcadas contribuiu para o ectoderma neural após 24 horas em cultura (Figura 2E e 2F). Esse resultado corresponde bem aos mapas destino conhecido de células do epiblasto em gastrulação embriões em estágio 17. Da mesma forma, quando a expressão de GFP plasmídeo foi electroporado na linha primitiva em E8.5 (somitos 2-5), as células GFP + contribuiu para a mesoderme paraxial (Figura 2G e 2H), consistente com os mapas fate conhecidos da linha primitiva final 18 . Além disso, observou-se a contribuição para todas as três camadas germinais de células electroporadas (Figura 2I-K),sugerindo que o procedimento de electroporação não comprometer o comportamento das células in vivo. No entanto, notamos também que, embora epiblasto (E7.5) ou células linha primitiva (E8.5) foram alvo, algumas células da endoderme, também foram electroporadas (Figura 3C e Tabela 1). Uma das principais vantagens da utilização de um eléctrodo capilar é que o número de células electroporadas pode ser controlada, simplesmente, mudando o diâmetro da sua abertura. Para determinar o número de células electroporadas, os embriões foram fixados 2 horas após a electroporação e fotografada em wholemount em um microscópio confocal. O número de células GFP + foi contado manualmente nas confocal z-pilhas. A Tabela 1 mostra que, para uma dada fase, o aumento do tamanho do capilar de vidro de 20 a 30 mm resulta em absorção de ADN abertura por mais células. Quando um tamanho de abertura única foi comparada entre as fases (E7.5 contra E8.5), mais as células foram electroporadas a ser encontrada no último estágio. Este efeito pode ser devido a uma maior concentração de ADN presente na cavidade amniótica em E8.5. Como a solução de ADN foi misturado com o corante alimentar verde, podemos usar a cor verde para avaliar a concentração de DNA na cavidade amniótica. Ao microscópio, é evidente que, quando comparado com embriões E8.5, a cor verde após injecção de ADN é muito mais leve na cavidade de embriões E7.5. Embora a mesma concentração da solução de ADN foi injectado em embriões E7.5 e E8.5, mais solução de ADN foi na cavidade amniótica de embriões E8.5, de modo a preenchê-la completamente, porque eles são maiores em tamanho. Depois de retirar a agulha de injecção, há sempre algum grau de vazamento de solução de ADN a partir da cavidade amniótica, e uma vez que o orifício de punção é maior em comparação com o tamanho da cavidade amniótica em embriões anteriores, é provável que não era proporcionalmente mais fugas a partir de embriões E8.5 E7.5, conduzindo a uma concentração de DNA mais baixa. O número diferente de transfectadaAs células também pode ser devido aos diferentes diâmetros ou tensão transmembranar induzida (ITV) limiares de células em diferentes fases. Uma desvantagem de electroporação é a morte celular associada. Semelhante ao ouro tradicional chapeados ou eletrodos em forma de agulha, eletroporação usando um eletrodo capilar também provoca a morte celular. Após a electroporação a região alvo apareceu mais escuro na cor em comparação com as regiões vizinhas (Figura 3A e 3B), indicando que um certo grau de morte celular deve ter ocorrido nesta área. Para determinar ainda mais o número de células mortas causadas pelo procedimento de electroporação, os embriões foram coradas com um corante fluorescente impermeável à membrana celular nuclear. Os núcleos de células mortas foram marcadas com um corante impermeável à membrana fluorescência vermelha distante. A coloração confirmaram que esta técnica de electroporação capilar resulta apenas num pequeno número de células mortas próximo do local da electroporação (Figura 3D e Table 1). Percebemos que, embora as células mortas aparecem no local da eletroporação, as células GFP + e células mortas também são mais exclusivo da outra (Figura 3E e 3F). Além disso, quando o caudal epiblast laterais em E8.5 foi electroporado com pCAG-GFP e uma abertura capilar de vidro de 20 um, de um grande número de células GFP + foi detectada após 48 horas em cultura (Figura 3G e 3H). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem a maioria das células GFP + detectou 2 horas após a eletroporação ainda são viáveis ​​durante o mais cultura. Nós marcou o número de células GFP + após 24 horas de cultura ex vivo. Seis embriões foram electroporadas com pCAG-GFP em E7.5, utilizando um capilar de abertura de 20 um de diâmetro. 107 ± 31 (média ± dp) foram detectados GFP + células / embrião. Uma vez que no início da cultura (2 h), 9 células foram electroporadas em média por embrião ( <s<html> Trong&gt; Tabela 1), o que sugere que as células electroporadas foram submetidos a 3-4 divisões dentro de 2 horas. O tempo de duplicação celular média a partir de embriões E8.5 E7.5 a é de cerca de 6-7 horas em todas as células para além daqueles no nó ventral 19,20. Isto sugere que o procedimento de electroporação não dificultar o crescimento de células normais. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de circuito que mostra a configuração de electroporação. A solução de DNA contendo embrião na sua cavidade amniótica foi posicionado entre os dois eléctrodos. Corrente com os parâmetros escolhidos foi fornecida por um gerador de pulso de onda quadrada (fonte de alimentação). Um multímetro foi ligado em série para detectar a corrente elétrica que passa o embrião. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> jove_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> Figura 2. A distribuição das células enxertadas ou electroporated em embriões de acolhimento. (AH) sobreposições de fluorescência da GFP (verde) em imagens de campo claro de embriões wholemount (tons de cinza) (A) 10-16 GFP + EpiSCs foram enxertados na região distal de uma tarde embrião -streak fase. (C) Uma maior aglomerado de GFP + EpiSCs foi enxertado na região distai de um embrião de fase mid-raia. (B e D) A distribuição das células derivadas EpiSCs (verde) no embriões hospedeiras (mostrado na A e C) após 24 h em cultura. () GFP + células B dispersos no embrião hospedeiro, sugerindo a integração correcta das células do doador. (D) A enxertia maiores aglomerados de células resultou na formação de aglomerado não incorporada no embrião hospedeiro. (EK) pCAG-Cre: GFP plasmídeo ELE<html> ctroporated em áreas específicas de embriões tipo selvagem. Electroporating a região distai numa fase de embrião precoce broto (E) ou a linha primitiva de uma fase de embrião 2-5 somito (L) resultou em GFP + células nestas regiões 2 horas após o procedimento. (F e H) A distribuição das células GFP + nos embriões hospedeiros após 24 h em cultura, mostrando que as células electroporadas contribuir para a neuroectoderme (seta preta) (F) e mesoderme paraxial (seta branca) (H). (IK) DAB imunocoloração para as células GFP + mostrando que as células electroporadas pode dar origem à neuroectoderme (I), mesoderme (J) e endoderme (J e K) após 24 h em cultura. Barra de escala (AH) = 250 mm; barra de escala (IK) = 100 mm. Nota: A Figura 1A e 1B são reimpressos da nossa publicação anterior 4.href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> Figura 3. Distribuição de células GFP + células mortas e nos embriões após a electroporação (AC) pCAG-Cre:. GFP plasmídeo electroporada para dentro das células do epiblasto laterais caudal de um E8.5 (2-5 fase somito) embrião (tamanho da abertura capilar :. 20 ^ M) (A), 2 horas após o procedimento, a região alvo mostrou uma cor escura (seta branca) em comparação com outras partes do embrião. Inserção mostra uma ampliação da região electroporadas. (B) imagem de campo claro (escala de cinzentos) sobreposto com o canal fluorescente verde que mostra as células electroporadas (verde). (C) Um confocal z-mostrando que fatiaduas células da endoderme (verde) também assumiu o plasmídeo quando as células do epiblasto laterais caudais foram alvejados. Os núcleos das células estão apresentados no vermelho (DF) pCAG-Cre:. Plasmídeo GFP foi electroporado no aspecto caudal do nó de um embrião E8.5 (tamanho da abertura capilar: 30 uM). O embrião foi cultivada durante 2 horas. As células electroporadas são mostrados em células verdes e mortas no vermelho. (D) A área electroporadas contém tanto GFP + células, bem como células mortas. A área na caixa branca foi ainda analisado em um microscópio confocal. Contagem manual do z-stack mostrou que havia 33 células GFP + e 23 células mortas nesta área. Apenas duas células foram positivos para ambos os fluoróforos. (E e F) XYZ vista de um z-slice confocal da região em caixa branca em D mostrando células GFP + são separadas das células mortas. Os núcleos são mostrados a azul (G e H) pCAG-Cre:. GFP plasmídeo foi electroporado em alguns cells no epiblast lateral do caudal de um embrião E8.5 (tamanho da abertura capilar: 20 uM) e fotografada após duas (G) e (H) 48 horas de cultura ex vivo Nota: (H) O embrião foram cortados em dois após cultura. As regiões da cabeça e do coração foram removidos. Barra de escala (A, B, D, G e H) = 250 um; barra de escala (C, E e F) = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Diâmetro da abertura do tubo capilar </td><td> Fase de embrião </td><td> Eficiência eletroporação: não. embriões contendo GFP + células após 2h / nº total. embriões de eletroporados (no. GFP + embriões que se desenvolveram normalmente após 24 ou cultura 48h) </td><td> + Células número médio de GFP por embrião ± sd (n = não. De embriões examinados) </td><td> Número deGFP + endodérmicas células por cada embrião ± sd (n = não. De embriões examinados) </td></tr><tr><td> 20Hm </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (n = 4) </td><td> 4 ± 2 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 13/15 (12) </td><td> 17 ± 2 (n = 4) </td><td> 6 ± 1 (n = 4) </td></tr><tr><td> 20Hm </td><td> E8.5 (2-5 somites) </td><td> 12/13 (10) </td><td> 21 ± 4 (n = 4) </td><td> 11 ± 4 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30um </td><td> E8.5 (2-5 somites) </td><td> 2/2 (2) </td><td> 33 e 26 (n = 2) </td><td> 14 e 16 (n = 2) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Eficiência de electroporação pCAG-Cre: plasmídeo GFP em embriões de ratinho. Abreviatura: LS, tarde fase linha primitiva; LB: fase tardia bud. Os embriões são encenadas de acordo comDowns e Davies 12

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos at JoVE.com

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

methods-for-precisely-localized-transfer-cells-or-dna-into-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K visualizações.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Vídeo: Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Biologia do Desenvolvimento

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Preparação de Pequenas Bibliotecas de RNA para Sequenciamento de Embriões de Camundongos Primitivos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...