We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

הערה: במחקר זה, תאי סטרומה mesenchymal ריאות (LR-MSCs) מרקמת הריאה דיסטלי היו מבודדים או המבוסס על ביטוים של סמנים פני התא (נג CD45, CD31 נג, 1-Sca נג הגבוה, EpCAM) 14,15, באמצעות explant את הצמיחה 16, או באמצעות עיכול אנזימטי 17. חסיד LR-MSCs היה בתרבית בDMEM עם גלוקוז גבוה ולא גלוטמין, FBS 15%, גלוטמין 1x האנטיביוטי / antimycotic, ו -2 מ&quot;מ (להלן תקשורת מלאה) וטופחו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. LR-MSCs היה passaged 3-4 פעמים על מנת להבטיח אוכלוסייה של תאים בעלי מאפייני צמיחה הומוגני יחסית עבור assay ההגירה. 1. הכנה חד שכבתי ומחוברות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק MSCs מתרבות מנות 100 מ&quot;מ סטנדרטית, לשטוף תאים עם 10 מיליליטר של 37 מעלות PBS מראש חימם C, לשאוב PBS ולהוסיף 4 מיליליטר של טריפסין (0.25%). דגירה 3-5 דקות בחממה 37 ° C. לשאוב גאמות לתוך צינור חרוטי, להוסיף נפח שווה של תקשורת וצנטריפוגות המלאה ב 300 גרם במשך 5 דקות עד גלולה את התאים. הערה: דגירה ארוכה יותר בטריפסין יכולה לשנות את הקולטנים בתא שטח ופוטנציאל להשפיע הגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב ותאים גלולים בתקשורת מלאה טרי. ספירת תאים, כולל תאים מתים באמצעות הרחקת trypan כחולה וצלחת תאי סטרומה 500,000 mesenchymal ב 4 מיליליטר של מדיה מלאה על צלחת תרבית תאי 60 מ&quot;מ. הערה: בהתאם למקור של התאים, בדיקות עשויות להיות נחוצות כדי לקבוע את המספר האופטימלי של תאים דרושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עד צלחות ומחוברות 90% עבור קובץ מצורף תא אופטימלי ושגשוג, בדרך כלל 48-72 שעות לMSCs. הערה: מפגש 100% אינו מומלץ, שכן עיכוב רב מעגן תלוי קשר ניסיון תאים, אשר עשוי לשנות את יכולת הנדידה שלהם. צלחות עם מפגש פחות מ -80% יגרמו לתמונות שמישים כי תוכנת ניתוח תמונה תפרש פערים בין תאים כחלק מהמערכת של השריטה (ראה איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהתאים הגיעו 90 מפגש%, לגרום נזק לתאים בהתאם ליישום. כדי להעריך תא נזק לאחר חשיפה לתמצית עשן סיגריות מסיסה (CSE), ליצור 100% CSE על ידי ציור העשן מהסיגריה מחקר 1 אוניברסיטת קנטאקי (3R4F) באמצעות 25 מיליליטר של מדיה מלאה בבקבוק ביכנר מעל 2 דקות 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 24 שעות בCSE 4 מיליליטר 1-4% בדילול מלא בתקשורת. לאחר דגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של PBS סטרילי החם, לפני החלפה עם תקשורת מלאה טרי 4 מיליליטר. הערה: תאי פגיעה בריכוזים גבוהים של תמצית עשן סיגריות (&gt; 5%) יכול להפחית באופן משמעותי מפגש. </li></ol> 2. יצירת Scratch <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית, להסיר את המכסה מצלחת 60 מ&quot;מ של תאי גזע פגומים, ולהניח קצה ישר (לדוגמא שליט פלסטיק מעוקר) ACרוס השפה העליונה של הצלחת. מבלי להסיר את התקשורת, השתמש טיפ pipet סטרילי 200 μl מונחה על ידי סטרילי הקצה ישר לעשות 03:59 סריטות מקבילות פני הצלחת מלבד כ 5 מ&quot;מ ו -50 מ&quot;מ ארוך. הערה: קצה ישר ממזער את כמות ההתאמות הדרושות כדי סיבוב הצלחת כאשר הוא על הבמה מיקרוסקופ. זה הכרחי כי השריטות מופיעות אנכיות לחלוטין (או אופקית) על המסך. יצירת סריטות מרובות על צלחת 60 מ&quot;מ אינו משנה את המיקרו-הסביבה, באופן שמשפיע על נדידת תאים (מידע לא מוצג), אבל יכול להיות שיקול לסוגי תאים אחרים. השימוש בבארות קטנות יותר אינו מומלצת שכן ההשתנות של תאים גדלה קרוב לקצה של הבאר הופכת בולטת יותר ועלולה להשפיע על דור אחיד של סריטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת ולשטוף בעדינות את הצלחות עם 2 מיליליטר של מדיה מלאה מראש חימם כדי למנוע מתאים מהדבקות במרכז של השריטה, וכדי להסיר תאיםים שכבר שחרר את ידי הגירוד. החלף עם 4 מיליליטר של מדיה מלאה טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סמן קבע סטרילי, לתייג כל שריטה מ 1-4 על החלק התחתון של הצלחת במיקום זה לא יפריע הדמיה השריטות. הערה: חשוב שתמונות מאותו מאפס הן בהשוואה לפני ואחרי ההגירה, שכן יש יכולה להיות וריאציה ברוחב מאפס. </li></ol> 3. לוקחים תמונות ראשוניות של השריטה הערה: אם assay השריטה מתבצע על צלחות מרובות, מומלצת שהתמונות ראשוניות של כל השריטות על צלחת אחת נלקחות לפני סריטות נעשות על הצלחת הבאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ לעומת שלב הפוך עם מצלמה כדי ליצור את התמונות דרושות לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צלחת התרבות על המיקרוסקופ, ולהשתמש במטרת צריכת החשמל הנמוכה (10X) כדי לאתר # שריטה 1. אם עיבוי על המכסה של צלחת תרבות פגיעה מתאר לעצמי ברור<html> דואר של התאים, להשתמש תפאורה מחוממת ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על השריטה לחלוטין אופקי ובמרכז שדה הראייה, להשיג תמונות רבות כמו צורך להקיף 90% מהאורך של השריטה. להשיג תמונות של חלקים שונים של השריטה ללא חפיפה בין תמונות. הערה: השבירה של אור בשולי צלחת תרבות overexposes תמונות, מה שהופך אותם בלתי אפשרי לנתח. לכן, לא לוקח תמונות מהראשונה ואחרונים 5% מהאורך של השריטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור תמונות מכל שריטה בתיקייה נפרדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2-3.4 לסריטות 2, 3, ו -4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחות לחממה מייד לאחר הדמיה ראשונית. בואו תאים לנדוד ל4-7 שעות. הערה: 7 שעות היא אופטימליות כאשר הערכת MSCs פגום עם מנוע חיפוש מותאם אישית. דוגרים תאים ליותר מ -7 שעות אינם מומלצים משום שהתפשטות תאים יכולה לפעול כמשתנה מתערב לנדידת תאים (ראו הערה אופציונלית 8.2 להלן). </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. ניתוח תמונות Scratch ראשוניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד ImageJ ולהתקין את תוסף ריפוי פצע הכלי (עיין בטבלה של חומרים / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התמונה בImageJ, לאחר מכן לחץ על &quot;תהליך&quot; ו- &quot;מצא את הקצוות&quot; כדי להדגיש את התאים המקיפים את השריטה לכלי ריפוי פצע כדי לחשב את השטח מאפס (איור 2). לאחר מכן, לחץ על &quot;תמונה&quot;, &quot;להתאים&quot;, &quot;סף צבע&quot; ובתפריט הנפתח שכותרתו &quot;צבע סף&quot; לשנות את הערך ל&quot; B &amp; W. &quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך התפריט &quot;סף צבע&quot;, להתאים את שני מחווני סף הבהירות עד ניגוד אופטימלי בין חזית השריטה ותא מושגת. כדי לאפשר למגוון הרחב ביותר כאשר מנסה ליצור ניגוד בתמונה, הזז את המחוון התחתון לחלוטין לימין (תמונה שחורה לחלוטין), ולאחר מכן להתאים את המחוון העליון כדי ליצור ניגוד מרבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להתאים את BRI העליוןמחוון ghtness משמאל לימין עד לתמונה נקיה מציגה את קווי המתאר של השריטה (איור 2 ג). ברגע שהקצוות של השריטה זוהו, לחץ על &quot;כלים נוספים&quot; בסרגל כלי ImageJ, בחר &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; מהתפריט הנפתח, ולחץ על הכפתור &quot;m&quot; (שיופיע בסרגל כלי ImageJ) כדי להדגיש את אזור השריטה ופלט האזור ממוחשבים בחלון פופ-את תוצאות (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעתיק ולהדביק את כל המספרים מחלון התוצאות (איור 2E) לגיליון אלקטרוני Excel. הקפד להפריד נתונים משריטות בודדות. </li></ol> 5. לוקחים תמונות סופיות של השריטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים היגרו (4-7 שעות), חזור על שלבים 3.2-3.4. תמונת הצלחות באותו סדר שהם גירדו כך שתאים על כל צלחת היו זמן שווה להגר. הערה: ניתן הדמיה התאים בנקודות זמן מרובות, בהתאם Sensitivity לשני שינויי הטמפרטורה וחומציות. לחלופין, הדמיה תא חי יכולה להשתמש כדי לעקוב אחר התאים בזמן אמת כפי שהם נודדים. </li></ol> 6. ניתוח תמונות Scratch סופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2-4.5 לתמונות מאפס סופיות. </li></ol> 7. חישוב שטח Scratch לכמת הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את השטח שלפני ההגירה הממוצעת על ידי חישוב ממוצע ערכי שטח הראשוניים של השריטות בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום הכולל של הגירה על ידי הפחתת השטח הסופי הגירה לכל תמונה, מחושב בשלב 6, מהאזור הממוצע טרום ההגירה (שלב 7.1). ליצור רשימה של ערכים עבור כל שריטה המייצגת את השינוי בהגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת נתונים משריטות מרובות באותה קבוצת הבדיקה (כלומר כל הצלחות וכל השריטות על תאים שנחשפו לCSE 0%). השתמש בניתוח של מבחן שונות לנתח את ההבדלים בין קבוצות ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים הם איטיים להגרודורש זמן דגירה ארוך יותר לאחר הגירוד (יותר מ 10-12 שעות), לבצע BrdU או assay התאגדות edu 19 כדי לקבוע אם תאים עוברים כל התפשטות בתקופה שבי assay ההגירה מתרחש. בחר זמן assay הגירה כדי למנוע התפשטות תאים משמעותית. </li></ol> 8. אופציונליים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להעריך האם הזדקנות תא משמעותית מתרחשת כתוצאה מהליך הגירוד, לבצע assay Beta-galactosidase הקשורים הזדקנות על צלחת בדיקה בזמנים שנקבעו מראש לאחר מגרד 19. </li></ol>

