We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

Not: kullanarak uzak akciğer dokusundan Bu çalışmada, akciğer mezenkimal stromal hücreler (LR-MSC&#39;ler) için izole edilmiştir, ya da hücre yüzey markerlerinin ifadesiyle (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1, yüksek, EpCAM negatif) 14,15 göre eksplant dışı büyüme 16, ya da enzimatik sindirimi 17 kullanarak. Yapışık LR-MSC&#39;ler, yüksek glikoz ve hiçbir glutamin,% 15 FBS, 1 x antibiyotik / antimikotik ve 2 mM glutamin (bundan böyle komple ortamı) ile DMEM içerisinde kültürlendi ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edildi. LR-MSC&#39;ler, migrasyon deneyi ile nispeten homojen bir büyüme özelliklerine sahip bir hücre popülasyonu sağlamak için 3-4 kez geçirilmiştir. 1. konfluent tek tabaka hazırlanması <ol><li> Standart 100 mm kültür kaplarından MKH&#39;lerin ayırmak için, 37 ° C önceden ısıtılmış 10 ml PBS ile yıkama hücreleri PBS aspire ve tripsin 4 ml (% 0.25) ilave edin. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 3-5 dakika kuluçkalayın. C aspire5 dk hücreleri aşağı pelet için bir konik tüp içine arşın, 300 g tam medya ve santrifüj eşit miktarda ekleyin. Not: tripsin içinde uzun inkübasyon hücre yüzey reseptörleri değiştirebilir ve potansiyel geçiş etkileyebilir. </li><li> Medya aspire ve taze eksiksiz bir medya tekrar süspansiyon hücreleri. Hücreleri saymak tripan mavisi dışlanmasını kullanarak ölü hücreleri hariç ve 60 mm hücre kültürü çanak eksiksiz bir medya 4 ml 500.000 mezenkimal stromal hücreler plaka. Not: hücre kaynağına bağlı olarak, testler gereken hücre optimal sayısını belirlemek için gerekli olabilir. </li><li> Plakalar optimum hücre eki ve çoğalması için% 90 konfluent, MSC için genellikle 48-72 saat kadar inkübe hücreleri. Not:% 100 izdiham onların göç kapasitelerini değiştirebilir birçok ankraj bağımlı hücreleri deneyim temas inhibisyonu, çünkü, tavsiye edilmez. Görüntü analiz yazılımı boşluğu yorumlamak çünkü% 80&#39;den az izdiham ile Tabaklar kullanılamaz fotoğraflar neden olacaktırsıfırdan çevresinin bir parçası olarak hücreler arası s (Şekil 1D bakınız). </li><li> Hücreler% 90 izdiham ulaştınız sonra, uygulama için uygun olarak hücrelere zarar. Çözünür sigara dumanı ekstraktı (CSE) maruziyetten sonra hücre hasarı değerlendirmek için, 2 dakika 18 üzerinde bir Büchner şişesi içinde eksiksiz bir medya 25 ml ile 1 University of Kentucky araştırma sigara (3R4F) duman çizerek% 100 CSE üretir. </li><li> Tam ortam içinde seyreltilmiş 4 mi% 1-4 CSE 24 saat süre ile inkübe hücreleri. Kuluçkadan sonra, 4 ml yeni, tam ortam ile değiştirmeden önce, ılık steril PBS ile iki kez 4 ml yıkama hücreleri. Not: sigara dumanı özü yüksek konsantrasyonda (&gt;% 5) ile zarar görmesi hücreleri esas olarak izdiham azaltabilir. </li></ol> 2. Scratch oluşturma <ol><li> Steril bir ortamda, hasarlı MKH 60 mm plaka kapağı çıkarın ve AC (örneğin steril bir plastik cetvel için) bir cetvel yatıyorduross plakanın üst kenar. Ortamı çıkarmadan, yaklaşık 5 mm aralıklı plaka üzerinde bir ila dört paralel çizikler ve uzun 50 mm yapmak için steril düz kenar tarafından yönlendirilen bir steril 200 ul pipet ucu kullanın. Not: Bir düz kenar o mikroskop sahnede olduğunda plaka için gerekli dönme ayarlamalar miktarını en aza indirir. Bu çizikler ekranda tamamen dikey (veya yatay) görünür olması zorunludur. 