ويوفر هذا البروتوكول طريقة جديدة لتقنية قديمة، وسوف يوفر نهجا جديدا لعدد كبير من الباحثين في العلوم الأساسية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طبيعة فعالة من حيث التكلفة وكذلك قدرتها على التكيف لاستخدامها من قبل جمهور علمي أوسع. لإعداد لوحة الهجرة، استخدم علامة دائمة فاتحة اللون لرسم خط أسفل الجزء الخلفي من كل بئر من 48 بئرا ورسم ثلاث علامات تجزئة لتقسيم كل بئر إلى ثلاثة مجالات منفصلة من الاهتمام.
ثم لوحة 1.5 إلى مرتين 10 إلى الرابع مرور واحد الخلايا الليفية القلبية في كل بئر والثقافة الخلايا في ظل ظروف الثقافة العادية لمدة 24 إلى 48 ساعة حتى تصل إلى 90 إلى 95٪ التقاء. عندما تكون الخلايا جاهزة، وإزالة افرات من كل بئر واستخدام تلميح P200 ماصة عقيمة لجعل تمريرة واحدة الصفر على طول الخطوط المرسومة. شطف الآبار مع متوسطة مصل منخفضة لإزالة أي الخلايا الليفية القلبية غير المرتبطة وإضافة 500 ميكرولترات من متوسطة المصل منخفضة لكل بئر.
إذا كان يتم استخدام العوامل الدوائية، إضافة العوامل إلى الآبار المناسبة. بعد ذلك، استخدم مجهر مقلوب مع هدف 20x لالتقاط صورتين صفر ساعة في البئر باستخدام علامات لوضع كل بئر للسماح بتصوير النصف العلوي من الخط المخدوش. ثم حرك اللوحة لوضع النصف السفلي من الخط المخدوش في عرض لجمع الصورة الثانية ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.
في نهاية الحضانة، وغسل كل جيدا مع PVS غير معقمة وإضافة 500 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde إلى كل بئر في غطاء محرك الدخان. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، يغسل كل بئر ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، قم بإضفاء الطابع الدقيق على الخلايا مع 300 ميكرولترات من محلول permeabilizing في كل بئر وهزاز لطيف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، استبدال حل permeabilizing مع 1٪ كوماسي بقعة زرقاء رائعة لاحتضان 10 دقيقة مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. تليها ثلاثة، خمس دقائق يغسل في برنامج تلفزيوني مع هزاز. بعد الغسيل الأخير، إضافة 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر ووضع بعناية لوحة في نفس الموقف كما لصورة ساعة الصفر قبل التقاط صورتين 24 ساعة في جيدا كما أظهرت.
في نهاية التجربة، افتح الصور وبرنامج تحليل التصوير المناسب وإنشاء طبقة جديدة على صورة ساعة الصفر. انقر نقرًا مزدوجًا لتغيير اسم طبقة طبقة جديدة وحدد أداة الفرشاة. تغيير حجم البيكسل إلى 10 واللون إلى الأحمر ورسم خطين منفصلين لتحديد خط الصفر.
يجب أن لا تلمس الخطوط أي خلايا. افتح صورة 24 ساعة في برنامج التصوير وحدد أداة النقل. مع الضغط على زر التحكم، انقر فوق كل من الخطوط وطبقات الخلفية، وانقر في وسط صورة ساعة الصفر واسحب الطبقتين إلى منتصف الصورة التي تبلغ مدتها 24 ساعة.
في صورة 24 ساعة، انقر فوق طبقة الخلفية ساعة الصفر وتغيير التعتيم إلى 50٪ الضغط على زر التحكم، انقر فوق كل من الخلفية ساعة الصفر وطبقات الخط وانقر تحرير والتحويل الحر لتحويل الحرة الطبقات باستخدام التحول الحر، محاذاة صفر ساعة الخلفية وصور الخط إلى 24 ساعة الخلفية صورة بحيث يتم وضع خطوط الهجرة المنطقة بشكل صحيح في صورة 24 ساعة. عندما تم تراكب طبقة الخط بنجاح، انقر بزر الماوس الأيمن لحذف طبقة الخلفية ساعة الصفر. يمكن استخدام طبقة الخط المتبقية لتحديد عدد الخلايا التي تم ترحيلها إلى منطقة الخدش على مدار 24 ساعة.
ثم احفظ صورة الترحيل الجديدة كملف Photoshop وملف TIFF أو JPEG. لتحديد عدد الخلايا التي يتم ترحيلها، افتح صورة الترحيل وبرنامج يقبل ملفات TIFF أو JPEG ويحسب عدد الخلايا الموجودة بين الخطين الأحمرين لكل منهما في كل بئر. ثم قم بتسجيل عدد الخلايا التي يتم ترحيلها لكل صورة.
لتحديد مساحة الترحيل، افتح صورة 24 ساعة التي تحتوي على خطوط الترحيل في برنامج التصوير واحفظ الصورة كصورة منطقة الترحيل. بعد الحفظ، انقر فوق طبقة الخلفية وانقر بزر الماوس الأيمن لحذف الطبقة. استخدم أداة الفرشاة لملء المساحة بين خطوط التسويد، بنفس اللون الذي تم استخدامه للخطوط وانقر فوق الصورة، والوضع، والتدرج الرمادي لتغيير الصورة إلى أبيض وأسود.
حفظ الصورة وفتح صورة منطقة الهجرة وبرنامج تحليل الصور المناسب. انقر فوق تحرير، ثم عكس. لتحديد مساحة خط الترحيل، انقر فوق الصورة، ثم قم بالضبط، وعتبة.
سيتم تحويل منطقة الهجرة السوداء إلى اللون الأحمر وسيتم الإشارة إلى النسبة المئوية في مربع العتبة. ثم قم بتسجيل منطقة النسبة المئوية لخط الترحيل وتأكد من أن هذه القيمة مقترنة بعدد الخلايا التي يتم ترحيلها للصورة نفسها. في هذا التحليل، هاجر 46 الخلايا الليفية من قلوب غير السكري و 129 الخلايا الليفية من قلوب السكري خلال فترة زمنية تجريبية 24 ساعة.
وكشف قياس منطقة الهجرة كما تبين، أن منطقة الخدش غير السكري شكلت 24.78٪ من المساحة الإجمالية المقاسة، في حين شكلت منطقة خدش هجرة السكري 16.77٪ من المساحة الإجمالية المقاسة. 11- ويوفر التطبيع إلى منطقة الهجرة تقييماً أفضل وأكثر صرامة لهجرة الخلايا وينفي الأخطاء البشرية المحتملة. على سبيل المثال، إذا تم مقارنة عدد الخلايا الليفية التي تم ترحيلها فقط، يظهر في هذا التحليل أن عدد الخلايا التي تم ترحيلها في هذا البئر كان ضعف عدد الخلايا التي تم ترحيلها في البئر الثاني.
وعندما استخدمت منطقة الخدش لتطبيع البيانات، لوحظ أن نسبة الخلايا الليفية إلى منطقة الهجرة هي نفسها تقريباً في كلا البئرين. تأكد من استعادة مساحة الترحيل في صورة 24 ساعة، كما قمت بالتقاطها في صورة ساعة الصفر. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء الكيمياء المناعية لفحص التعبير البروتين داخل الخلايا.
ونحن نعتقد أن هذا النهج الأحدث في فحص الهجرة الصفر سيسمح لمزيد من سبل البحث العلمي لفتح التي لم تكن متاحة في السابق.