<ol>
	<li>Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative,+facile,+and+high-throughput+image-based+cell+migration+method+is+a+robust+alternative+to+the+scratch+assay.">A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).</li><li>Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).</li><li>Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+or+stromal+cells:+a+review+of+clinical+applications+and+manufacturing+practices.">Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices.</a> Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).</li><li>Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+alters+nuclear+shape+and+reduces+cell+motility+in+three+dimensional+model+substrates.">Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+Integrin+Regulates+Lamellipodia+Protrusion+Via+a+Focal+Complex/focal+Adhesion-Independent+Mechanism.">Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).</li><li>Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+wound+healing+effect+of+Calendula+extracts+using+the+scratch+assay+with+3T3+fibroblasts.">Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts.</a> J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-conditioned+medium+accelerates+skin+wound+healing:+an+in+vitro+study+of+fibroblast+and+keratinocyte+scratch+assays.">Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays.</a> Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).</li><li>Goetsch, K. P., Niesler, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+scratch+assay+for+in+vitro+skeletal+muscle+wound+healing+analysis.">Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis.</a> Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).</li><li>Chung, C. A., Chen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li><li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates.">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li><li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy.">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li><li>McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+fibroblastic+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+lung+are+highly+enriched+in+the+sca-1+positive+cell+fraction.">Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction.</a> Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).</li><li>Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival,+Persistence,+Paracrine+Expression,+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung.">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li><li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aging+on+the+regenerative+properties+of+bone+marrow-,+muscle-,+and+adipose-derived+mesenchymal+stem/stromal+cells.">Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells.</a> PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).</li><li>Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+extract+on+human+airway+smooth+muscle+cells+in+COPD.">Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD.</a> Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).</li><li>Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטת כמותית חזקה, תקנית לבצע ולנתח מבחני מאפס. מבחני שריטה פשוטים משמשים באופן שיגרתי בתחומים רבים ושונים של מחקר לבחון הגירה סלולרית. עם זאת, באופן מסורתי assay השריטה חסר פרוטוקול הגדרה וכימות סטנדרטי, מה שהוביל לבעיות בשחזור 7,10. רבים מ...

