We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، وخلايا انسجة الوسيطة الرئة (LR-اللجان الدائمة) من أنسجة الرئة القاصي تم عزل إما على أساس التعبير عنها من علامات سطح الخلية (CD45 NEG، CD31 NEG، هيئة السلع التموينية، 1 عالية، Epcam NEG) 14،15، وذلك باستخدام النباتى من النمو 16، أو باستخدام الهضم الأنزيمي 17. كانت ملتصقة LR-اللجان الدائمة المثقف في DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز ولا الجلوتامين، و 15٪ FBS، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري، و 2 ملي الجلوتامين (وسائل الإعلام كاملة من الآن فصاعدا) وحضنت عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. تم passaged LR-اللجان الدائمة 3-4 مرات للتأكد من مجموعة من الخلايا مع خصائص نمو متجانسة نسبيا لفحص الهجرة. 1. إعداد متموجة واحد رقائق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل اللجان الدائمة من الأطباق الثقافة القياسية 100 ملم، وغسل الخلايا مع 10 مل من 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني قبل تحسنت، نضح PBS وإضافة 4 مل من التربسين (0.25٪). احتضان 3-5 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية. نضح جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في أنبوب مخروطي الشكل، إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق لتكوير أسفل الخلايا. ملاحظة: حضانة أطول في التربسين يمكن أن يغير مستقبلات سطح الخلية وربما يؤثر على الهجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الاعلام نضح والخلايا resuspend في وسائل الإعلام كاملة جديدة. عد الخلايا، باستثناء الخلايا الميتة باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان وصفيحة خلايا انسجة 500،000 الوسيطة في 4 مل من وسائل الإعلام كاملة على 60 مم طبق ثقافة الخلية. ملاحظة: اعتمادا على مصدر للخلايا، وقد تكون الاختبارات اللازمة لتحديد العدد الأمثل من الخلايا اللازمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا حتى لوحات هي 90٪ متموجة لمرفق الخلية الأمثل والانتشار، وعادة 48-72 ساعة عن اللجان الدائمة. ملاحظة: لا ينصح 100٪ التقاء، لأن العديد من تعتمد على مرسى تثبيط الخلايا تجربة الاتصال، الأمر الذي قد يغير قدرة هجرتها. سوف وحات مع أقل من 80٪ التقاء يؤدي في الصور غير صالحة للاستعمال بسبب برنامج تحليل الصور وتفسير الفجوةالصورة بين الخلايا كجزء من محيط الصفر (انظر الشكل 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخلايا قد وصلت 90٪ التقاء، تلف الخلايا بما يتناسب مع التطبيق. لتقييم تلف الخلايا بعد التعرض للذوبان استخراج دخان السجائر (CSE)، وتوليد 100٪ CSE عن طريق رسم الدخان من 1 جامعة كنتاكي البحوث السجائر (3R4F) من خلال 25 مل من وسائل الإعلام كاملة في قارورة بوشنر أكثر من 2 دقيقة 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 4 مل 1-4٪ CSE مخففة في وسائل الإعلام كاملة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة الدافئ، قبل أن يحل محل مع 4 مل وسائل الإعلام كاملة جديدة. ملاحظة: إتلاف الخلايا مع تركيزات عالية من استخراج دخان السجائر (&gt; 5٪) قد يقلل إلى حد كبير التقاء. </li></ol> 2. إنشاء خدش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة معقمة، وإزالة الغطاء من 60 ملم لوحة من اللجان الدائمة التالفة، ووضع حافة مستقيمة (على سبيل المثال مسطرة بلاستيكية معقمة) ACروس