60 mm plaka üzerinde birden fazla çizik oluşturma hücre göçü (veriler gösterilmemiştir) etkileyen bir şekilde mikro-değiştirmez, ancak diğer hücre tipleri için bir göz olabilir. Kuyunun kenarına yakın büyüyen hücrelerin değişkenliği daha belirgin hale gelir ve çizilmelere tekdüze nesil etkileyebilir çünkü küçük kuyuların kullanılması tavsiye edilmez. </li><li> Ortamı aspire ve yavaşça sıfırdan merkezine yapışan hücreler önlemek için önceden ısıtılmış tam ortam 2 ml plakaları yıkayın ve hücre kaldırmak içinkaşınma gevşetilmiş olan s. Taze tam ortam 4 ml ile değiştirin. </li><li> Steril kalıcı bir kalem kullanarak, çizikler görüntüleme engel olmaz yerde plakanın alt 1-4 her çizik etiket. Not: çizik genişliği varyasyon olabilir, çünkü aynı sıfırdan görüntüleri öncesi ve göç sonrası karşılaştırıldığında önemlidir. </li></ol> 3. Scratch başlangıç ​​Görüntüleri alarak Not: çizik deneyi birden plakalar üzerinde yapılırsa, bu çizikler sonraki plaka üzerinde yapılmadan önce tek bir plaka üzerinde tüm çizikler ilk görüntüleri alınması tavsiye edilir. <ol><li> Analiz için gerekli görüntüleri oluşturmak için bir kamera ile bir ters faz kontrast mikroskobu kullanın. </li><li> Mikroskop kültür plakası yerleştirin ve çizilmeye # bulmak için düşük güç hedefi (10X) kullanın 1. Kültür plaka kapağına yoğuşma net bir imag engelleyen isehücrelerin e 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılmış bir kademeli dizi kullanılır. </li><li> Gerekirse kadar görüntüler elde tamamen yatay ve görüş alanının merkezinde sıfırdan tutulması scratch uzunluğunun% 90 kapsayacak. Görüntüler arasında hiçbir örtüşme ile sıfırdan farklı bölümlerinin görüntüleri elde edebilir. Not: kültür çanak kenarlarında ışık kırılma analiz etmek, onları imkansız hale görüntüleri overexposes. Bu nedenle, ilk görüntüleri almak ve scratch uzunluğunun% 5 sürmez. </li><li> Ayrı bir klasörde her sıfırdan görüntüleri kaydedin. </li><li> Tekrarlama çizilmelere 2, 3 3,2-3,4 ve 4. adımları. </li><li> Hemen ilk görüntüleme sonra inkübatör plakaları dönün. Hücreler 4-7 saat göç edelim. Not: CSE ile hasarlı MKH&#39;lerin değerlendirirken 7 saat uygunudur. Hücre çoğalması, hücre göçü için karıştırıcı bir değişken olarak hareket edebilir, çünkü daha büyük 7 saat boyunca inkübe (aşağıda isteğe bağlı Not 8.2) tavsiye edilmez. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. İlk Scratch Görüntüleri Analiz <ol><li> (Malzeme / Ekipman Tablo bakınız) ImageJ indirin ve Yara İyileşmesi Aracı eklenti yüklemek. </li><li> ImageJ görüntü dosyasını açın, sonra Yara İyileşmesi Aracı çizik alanı (Şekil 2B) hesaplamak için sıfırdan çevreleyen hücrelerin vurgulamak için &quot;Kenarları Bul&#39;u&quot; &quot;Süreç&quot; linkine tıklayın ve. Sonra, &quot;Görüntü&quot;, &quot;ayarlama&quot; &quot;Renk Eşiği&quot; ve &quot;Eşik Renk&quot; etiketli açılır menüden değerini değiştirmek tıklayın &quot;B &amp; W.&quot; </li><li> Çizik ve hücre ön arasında optimum kontrast elde edilinceye kadar &quot;Renk Eşiği&quot; menüsü içinde, hem de parlaklık eşik sürgü ayarlayın. Görüntüdeki kontrast oluşturur sağa (tamamen siyah resim) tamamen alt kaydırıcıyı hareket ettirin ve sonra maksimum kontrast oluşturmak için üst kaydırıcıyı ayarlamak için çalışıyoruz büyük aralığı için izin vermek için. </li><li> Yavaş yavaş üst bri ayarlamakGörüntü temiz sıfırdan (Şekil 2C) konturu görüntüler kadar soldan sağa ghtness kaymak. Sıfırdan kenarları tespit edildikten sonra, çizik bölgeyi vurgulamak için, açılır menüden &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; seçeneğini seçin ve &quot;m&quot; düğmesine (o ImageJ araç çubuğunda görünecektir) basın ImageJ araç çubuğundaki &quot;Daha Araçlar&quot; tıklayın ve çıkış sonuçları pop-out pencere (Şekil 2B) bilgisayarlı alan. </li><li> Kopyala ve bir excel elektronik tabloya sonuç penceresinde (Şekil 2E) tüm sayıları yapıştırın. Bireysel çizilmelere verileri ayırmak için emin olun. </li></ol> 5. Scratch Final Görüntüleri alarak <ol><li> Hücreleri (4-7 saat) göç ettikten sonra, tekrar 3.2-3.4 yineleyin. Görüntü her tabakta hücreleri göç eşit zaman oldu, böylece çizik aynı sırayla plakalar. Not: Hücreler çoklu zaman noktalarında görüntülü olabilir, bunların sensi bağlı olarakHer iki sıcaklık ve pH değişikliklerine tivity. Alternatif olarak, canlı