נדידת תאים היא מתואמת ביותר וחיונית לתהליכים פיסיולוגיים רבים כגון פיתוח רקמות, תיקון, והתחדשות, כמו גם תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן וטרשת עורקת 1. הבנה של נדידת תאים רלוונטית במיוחד לטיפולים מתעוררים משמשים לתיקון רקמות פגועות וטיפול במצבים פתולוגיים, כולל טכנולוגיות השתלת תאים ורקמות מלאכותיות השתלת 2. לאור ההתעניינות הנוכחית בתפקיד של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) בתיווך רקמת תיקון 3, כימות יכולת הנדידה של תאים אלה באמצעות assay שהוא בקפדנות לכימות, להתאמה, והוא עניין חסכוני. חשוב לציין, assay כזה חייב להיות רגיש מספיק כדי לזהות שינויים עדינים יחסית ביכולת נדידה סלולרית לאחר נזק. שיטות קיימים לכימותי נדידת תאים, כולל מבחני מאפס, מבחני הגירת טרנס היטב (CH וידןambers), מערכי micropillar, ומבחני אזור הדרת תא יש מגוון של מגבלות בשחזור, ההתאמה האישית, כימות, ועלות-תועלת 1,4,5. Assay השריטה מותאמת המתואר כאן מדגים תוצאות חזקות, יכולות ניתוח וכימות מבוסס תמונה, עלות-תועלת, והתאמה ליישומים אחרים. מבחני גירוד שימשו בתפקידים מרובים להעריך נדידת תאים והתרבות בתנאי ניסוי שונה 5. Assay כרוך זריעת התאים הייעודיים, גידולם כדי להשלים או מפגש קרוב, ומגרד את monolayer התוצאה עם מחט סטרילית או קצה pipet 6. ניתוח מבוצע בדרך כלל על ידי השוואת הרוחב של השריטה על נקודות זמן מרובות במקומות שנבחרו באקראי 7-9. למרות השימוש הבולט שלה, assay השריטה הוא מבולבל על ידי בעיות עם שחזור וכימות. השתנות בדור של השריטה לא רק משנה את המיקרו-הסביבה של התאים, אבל גם יכול לעכב נדידת תאים על ידי פגיעה במשטח הצלחת ותאית-מטריצה ​​בסיסית 5. מבחני נערכים בתדירות גבוהה מעל 7 לשעה 12, לעומת זאת לשורות תאים בו מוצגות הגירה ופעמים assay יותר איטיות, ריבוי הופך 7,10 משתנים בלבול. לבסוף, תאים מזדקנים שנוצרו על ידי תהליך הגירוד יכולים לשחרר גורמים שמפריעים לאיתות תאית הדרושה כדי לסגור את הפער בשכבה 1. אופטימיזציה של assay מאפס דורשת יצירת פער עקבי שאינו מפריע למאפייני שטח, מזעור אורך זמן assay, ומניעת מוות של תאים לא רצוי במניפולציה. Assay מבוסס פקק הוא אופטימיזציה של assay אזור הדרת תא. assay זה מנצל פקק ממוקם באמצע גם שאינה כולל צמיחת תאים, אבל מאפשר לתאים להיות מצופים ברחבי אזור ההדרה המרכזי.