We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

참고 : 사용, 말초 폐 조직에서이 연구, 폐 중간 엽 기질 세포 (LR-중간 엽 줄기 세포)의 경우 분리되었다 중 자신의 세포 표면 마커의 발현 (CD45의 NEG, CD31의 NEG, 무서-1 고,는 EpCAM의 NEG) 14, 15을 기준으로 이식편 밖으로 성장 (16), 또는 효소 소화 (17)를 사용하여. 자기편 LR-중간 엽 줄기 세포는 높은 혈당없이 글루타민, 15 % FBS, 1X / 항생제 항진균제, 2 mM의 글루타민 (이제부터는 완전한 미디어)와 DMEM에서 배양하고, 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양 하였다. LR-중간 엽 줄기 세포 마이그레이션 분석에 대한 상대적으로 균일 한 성장 특성과 세포 집단을 보장하기 위해 3 ~ 4 번 계대 하였다. 1. 합류 단층을 준비 <ol><li> 표준 100mm 배양 접시에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하기 위해, 37 ° C 미리 예열 PBS의 10 ㎖로 세포를 씻어 PBS를 기음과 트립신의 4 ㎖ (0.25 %)를 추가합니다. 37 °의 C 배양기에서 3 ~ 5 분을 품어. C를 대기음5 분 세포를 펠렛하는 원뿔 튜브에 ELL 학생은 300 g에서 완전한 매체와 원심 분리기의 동일한 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 주 : 트립신 길어 배양은 세포 표면 수용체를 변경 잠재적 이동에 영향을 미칠 수있다. </li><li> 기음 미디어와 신선한 전체 미디어에 resuspend 세포. 세포를 트리 판 블루 배제 개수를 사용하여 사균을 제외하고 60mm 세포 배양 접시에 완전한 미디어의 4 ml의 50 간엽 기질 세포를 접시. 주 : 세포의 소스에 따라, 테스트는 필요한 세포의 최적의 수를 결정하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 플레이트는 최적의 세포 부착과 증식에 90 %의 합류, 중간 엽 줄기 세포에 대한 일반적으로 48 ~ 72 시간까지 세포를 품어. 참고 : 100 % 합류가 자신의 철새 용량을 변경할 수 많은 고정 의존 세포 경험 연락처 억제하기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이미지 분석 소프트웨어가 갭을 해석하기 때문에 80 % 미만의 합류점과 플레이트 불가능한 포토 초래할 것처음의 둘레의 한 부분으로 세포 사이의 (그림 1D 참조). </li><li> 세포가 90 % 합류에 도달 한 후에, 애플리케이션을위한 적절한 세포를 손상. 수용성 담배 연기 추출 (CSE)에 노출 된 후 세포 손상을 평가하기 위해, 2 분 18 세 이상 뷰 흐너 플라스크에 전체 미디어의 25 ml를 통해 1 켄터키 대학의 연구 담배 (3R4F)에서 연기를 그려 100 % CSE를 생성합니다. </li><li> 전체 미디어에 희석 4 ml의 1~4%의 CSE에서 24 시간 동안 세포를 품어. 배양 후, 4 ㎖의 신선한 완전한 매체와 교체하기 전에, 따뜻한 멸균 PBS의 4 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오. 참고 : 담배 연기 추출물의 높은 농도 (&gt; 5 %)에 손상을 입히는 세포를 실질적으로 합류를 줄일 수 있습니다. </li></ol> 2. 스크래치 만들기 <ol><li> 무균 환경에서 손상된 중간 엽 줄기 세포의 60mm 판에서 뚜껑을 제거하고 AC (예 : 멸균 플라스틱 통치자에 대한) 직선을 마련로스 플레이트의 상부 림. 미디어를 제거하지 않고, 약 5mm 간격 판에서 1-4 병렬 긁힌 자국과 긴 50mm를 만들기 위해 멸균 직선 가장자리에 의해 인도 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용합니다. 주 : 직선 에지는 현미경 스테이지에있을 때 판에 필요한 회전 조정의 양을 최소화한다. 이는 상처가 화면에 완전하게 수직 (또는 수평) 표시하는 것이 필수적이다. 60mm 접시에 여러 상처 생성하는 세포 이동을 (데이터는 도시하지 않음)에 영향을 미치는 방식으로 미세 환경을 변경하지 않고, 다른 종류의 세포에 대한 고려 될 수있다. 우물의 가장자리에 성장하는 세포의 변화가 더욱 두드러지고 상처의 균일 한 세대에 영향을 미칠 수 있기 때문에 작은 우물의 사용은 권장되지 않습니다. </li><li> 미디어를 대기음 부드럽게 스크래치의 중심에 부착 세포를 방지하기 위해 미리 예열 전체 미디어의 2 ㎖로 접시를 세척하고, 세포를 제거하기 위해긁힘에 의해 완화 된의. 신선한 전체 미디어의 4 ㎖로 교체합니다. </li><li> 멸균 영구 마커를 사용하여 흠집을 이미징을 간섭하지 않는 위치에서 상기 플레이트의 밑면에 각각 1-4 스크래치 라벨. 참고 : 스크래치 폭의 변화가있을 수 있기 때문에 그것은, 같은 처음부터 이미지가 이전과 마이그레이션 후 비교하는 것이 중요하다. </li></ol> 3. 