hücre görüntüleme onlar göç gerçek zamanlı olarak hücreleri izlemek için kullanılabilir. </li></ol> 6. Final Scratch Görüntüler incelendiğinde <ol><li> Tekrarlayın son çizik görüntüler için 4.2-4.5 adımları tekrarlayın. </li></ol> 7. Göç belirlememize Scratch Alanını Hesaplama <ol><li> İlgili çiziklerin ilk alan değerlerinin ortalaması alınarak ortalama öncesi göç alan hesaplayın. </li><li> Ortalama öncesi göç alanında (adım 7.1) den, 6. adımda hesaplanan her bir görüntü için son göç alan, çıkartılmasıyla göç toplam tutarı hesaplayın. Göç değişikliği temsil eden her sıfırdan değerlerinin bir listesini oluşturun. </li><li> (Yani hücreleri üzerinde tüm tabak ve tüm çizikler% 0 ÖAM&#39;ye maruz) aynı test grubunda birden fazla çizilmelere verileri Havuz. Deney grupları arasındaki farklılıkları analiz etmek için Varyans testi bir analizi kullanın. </li><li> Hücreler geçirmek yavaşsave (büyük 10-12 saat daha az) çizilmemesi sonra uzun bir kuluçka süresi gerektirir, hücreler göç tahlil meydana edildiği dönemde herhangi çoğalmasını geçiren olup olmadığını bir BrdU veya edu kuruluş tahlil 19 belirlemek için gerçekleştirin. Önemli hücre çoğalmasını önlemek için bir geçiş süresi tahlil seçin. </li></ol> İsteğe bağlı 8. <ol><li> Önemli hücre yaşlanması kazıma işleminin bir sonucu olarak meydana gelen olup olmadığını değerlendirmek için, 19 çizilmeye sonra önceden tespit edilmiş zamanlarda, bir test plakası üzerinde yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz deneyi yapar. </li></ol>

<ol>
	<li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative,+facile,+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay.">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li><li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li><li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+or+stromal+cells:+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices.">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li><li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates.">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex/focal+Adhesion-Independent+Mechanism.">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li><li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts.">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing:+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays.">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li><li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li><li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates.">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li><li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy.">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li><li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction.">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li><li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival,+Persistence,+Paracrine+Expression,+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung.">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li><li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-,+muscle-,+and+adipose-derived+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).</li><li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD.">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li><li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek ve çizilmeye deneyleri analiz etmek için kantitatif sağlam, standart bir yöntem sağlar. Basit çizik deneyleri rutin hücresel göç incelemek için çalışmanın çok farklı alanlarda kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel karalama tahlil tekrarlanabilir 7,10 ile ilgili sorunlar yol açmıştır standart bir set-up ve miktar protokolünü yoksun kalmıştır. Modifikasyonlar ve çizik testi geliştirilmesi için optimizasyonlar birçok bireysel canlı hücr...