حافة العلوية للوحة. دون إزالة وسائل الإعلام، واستخدام معقم 200 ميكرولتر طرف الماصة تسترشد معقمة مستقيم الحافة لجعل واحدة إلى أربع الخدوش موازية عبر لوحة ما يقرب من 5 مم وبصرف النظر و 50 مم. ملاحظة: A حافة مستقيمة يقلل من كمية تعديلات التناوب حاجة إلى لوحة عندما يكون على خشبة المسرح المجهر. ومن الضروري أن الخدوش تظهر عمودية تماما (أو أفقية) على الشاشة. توليد خدوش متعددة على 60 ملم لوحة لا يغير من المكروية في الطريقة التي يؤثر الهجرة الخلية (لا تظهر البيانات)، ولكن قد يكون النظر لأنواع الخلايا الأخرى. لا ينصح استخدام الآبار الصغيرة منذ تقلب الخلايا المتزايد على مقربة من حافة البئر يصبح أكثر وضوحا ويمكن أن تؤثر جيل موحد من الخدوش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وسائل الاعلام وغسل بلطف لوحات مع 2 مل من وسائل الإعلام كاملة استعد مسبقا لمنع الخلايا من الانضمام إلى مركز للخدش، وإزالة الخلاياالصورة التي تم خففت من الخدش. استبدال 4 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام علامة دائمة العقيمة، وتسمية كل نقطة الصفر 1-4 على الجانب السفلي من لوحة في الموقع الذي لن تتداخل مع تصوير الخدوش. ملاحظة: من المهم أن الصور من نفس نقطة الصفر تتم مقارنة قبل وبعد الهجرة، منذ يمكن أن يكون هناك تباين في العرض الصفر. </li></ol> 3. أخذ الصور الأولية للخدش ملاحظة: إذا تم إجراء الفحص الصفر على لوحات متعددة، فمن المستحسن أن يتم أخذ الصور الأولية لجميع خدوش على لوحة واحدة قبل أن يتم بعمل خدوش على لوحة القادمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المرحلة المجهر النقيض المقلوب مع كاميرا لتوليد الصور اللازمة للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الثقافة على المجهر، واستخدام الهدف منخفضة الطاقة (10X) لتحديد موقع نقطة الصفر # 1. إذا التكثيف على غطاء لوحة الثقافة يعوق وايماج اضح<html> (ه) من الخلايا، استخدام مجموعة مرحلة ساخنة إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الصفر أفقي تماما ومركز مجال الرؤية، الحصول على العديد من الصور حسب الضرورة ليشمل 90٪ من طول الصفر ل. الحصول على صور من أجزاء متميزة من نقطة الصفر مع أي تداخل بين الصور. ملاحظة: انكسار الضوء على حواف الطبق الثقافة overexposes الصور، مما يجعلها مستحيلة لتحليلها. لذلك، لا تأخذ الصور من الاول والاخير 5٪ من طول الصفر ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الصور من كل نقطة الصفر في مجلد منفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،2-3،4 لخدوش 2 و 3 و 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى لوحات الحاضنة مباشرة بعد التصوير الأولي. السماح تهاجر الخلايا لل7/4 ساعة. ملاحظة: 7 ساعة هو الأمثل عند تقييم اللجان الدائمة التالفة مع CSE. احتضان الخلايا لمدة تزيد عن 7 ساعات غير مستحسن بسبب تكاثر الخلايا يمكن أن تكون بمثابة متغير الخلط للهجرة الخلايا (انظر اختياري ملاحظة 8.2 أدناه). </li></ol>الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. تحليل الأولية خدش الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل يماغيج وتثبيت الجرح أداة شفاء المساعد (يرجى الرجوع إلى جدول المواد / المعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف الصورة في يماغيج، ثم انقر فوق &quot;عملية&quot; و &quot;البحث عن الحواف&quot; لتسليط الضوء على الخلايا المحيطة الصفر لأداة