스크래치의 초기 이미지를 촬영 참고 : 스크래치 분석 여러 판에서 수행되는 경우,이 상처는 다음 접시에되기 전에 하나의 접시에 모든 상처의 초기 이미지를 촬영하는 것이 좋습니다. <ol><li> 분석에 필요한 이미지를 생성하는 카메라 역 위상차 현미경을 사용한다. </li><li> 현미경의 문화 판을 놓고 스크래치 번호를 찾기 위해 낮은 전력 목적 (10X)를 사용하여 1. 배양 접시의 뚜껑에 응축 맑은 IMAG을 방해하는 경우세포의 전자는 37 ℃로 가열 된 무대 세트를 사용합니다. </li><li> 필요한만큼의 화상을 얻기 완전히 수평 시야의 중심에 스크래치를 유지하는 스크래치의 길이의 90 %를 포함한다. 이미지 사이에 중복으로 스크래치의 서로 다른 부분의 이미지를 얻습니다. 참고 : 배양 접시의 가장자리에 빛의 굴절을 분석하기가 불가능하고, 이미지를 overexposes. 따라서, 처음부터 이미지를 가지고 스크래치의 길이의 5 %를 지속되지 않습니다. </li><li> 별도의 폴더에 각각 처음부터 이미지를 저장합니다. </li><li> 반복 흠집 2, 3 3.2-3.4, 4 단계를 반복합니다. </li><li> 즉시 초기 이미징 후 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 세포가 4-7 시간 동안 이동하자. 참고 : CSE와 손상 중간 엽 줄기 세포를 평가할 때 7 시간이 최적입니다. 세포 증식은 세포의 이동에 대한 혼란 변수로 작용할 수 있기 때문에보다 7 시간 동안 세포를 배양 (아래 옵션 참고 8.2 참조)하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 초기 스크래치 이미지 분석 <ol><li> (재료 / 장비의 표 참조) ImageJ에 다운로드 및 상처 치유 도구 플러그인을 설치합니다. </li><li> ImageJ에있는 이미지 파일을 연 다음 상처 치유 도구 스크래치 영역 (그림 2B)을 계산하기위한 스크래치를 둘러싸고있는 세포를 강조하기 위해 &quot;가장자리 찾기&quot; &quot;프로세스&quot;를 클릭합니다. 다음, &quot;이미지&quot;, &quot;조정&quot;, &quot;컬러 임계 값&quot;과 &quot;임계 값 색상&quot;이라고 표시된 드롭 다운 메뉴에서 값 변경을 클릭합니다 &quot;B &amp; W를.&quot; </li><li> 스크래치 및 세포 앞 사이의 최적의 대비가 달성 될 때까지 &quot;컬러 임계 값&quot;메뉴 내에서 모두 밝기 임계 값 슬라이더를 조정합니다. 이미지의 대비를 만들 수있는 권리 (완전히 검은 이미지) 완전히 바닥 슬라이더를 이동 한 다음 최대 대비를 생성하기 위해 상단 슬라이더를 조정하려는 가장 큰 범위를 허용합니다. </li><li> 천천히 상단 BRI를 조정이미지가 깨끗하게 스크래치 (그림 2C)의 윤곽이 표시 될 때까지 왼쪽에서 오른쪽으로 ghtness 슬라이더. 스크래치의 가장자리가 확인되고 나면, 스크래치 영역을 강조하기 위해, 드롭 다운 메뉴에서 &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot;를 선택하고 &quot;M&quot;버튼 (즉 ImageJ에 도구 모음에 나타납니다)를 누르면 ImageJ에 툴바에서 &quot;추가 도구&quot;를 클릭 출력 결과 팝 아웃 창 (그림 2D)에서 계산 된 영역입니다. </li><li> 복사 및 엑셀 스프레드 시트에 결과 창 (그림 2E)의 모든 번호를 붙여 넣습니다. 개인의 상처에서 데이터를 분리해야합니다. </li></ol> 5. 스크래치의 최종 이미지를 촬영 <ol><li> 세포 (4-7 시간) 마이그레이션 한 후, 반복 3.2-3.4 단계를 반복합니다. 이미지 각 접시에 세포가 이동하는 동일한 시간을 준 있도록 그들이 긁힌 것과 같은 순서로 판. 주 : 세포를 여러 시점에서 이미징 될 수있는, 그들의 SENSI에 따라모두 온도와 pH를 변화 tivity. 대안 적으로, 생균 촬상 그들이 마이그레이션 실시간으로 세포를 수행하는데 사용될 수있다. </li></ol> 6. 최종 스크래치 이미지 분석 <ol><li> 반복 최종 스크래치 이미지 4.2-4.5 단계를 반복합니다. </li></ol> 7. 마이그레이션을 정량화하기 위해 스크래치 영역을 계산 <ol><li> 각 스크래치의 초기 면적 값을 평균함으로써 평균 사전 이주 면적을 계산한다. </li><li> 평균 사전 이주 영역 (단계 7.1)에서, 단계 6에서 계산 된 각 이미지에 대한 최종 이동 영역을 빼서 이주의 총량을 계산한다. 마이그레이션의 변화를 나타내는 각 스크래치의 값의리스트를 생성한다. </li><li> (즉, 셀의 모든 판과 모든 상처 0 %에 노출 CSE) 동일한 시험 군 내에서 여러 상처로부터 데이터를 풀. 실험 그룹 간의 차이를 분석하기 위해 분산 시험의 분석을 사용한다. </li><li> 세포는 이동 속도가 느린 경우및 (보다 10-12 시간 이하) 긁 후 긴 배양 시간을 필요로, 세포 이동 분석법이 발생하는 기간 중에 증식을 겪고 있는지의 BrdU 또는 듀 혼입 분석 (19)를 결정하기 위해 수행. 상당한 세포 증식을 방지하기 마이그레이션 분석 시간을 선택한다. </li></ol> 선택 (8) <ol><li> 중요한 세포 노화가 찰 절차의 결과로 발생 여부를 평가하기 위해, 19 긁힘 후 미리 정해진 시간에 시험 접시에 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 분석을 수행합니다. </li></ol>