Hücre göçü, doku gelişimi, onarım ve yenileme, hem de kanser metastazı ve damar sertliği 1 gibi patolojik işlemler gibi birçok fizyolojik süreçte yüksek oranda koordine ve hayati önem taşımaktadır. Hücre göçü bir anlayış hasarlı dokuları tamir ve hücre nakli teknolojileri ve yapay doku 2 aşılama dahil patolojik durumların tedavisinde kullanılan gelişmekte olan tedavilere özellikle önemlidir. , Doku tamirini 3 aracılık titizlikle, ölçülebilir uyarlanabilir ve uygun maliyetli ilgi olduğunu bir deney kullanılarak bu hücrelerin göç kapasitesinin miktarının mezenkimal stromal hücreler (MKH) rolü mevcut ilgi dikkate alındığında. Daha da önemlisi, bu tip bir analiz hücre hasarı sonrası göç kapasitesi nispeten küçük değişiklikleri tespit etmek için yeterince hassas olması gerekir. Çizik deneyleri, trans-kuyu göç deneyleri, hücre göçü miktarının da dahil olmak üzere mevcut metodlar (Boyden chamberleri), micropillar diziler ve hücre yasak bölge tahlilleri tekrarlanabilirlik, customizability, ölçümü ve maliyet etkinliği 1,4,5 sınırlamaları bir dizi sahiptir. Burada anlatılan optimize karalama tahlil sonuçlarını sağlam, ölçülebilir ve görüntü tabanlı analiz yetenekleri, maliyet-etkililik ve diğer uygulamalara uyum gösterir. Kazı deneyleri, farklı deney koşulları altında 5 hücresi yayılmasını ve çoğalmasını değerlendirmek için çok sayıda kapasitelerde kullanılmıştır. Deney veya yakınındaki izdiham tamamlamak için onlara büyüyen belirlenmiş tohum hücreleri ve steril bir iğne veya bir pipet ucu 6 ile elde edilen tek tabakalı çizilmeye gerektirir. Analiz en çok rastgele seçilmiş yerle 7-9 birden fazla zaman noktası boyunca sıfırdan genişliğini karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Onun belirgin kullanılmasına rağmen, çizilmeye tahlil tekrarlanabilirlik ve ölçümü ile ilgili sorunlar ile şaşırmış. Değişkenliğisıfırdan nesil değil, sadece hücrelerin mikro değiştirir, ama aynı zamanda plaka yüzeyi ve altında yatan hücre dışı matriks-5 zarar vererek hücre göçü engelleyebilir. Deneyler genellikle, ancak daha yavaş göç ve daha uzun deney süreleri gösteren hücre hatları için, 12 saat ila 7 üzerinden yürütülmektedir, proliferasyon, bir karıştırıcı bir değişken 7,10 olur. Son olarak, kaşıma işlemi tarafından oluşturulan yaşlanmış hücreler tek tabakalı 1 açığını kapatmak için gerekli dışı sinyalizasyon müdahale faktörleri serbest bırakabilirsiniz. Karalama tahlil Optimize tahlil süresi uzunluğu en aza indirerek, ve manipülasyon sırasında istenmeyen hücre ölümünü engelleyen, yüzey özelliklerine müdahale etmeyen tutarlı bir boşluk yaratılmasını gerektirir. Durdurucu bazlı analiz, bir hücre yasak bölge testinin bir optimizasyon olduğunu. Bu deney, hücre büyümesinin hariç oyuk ortasına yerleştirilen bir stoper kullanılmaktadır ancak bu hücreler, merkezi hariç bırakma bölgesi çevresindeki kaplama sağlar.Göç değerlendirmek için, durdurucu çıkarılmaktadır ve elde edilen dışlama alanı geçiş meydana gelmesi için bir yüzey sağlar. Bununla birlikte, bu deney, özelleştirmek veya 10 adapte zordur ve bazı uygulamalar için, bu teknik, aynı zamanda engelleyici mal