شفاء الجروح لحساب مساحة الصفر (الشكل 2B). التالي، انقر فوق &quot;صورة&quot;، &quot;ضبط&quot;، &quot;اللون عتبة&quot; و في القائمة المنسدلة المسمى &quot;عتبة اللون&quot; تغيير القيمة إلى &quot;B &amp; W&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمن القائمة &quot;اللون عتبة&quot;، وضبط كل من المتزلجون عتبة سطوع حتى يتحقق النقيض الأمثل بين الصفر وخلية الجبهة. لإتاحة الفرصة لأكبر مجموعة عند محاولة إنشاء التباين في الصورة، حرك شريط التمرير السفلي تماما إلى اليمين (صورة سوداء تماما)، ثم ضبط شريط التمرير الأعلى لتوليد أقصى قدر من التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط ببطء بري كبارالمنزلق ghtness من اليسار إلى اليمين حتى تكون الصورة يعرض نظيفة كفاف من الصفر (الشكل 2C). مرة واحدة وقد تم التعرف على حواف الصفر، وانقر على زر &quot;المزيد من أدوات&quot; في شريط الأدوات يماغيج، حدد &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; من القائمة المنسدلة، ثم اضغط على زر &quot;م&quot; (الذي سيظهر في شريط الأدوات يماغيج) لتسليط الضوء على منطقة الصفر والإخراج المنطقة المحسوبة في نتائج نافذة المنبثقة (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ ولصق كل الأرقام من نتائج نافذة (الشكل 2E) إلى جداول اكسل. تأكد من فصل البيانات من الخدوش الفردية. </li></ol> 5. أخذ الصور النهائية للخدش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخلايا هاجر (4-7 ساعة)، كرر الخطوات من 3،2-3،4. صورة لوحات في نفس الترتيب الذي تم خدش بحيث كان الخلايا على كل لوحة وقتا متساويا للهجرة. ملاحظة: هذه الخلايا يمكن تصويرها عند نقاط زمنية متعددة، اعتمادا على سينسي بهمالناقلية إلى كل من درجة الحرارة ودرجة الحموضة التغييرات. بدلا من ذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية تستخدم لمتابعة الخلايا في الوقت الحقيقي كما تهاجر. </li></ol> 6. تحليل نهائي خدش الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،2-4،5 للصور خدش النهائية. </li></ol> 7. حساب المساحة خدش لقياس الهجرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب منطقة ما قبل الهجرة متوسط ​​عن طريق حساب متوسط ​​القيم المنطقة الأولى من الخدوش منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المبلغ الإجمالي للهجرة عن طريق طرح منطقة الهجرة النهائية لكل صورة، وتحسب في الخطوة رقم 6 من متوسط ​​منطقة ما قبل الهجرة (الخطوة 7.1). إنشاء قائمة من القيم لكل الصفر يمثل التغير في الهجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع البيانات من الخدوش متعددة ضمن المجموعة اختبار نفس (أي جميع لوحات وجميع خدوش على الخلايا المعرضة ل0٪ CSE). استخدام تحليل التباين اختبار لتحليل الاختلافات بين المجموعات التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الخلايا بطيئة للهجرةوتتطلب وقتا أطول الحضانة بعد الخدش (أكبر من 10-12 ساعة)، إجراء BrDU أو EDU التأسيس فحص 19 لتحديد ما إذا كانت الخلايا تشهد أي انتشار خلال الفترة التي مقايسة الهجرة يحدث. اختيار الهجرة الوقت مقايسة لتجنب تكاثر الخلايا كبيرا. </li></ol> 8. اختياري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم ما إذا كانت الشيخوخة خلية كبيرة ويحدث نتيجة لإجراء الخدش، وإجراء بيتا غالاكتوزيداز فحص المرتبطة الشيخوخة على لوحة اختبار في أوقات محددة سلفا بعد الخدش 19. </li></ol>