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	<li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative,+facile,+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay.">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li><li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li><li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+or+stromal+cells:+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices.">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li><li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates.">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex/focal+Adhesion-Independent+Mechanism.">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li><li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts.">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing:+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays.">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li><li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li><li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates.">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li><li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy.">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li><li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction.">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li><li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival,+Persistence,+Paracrine+Expression,+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung.">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li><li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-,+muscle-,+and+adipose-derived+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).</li><li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD.">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li><li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 설명 된 프로토콜을 수행하고 스크래치 시험 법을 정량적으로 분석 할 수있는 견고하고 표준화 된 방법을 제공한다. 간단한 스크래치 분석은 정기적으로 세포의 이동을 조사하는 연구의 다양한 분야에서 사용된다. 그러나 전통적으로 스크래치 분석은 재현성 7,10에 문제하게되었다 표준화 된 설정 및 정량 프로토콜을 결여하고있다. 변형 및 스크래치 시험을 향상 최적화 많은 개?...

세포 이동은 조직 개발, 수리 및 재생뿐만 아니라, 암의 전이 및 동맥 경화 1과 병리학 적 과정 등 많은 생리 학적 과정에 매우 조정 및 중요합니다. 세포 이동의 이해는 손상된 조직을 복구하고 세포 이식 기술과 인공 조직 2 접목을 포함한 병리학 적 조건을 치료하는 데 사용 신흥 치료에 특히 관련이있다. , 조직 복구 3을 매개 엄격 정량화 적응 및 경제적 인 관심의 분석을 이용하여 이들 세포의 이주 능력을 정량화 간엽 기질 세포 (MSC들)의 역할에 관심을 주어 현재. 중요한 것은, 이러한 분석은 손상 후 세포의 철새 용량 상대적으로 미묘한 변화를 감지 할 수있을만큼 충분히 민감해야합니다. 스크래치 분석, 트랜스 웰 마이그레이션 분석을, 세포 이동을 정량화 포함한 현재의 방법 (보이든의 채널ambers) micropillar 어레이 및 셀 배제 영역 분석법은 재현성, 커스터마이즈, 정량화 및 경제성 1,4,5 한계의 범위를 갖는다. 여기에 설명 된 최적화 된 스크래치 분석은 강력한 결과, 정량화 및 이미지 기반 분석 기능, 비용 효율성 및 기타 응용 프로그램에 대한 적응성을 보여줍니다. 스크래치 분석은 다른 실험 조건 하에서 5 세포 이동과 증식을 평가하기 위해 여러 용량으로 사용되어왔다. 분석은 또는 가까운 합류를 완료하기 위해 그들을 성장, 지정된 세포를 파종하고, 멸균 바늘 또는 피펫 팁 6 결과 단층를 긁적 수반한다. 분석은 가장 일반적으로 무작위로 위치 7-9에서 여러 시간 지점 위에 스크래치의 폭을 비교함으로써 수행된다. 그것의 저명한 사용에도 불구하고, 스크래치 분석은 재현성과 정량 문제에 의해 혼동된다. 의 변동성흠집의 발생뿐만 아니라, 세포의 미세 환경을 변화뿐만 아니라, 플레이트 표면과 기저 세포 외 매트릭스 (5)의 손상에 의해 세포 이동을 저해 할 수있다. 분석법 빈번 그러나 느린 이동 및 더 긴 분석 시간을 표시하는 세포주에 대해, 12 시간에 걸쳐 진행되는 7, 증식 교란 변수 7,10된다. 마지막으로, 찰과 공정에 의해 생성 된 노화 세포는 단층 1 격차를하는데 필요한 세포 외 신호에 방해 요인을 해제 할 수있다. 스크래치 시험을 최적화하면 분석 시간 길이를 최소화하고, 조작 동안 원치 않는 세포 사멸을 방지하는 표면 특성을 방해하지 않는 일관 갭의 생성을 필요로한다. 스토퍼 기재 분석법은 세포 배제 영역 분석법의 최적화이다. 이 분석은 세포 성장을 배제 웰의 중앙에 배치 된 스토퍼를 이용하지만, 세포가 배제 중앙 영역의 주위에 도금 될 수있다.마이그레이션을 평가하기 위해, 스토퍼가 제거되며, 생성 된 배타 존은 마이그레이션이 발생하기위한 표면을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 사용자 또는 10 적응 어렵고 일부 애플리케이션의 경우,이 기술은 엄청난 비용이 될 수있다. 스크래치 시험 법 및 이들의 유도체, 트랜스 웰 마이그레이션 분석 (또는 보이든 챔버 분석법) 대조적 화성 제 8,11 함유 챔버에, 미 공성 여과막을 통해, 하나의 챔버로부터 이동 세포 수를 정량함으로써 마이그레이션을 평가 (12). 다공성 막을 통한 마이그레이션 다음, 세포가 주 화성 제제에 노출 막 측에 부착하고 정확하게 정량화하기 어려울 수 있기 때문에 이러한 기술은 중간 엽 줄기 세포에 대한 부착 성 등 유틸리티를 한정 하였다. 분석은 어떤 입체 이주 패턴을 검사 할 수 있지만, 제한된 세포 유형은 그것을 정확하게 세포 이동 한계는 유틸리티를 정량화 할 수있다 (10). 스크래치 시험 법에 대한 다른 대안은 변형 및 대리 배열에 마이그레이션하는 세포의 능력을 이용하여 3 차원 공간을 통해 세포 운동성을 측정 마이크로 필러 배열을 사용한다. Polydimethlysiloxane (PDMS) 엘라스토머는 정밀 몰드 위에 경화와 오존으로 처리하고 피브로넥틴이 균일 및 비 분해성 미세 환경을 생성한다. 어레이 (4)를 입력하는 세포의 능력을 측정하기 위해 필요에 따라 마이크로 필러 간격 또한 변경 될 수있다. 주형은 높은 종횡비의 어레이 (13)의 음의 버전을 생성하도록 실리콘 웨이퍼의 깊은 반응성 이온 에칭을 통해 생성된다. 그 분석은 커스터마이즈에 의해 강화되지만, 이주 능력 세포 직접적인 시각화를 통해 입체 마이그레이션 및 분석을 모델링하는, 마이크로 필러 어레이를 생성하는데 어려움이 경제적으로 널리 사용을 방해한다. 이 프로토콜에 설명 된 최적화 스크래치 분석은 효율적 COS를 제공자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수 일관된 흠집 제조 t 효율적인 방법. 대신 전 세포 이동 후 스크래치 걸쳐 만든 단순한 폭 측정, 소프트웨어는 마이그레이션 전과 후의 총 스크래치 영역을 결정하기 위해 사용자를 가능하게한다. 이 진보가 여기서 폭 측정들이 취해 져야한다 스크래치 판단하려고하는 문제를 제한하고, 스크래치의 폭의 여부의 길이를 따라 균일하다. 또한, 세포 수, 세포 유형과 합류하고 세포에 가해진 손상의 정도는 더욱 신중한 최적화 분석을 최적화하기 위해 논의된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

여기에 제시된 스크래치 분석은 쥐의 폐 상주 중간 엽 기질 세포를 (LR-중간 엽 줄기 세포)를 사용하여 수행 및 프로토콜 노트에서 참조로 분리되었다. LR-엽 줄기 세포는 60mm 조직 배양 접시에서 500,000 세포의 밀도로 시딩하고, 48 시간에 90 % 합류로 성장시켰다. 손상을 생성하기 위해 4 % CSE는 (상술 한) 초기 시드 기간 다음 24 시간 동안이지만 스크래치 시험 전에 세포와 함께 배양 하였다. 각각의 분...

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.8K 조회수.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

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