כדי להעריך הגירה, הפקק מוסר, ואזור הדרת התוצאה מספק משטח להגירה להתרחש. עם זאת, assay זה קשה כדי להתאים אישית או להתאים 10 ועבור יישומים מסוימים, טכניקה זו יכולה גם להיות עלות מונעת. בניגוד למבחנים מאפס ונגזרותיהם, מבחני הגירת טרנס היטב (או מבחני קאמריים בוידן) להעריך הגירה על ידי כימות את מספר התאים שעוברים מתא אחד, דרך קרום מסנן microporous, לתא המכיל סוכני chemotactic 8,11, 12. טכניקה זו מוגבלת שירות עבור תאים חסיד כמו MSCs כי בעקבות הגירה דרך הקרום הנקבובי, תאים לדבוק בצד הקרום נחשף לסוכני chemotactic, ויכולים להיות קשה לכמת במדויק. בעוד assay הוא מסוגל לבחון כמה דפוסי הגירה תלת-ממדיים, סוגים המוגבלים התא שהוא מסוגל לכמת מגבלת נדידת תאי השירות שלה בצורה מדויקת 10. חלופה נוספת למבחני שריטה משתמשת מערך מיקרו-עמוד, אשר מודד תנועתיות סלולרית דרך מרחב תלת-ממדים באמצעות היכולת של תאים כדי לעוות ולהעביר לתוך המערך כפונדקאי. Polydimethlysiloxane אלסטומרים (PDMS) נרפאו על עובש מדויק וטופלו באוזון ופיברונקטין מייצר מייקרו-סביבה הומוגנית ואינו מתכלה. מרווח מיקרו-עמוד גם יכול להיות מגוון לפי צורך לאמוד את יכולתם של תאים להיכנס למערך 4. העובש נוצר באמצעות תחריט יון תגובה עמוק של פרוסות סיליקון כדי ליצור גרסה שלילית של מערך יחס רוחב-גובה הגבוה 13. בעוד assay מתחזק על ידי ההתאמה האישית שלה, היכולת לבנות מודל תלת ממדי הגירה, וניתוח באמצעות הדמיה ישירה של תאים נודדים, קושי ביצירת מערכי מיקרו-כלכלי עמוד מעכב השימוש הנרחב שלה. Assay השריטה מותאמת מתואר בפרוטוקול זה מספק יעיל, cosשיטה לא יעילים להפקת סריטות עקביות שניתן לנתח באמצעות תוכנה זמינה באופן חופשי. במקום מדידות רוחב פשוט עשו על פני השריטה לפני ואחרי נדידת תאים, התוכנה מאפשרת למשתמש לקבוע כלל אזורי מאפס לפני ואחרי ההגירה. קידום זה מגביל את סוגיית מנסה לקבוע היכן השריטה צריכה לקחת מדידות הרוחב, ואם הרוחב של השריטה הוא אחיד לכל אורכו של. בנוסף, אופטימיזציה זהירה של מספרים סלולריים, מפגש תא ואת הסוג ומידת הנזק שנגרם לתאים נדונה על מנת לייעל את assay נוסף.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

מבחני השריטה שהוצגו כאן בוצעו באמצעות תאי סטרומה mesenchymal עכברי תושב ריאות (LR-MSCs) ומבודדים שבסימוכין בביאורים הפרוטוקול. LR-MSCs היה זורעים בצפיפות של 500,000 תאים בצלחת תרבית רקמת 60 מ&quot;מ, וגדל למפגש 90% ב- 48 שעות. כדי ליצור נזק, מנוע חיפוש מותאם אישית של 4% (שתואר לעיל) הודגר עם ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract at JoVE

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

optimization-wound-scratch-assay-to-detect-changes-murine-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.9K Views.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Video: Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Explants Keratocyte דג הזברה לחקר הגירה קולקטיבית סלולארי וReepithelialization בריפוי פצע עורית

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...