<ol>
	<li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative,+facile,+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay.">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li><li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li><li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+or+stromal+cells:+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices.">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li><li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates.">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex/focal+Adhesion-Independent+Mechanism.">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li><li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts.">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing:+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays.">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li><li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li><li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates.">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li><li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy.">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li><li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction.">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li><li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival,+Persistence,+Paracrine+Expression,+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung.">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li><li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-,+muscle-,+and+adipose-derived+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).</li><li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD.">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li><li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر، طريقة موحدة قوية من الناحية الكمية لأداء وتحليل فحوصات الصفر. تستخدم المقايسات خدش بسيط روتيني في العديد من مناطق مختلفة من الدراسة لدراسة الهجرة الخلوية. ومع ذلك، عادة فحص الصفر يفتقر إلى موحدة مجموعة المتابعة وتقدير بروتوكول، مما أدى إ...

الهجرة الخلية منسقة للغاية وحيوية لكثير من العمليات الفسيولوجية مثل تطوير الأنسجة، وإصلاح، وتجديد، وكذلك العمليات المرضية مثل ورم خبيث من السرطان وتصلب الشرايين 1. فهم هجرة الخلايا أهمية خاصة بالنسبة إلى العلاجات الناشئة تستخدم لإصلاح الأنسجة التالفة وعلاج الحالات المرضية، بما في ذلك تكنولوجيات زرع الخلايا والأنسجة الاصطناعية التطعيم 2. ونظرا للاهتمام الحالية في دور الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) في التوسط في إصلاح الأنسجة 3، قياس القدرة المهاجرة من هذه الخلايا باستخدام الفحص التي هي قابلة للقياس بدقة، قابلة للتكيف، وفعالة من حيث التكلفة والفائدة. الأهم من ذلك، يجب أن يكون مثل هذا الفحص حساس بما فيه الكفاية للكشف عن التغييرات الطفيفة نسبيا في قدرة المهاجرة الخلوية بعد الضرر. الأساليب الحالية لقياس الهجرة الخلية، بما في ذلك فحوصات الصفر، المقايسات الهجرة غير المشبعة جيدا (بويدن الفصلالكهرمانات)، صفائف micropillar، والمقايسات منطقة الحظر الخلية تمتلك مجموعة من القيود في التكاثر، والتفصيل، الكمي، وفعالية التكاليف 1،4،5. مقايسة الصفر الأمثل الموصوفة هنا يوضح نتائج قوية، وقدرات التحليل قابلة للقياس الكمي والصورة القائمة، وفعالية التكاليف، والقدرة على التكيف مع تطبيقات أخرى. وقد استخدمت المقايسات الصفر في قدرات متعددة لتقييم هجرة الخلايا وانتشارها في ظل ظروف تجريبية مختلفة 5. الفحص يستلزم بذر خلايا معينة، وتزايد لهم لإكمال أو التقاء القريب، وخدش أحادي الطبقة الناتجة بإبرة معقمة أو طرف الماصة 6. يتم إجراء تحليل الأكثر شيوعا بمقارنة عرض الصفر على نقاط زمنية متعددة في مواقع مختارة عشوائيا 7-9. على الرغم من استخدامه بارز، هو مرتبك فحص الصفر التي كتبها القضايا مع استنساخ النوعي والكمي. التباين فيجيل من الصفر لا يغير فقط المكروية من الخلايا، ولكن يمكن أيضا أن تعيق الهجرة الخلية عن طريق إتلاف سطح اللوحة والكامنة خارج الخلية مصفوفة 5. وتجرى فحوصات في كثير من الأحيان أكثر من 7-12 ساعة، ولكن لخطوط الخلايا التي تظهر الهجرة أبطأ ومرات الفحص أطول، يصبح انتشار والخلط متغير 7،10. وأخيرا، يمكن للخلايا هرمة الناتجة عن عملية الخدش الافراج عن العوامل التي تتداخل مع إشارات الخلية المطلوبة لسد الفجوة في أحادي الطبقة 1. الاستفادة المثلى من مقايسة الصفر يتطلب خلق فجوة متسقة لا تتداخل مع خصائص السطح، والتقليل من فحص طول الوقت، ومنع موت الخلايا غير المرغوب فيها خلال التلاعب. مقايسة سدادة مقرها هو الأمثل لفحص منطقة الحظر الخلية. هذا الاختبار يستخدم سدادة توضع في منتصف البئر الذي يستبعد نمو الخلايا، ولكن يسمح الخلايا المراد بالذهب في جميع أنحاء منطقة الحظر المركزية.لتقييم الهجرة، تتم إزالة السدادة، ويوفر منطقة الحظر الناتجة سطح للهجرة إلى أن يحدث. ومع ذلك، هذا الاختبار الصعب تخصيص أو التكيف مع 10 وبالنسبة لبعض التطبيقات، ويمكن هذا الأسلوب أيضا أن تكلفة باهظة. وعلى النقيض من المقايسات الصفر ومشتقاتها، المقايسات الهجرة غير المشبعة جيدا (أو بويدن المقايسات الغرفة) تقييم الهجرة عن طريق قياس عدد الخلايا التي تتحرك من غرفة واحدة، من خلال غشاء فلتر الصغيرة التي، في غرفة تحتوي على وكلاء الكيميائي 8،11، 12. هذه التقنية قد فائدة محدودة لالخلايا الملتصقة مثل اللجان الدائمة ليلي الهجرة من خلال غشاء مسامي، وخلايا التمسك الجانب غشاء تتعرض لعوامل الكيميائي، ويمكن أن يكون من الصعب تحديد بدقة. في حين أن الاختبار هو قادرة على دراسة بعض أنماط الهجرة ثلاثية الأبعاد، أنواع الخلايا المقيدة التي أنها قادرة على تحديد بدقة الحد هجرة الخلايا فائدتها 10. بديل آخر لفحوصات الصفر يستخدم مجموعة الركن الصغير، والذي يقيس الحركة الخلوية من خلال الفضاء ثلاثي الأبعاد باستخدام قدرة الخلايا على تشوه وتهاجر إلى مجموعة كبديل. Polydimethlysiloxane (PDMS) اللدائن الشفاء أكثر من العفن دقيقة وتعامل مع الأوزون وفبرونيكتين تنتج المكروية متجانسة وغير القابلة للتحلل. ويمكن أيضا أن تختلف تباعد الصغرى دعامة حسب الحاجة لقياس قدرة الخلايا على دخول مجموعة 4. يتم إنشاء قالب من خلال الحفر العميق أيون رد الفعل من رقائق السيليكون لإنشاء نسخة السلبي لارتفاع تبلغ نسبة أبعادها مجموعة 13. بينما يتعزز فحص من قبل التفصيل في، والقدرة على تصميم نموذج الهجرة ثلاثية الأبعاد، وتحليل من خلال رؤية مباشرة من الخلايا المهاجرة، وصعوبة في خلق المصفوفات الدقيقة عمود تعوق اقتصاديا استخدامه على نطاق واسع. مقايسة الصفر الأمثل الموصوفة في هذا البروتوكول يوفر كفاءة، كوسفعالية تي طريقة لإنتاج الخدوش تتفق التي يمكن تحليلها باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية. بدلا من قياسات عرض بسيطة مصنوعة عبر نقطة الصفر قبل وبعد الهجرة الخلية، والبرنامج يتيح للمستخدم تحديد مجموع المساحات الصفر قبل وبعد الهجرة. هذا التقدم يحد من قضية محاولة لتحديد مكان نقطة الصفر ينبغي أن تؤخذ القياسات العرض، وإذا كان العرض من نقطة الصفر موحد على طول طول انها. بالإضافة إلى ذلك، ناقش الأمثل دقيق لأعداد الخلايا، التقاء الخلية ونوع ودرجة الأضرار التي لحقت الخلايا من أجل زيادة الاستخدام الأمثل للفحص.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

وأجريت فحوصات الصفر المقدمة هنا باستخدام خلايا اللحمة المتوسطة انسجة الرئة المقيمين الفئران (LR-اللجان الدائمة) ومعزولة كما المشار إليها في المذكرات البروتوكول. وفاز المصنف LR-اللجان الدائمة في مناطق ذات كثافة من 500،000 الخلايا في 60 ملم صحن زراعة الأنسجة، ونمت إلى 90٪ ال...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract at JoVE

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

optimization-wound-scratch-assay-to-detect-changes-murine-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.9K Views.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Video: Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

تقييم البطانية هجرة الخلايا بعد التعرض للمواد الكيميائية السامة

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم مقلص وظيفة الخلايا الجذعية الوسيطة التي خضعت طلائي-الوسيطة الانتقالية

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

الإنتاج والإدارة العلاجية الجذعية الوسيطة / اللحمية الخليوي (MSC) الأجسام الشبه الكروية معبى في الثقافات 3-D تحت ظروف كره خالية

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

جهاز لأداء الهجرة خلية / شفاء الجروح في لوحة 96-حسنا

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق<em&gt; في المختبر</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...