olabilir. Sıfırdan deneyleri ve bunların türevleri, trans-çukurlu göç deneyleri (veya Boyden oda tahlilleri) aksine kemotaktik maddeler 8,11 ihtiva eden bir hazneye, mikro-gözenekli bir filtre zarı içinden bir odacıktan hareket hücre sayısının ölçülmesi ile göç değerlendirmek 12. Gözenekli zarından göç sonrasında, hücreler kemotaktik ajanlara maruz membran tarafına yapışır ve doğru ölçmek için zor olabilir, çünkü bu teknik, MSC gibi yapışık hücreler için programı sınırlıdır. Tahlil bazı üç boyutlu göç yollarını incelemek mümkün olsa da, kısıtlı hücre tipleri hangi için doğru hücre göçü limitini kendi yarar ölçmek mümkün 10. Karalama deneyleri için başka bir alternatif deforme ve bir vekil olarak diziye göç hücrelerinin yeteneği kullanarak üç boyutlu bir uzayda hücresel motilitesini ölçen bir mikro-ayağı dizisi kullanır. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerler kesin bir kalıp üzerine tedavi ve ozon ile tedavi ve fibronektin homojen olmayan parçalanabilir mikro üretir. Dizi 4 girmek için hücrelerinin yeteneği ölçmek için gerektiği gibi mikro-kolonu boşluk da değişebilir. Kalıp, yüksek boy oranı dizisinin 13 negatif bir sürümünü oluşturmak için silikon gofret derin reaktif iyon aşındırma yoluyla oluşturulur. Tahlil onun customizability tarafından güçlendirilmiştir edilirken, yetenek göç hücrelerinin doğrudan görselleştirme yoluyla üç boyutlu göç ve analiz modeli, mikro-ayağı diziler yaratmada güçlük ekonomik yaygın kullanımını engellemektedir. Bu protokol açıklanan optimize karalama tahlil verimli, cos sağlarserbestçe kullanılabilir yazılımı kullanılarak analiz edilebilir ve tutarlı bir şekilde çiziklerin üretilmesi için T-etkili bir yöntemdir. Bunun yerine önce ve hücre göçü sonrasında sıfırdan genelinde yapılan basit genişlik ölçümleri, yazılım öncesi ve sonrası toplam çizilmeye göç alanlarını belirlemek için kullanıcı sağlar. Bu gelişme nerede genişlik ölçümleri alınmalıdır çizik belirlemeye çalışıyor konusunu sınırlayan ve sıfırdan genişliği olsun o uzunluğu boyunca üniform olduğunu. Buna ek olarak, hücre sayıları, hücre izdiham tipi ve hücrelere verilen hasarı derecesi dikkatli optimizasyonu daha deneyi optimize etmek için ele alınmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Burada sunulan karalama deneyleri fare akciğer ikamet mezenkimal stromal hücreleri (LR-MKH&#39;lerin) kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve protokol notları başvurulan olarak izole edilmiştir. LR-erişkin 60 mm doku kültürü çanağı içinde 500.000 hücre yoğunluğunda tohumlanır ve 48 saat% 90 konflüansa büyütülmüştür. Hasar oluşturmak için,% 4 CSE (yukarıda tarif edilmiştir), ilk tohumlama dönemin ardından 24 saat süre ile, ancak sıfırdan analizden önce hücreler ile inkübe edildi. Her ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract at JoVE

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

optimization-wound-scratch-assay-to-detect-changes-murine-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.8K Görüntüleme.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Video: Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract