وأيد هذا العمل في جزء من المنح NIH R21 DE023311 (APM)، R56 AI111836 (APM وSGF)، R01 AI054928 (SGF)، وR01 DE017088 (SGF).

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في معهد البحوث الطبية الحيوية لوس انجليس (بروتوكول 011،000) ونفذت وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة (NIH) مبادئ توجيهية من أجل المعاملة الأخلاقية للحيوانات. تم قفص الفئران في منشأة AAALAC المعتمدة تقع في حرم هاربور UCLA معهد البحوث والتعليم. طبيب بيطري متفرغ متخصص في الطب الحيوانات المختبرية أشرف رعايتهم. وقدمت الحبس وتربية فقا للمبادئ التوجيهية في خدمة الصحة العامة الأميركية نشر &quot;دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية&quot;. تم بذل كل محاولة لعلاج الفئران إنسانية. تم رصد بقاء وصحة الفئران ثلاث مرات يوميا. ومن الواضح أن تم فصل المريضة والفئران السبات العميق من مجموعة والموت الرحيم للحد من المعاناة. الموت الرحيم كانت الفئران التي كتبها جرعة زائدة بنتوباربيتال (210 ملغ / كلغ)، على النحو الموصى به من قبل الفريق المعني Euthanasالجيش العراقي للجمعية الأمريكية للطب البيطري. 1. إعداد الأنسجة، الكواشف والصكوك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الذكور BALB / ج الفئران الترجيح 20-22 غرام لجميع الدراسات. تطعيم ثلاثة الفئران في المجموعة التجريبية عن طريق الوريد مع 1 × 10 6 الخميرة المرحلة C. الخلايا البيض. تضحية الحيوانات والكلى الحصاد عند نقاط زمنية محددة بعد الإصابة. وضع كل الكلى في أنبوب سقف المسمار، والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة RNA لاحق استخراج 6. ملاحظة: وقد تم إجراء التجارب على الحيوانات خارج كما هو موضح بالتفصيل في زو وزملاؤه 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الكواشف والصكوك التالية قبل إزالة الكلى من -80 ° C الفريزر: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الإجمالية عدة استخراج الحمض النووي الريبي. إضافة 2 المركابتويثانول (1٪ V / V) لالعازلة RLT وتخلط جيدا (إعداد 2 مل لكل عينة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي 25: 24: 1 (تحتاج 600 ميكرولتر لكل عينة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية M-نوع أنابيب التجانس (M-أنبوب) والبرد على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسمية 2 مل المسمار الأنابيب كأب، وإضافة ما يقرب من 300 حبات الزركونيا ميكرولتر إلى كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي الاختيار الأدوات المتاحة: dissociator الأنسجة، beadbeater، منضدية أجهزة الطرد المركزي مع محولات ل50 مل أنابيب و 96 لوحات جيدة، مضواء. </li></ol></li></ol> 2. استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة المصابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنابيب التي تحتوي على الكلى من -80 ° C الثلاجة ووضعها على الجليد. إضافة 1.2 مل العازلة RLT مع 2-المركابتويثانول لكل الكلى. صب الكلى مع العازلة إلى M-نوع أنابيب التجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الكلى باستخدام dissociator الأنسجة على محمل مسبقا الإعداد RNA_02.01. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة في جهاز للطرد المركزي الطاولة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 600 ميكرولتر جناسة لأنبوب سقف المسمار تحتوي على حبات الزركونيا. حفظ جناسة المتبقية على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 الفينول ميكرولتر: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي 25: 24: 1 لالأنابيب من الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الأغطية بإحكام ودوامة على beadbeater لمدة 3 دقائق في غرفة باردة 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 5 دقائق في غرفة باردة 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية المرحلة المائية إلى 1.5 مل microfuge أنبوب جديد، وتخلط جيدا مع حجم مساو من الايثانول 70٪، ثم تحميل على عمود الدوران (الحمل مرتين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل عمود الدوران مرة واحدة مع 700 ميكرولتر RW عازلة، تليها مرتين مع 500 ميكرولتر العازلة RPE. واحدة الطرد المركزي دقيقة اضافية في أنبوب جمع جافة لإزالة السائل المتبقي في عمود الدوران. تنفيذ كافة الخطوات الطرد المركزي في 8000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل RNA مع 50 ميكرولتر H 2 O. قياس تركيز الحمض النووي الريبي في OD 260 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. </li></ol> 3. التنميط التعبير الجيني باستخدام الرقمية من الترميز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد codeset مراسل (الأخضر أنبوب كاب) والقبض على codeset (الرمادي أنبوب الغطاء) على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 130 ميكرولتر العازلة التهجين إلى إعادةحمال codeset، عكس لخلط وتدور باستمرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من مزيج لكل من أنابيب رد فعل 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة (في حجم 5 ميكرولتر) إلى كل أنبوب. مزيج من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر القبض codeset إلى كل أنبوب. مزيج من قبل التقليب أنبوب تليها دوران سريع أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ردود الفعل عند 65 درجة مئوية في cycler الحرارية مع غطاء ساخنة O / N (~ 18 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أحد خرطوشة عينة من -20 ° C والسماح لها دافئ لRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة اثنين من لوحات الكاشف من 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 670 x ج لمدة 2 دقيقة في جهاز للطرد المركزي الطاولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء محطة الإعدادية التالية خطوة بخطوة تعليمات على الشاشة، حدد الخيار حساسية عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ردود الفعل من cycler الحرارية وتحميل مباشرة على محطة الإعدادية. حدد لتشغيل البرنامج حساسية عالية (3 ساعات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما برنامج محطة الإعدادية كاملة، إزالة خرطوشة وختم الممرات مع شريط واضح. ا ف برقائق الزيوت المعدنية في الجزء السفلي من خرطوشة (لجيل واحد nCounter فقط، في وقت لاحق أجيال لا تتطلب هذه الخطوة)، ثم تحميل خرطوشة على محلل الرقمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلل الرقمية التالية خطوة بخطوة تعليمات على الشاشة، حدد خيار المسح عالية الدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخيار (600 الحقول) ارتفاع القرار، قم بتشغيل برنامج المسح الضوئي (~ 4.5 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما برنامج المسح كاملة، تحميل النتائج (أو اختيار لتلقي النتائج عن طريق البريد الإلكتروني)، واستيراد البيانات الخام إلى برنامج الشركة المصنعة. يقوم البرنامج تلقائيا الاختيار نوعية البيانات ورفع الأعلام إذا كانت نوعية البيانات تقع خارج نطاق العادي. أداء التعديل الفني باستخدام المدمج في وظيفة (اختياري، اتبع التعليمات في البرنامج)، ثم تصدير البيانات كملف اكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع البيانات باستخدام إحدى الطرق التالية: العدد الكلى من جميع الجينات في codeset. واحد أو عدد قليل من الجينات الرقابة الداخلية. هندسيجينات أعرب غاية (انظر المناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب القيم التعبير يعني لكل الجين (إذا تم إجراء التجربة في مكررات أو يثلث)، ثم حساب نسبة مستويات التعبير بين المجموعات التجريبية المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) تحليل وتصور نتائج التنميط التي كتبها المدمج في وظائف في البرمجيات nSolver أو برنامج التجميع مثل MultiExperiment عارض 10. </li></ol>

<ol>
	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

تم تطوير هذا البروتوكول لتحسين النسخي اصابة الميكروبات باستخدام منصة nanoString nCounter. الإجراء بأكمله، من جمع الأنسجة لبيانات التعبير، يتطلب أقل من 48 ساعة. التدريب العملي على الساعة حوالي 4 ساعات لمدة 12 عينات. واحد متغير رئيسي في هذا البروتوكول هو مقدار عازلة RLT تضاف إلى الأنسجة في الخطوة الأولى. والكثير من عازلة تمييع جناسة ويؤدي إلى خفض تركيز الحمض النووي الريبي، بينما عازلة القليل جدا قد يؤدي إلى تشكيل المواد الهلامية اللزجة بعد خطوة الاستخراج الفينول الكلوروفورم وترك أي المرحلة المائية لتحقيق الانتعاش RNA. وحدات التخزين المثلى تحدد تجريبيا من RLT العازلة للأنسجة الماوس (على افتراض أحجام نموذجية) هي: الكلى (1.2 مل)، واللسان (1.0 مل) والرئة (2.0 مل). بالنسبة لمسببات الأمراض الجرثومية، وخصوصا هذه التي تزرع في شكل الخيطية، وخطوة بفوزه على حبة يساعد على كسر فتح جدار الخلية سميكة لاطلاق سراح تماما محتويات الخلوية. في خطوة شطف، من أجل زيادة RNA النهائيالتركيز، أول شطافة مستديرة ويمكن أن يضاف إلى العمود، وأزل مرة ثانية. حوالي 100 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة يمكن استردادها من واحد العمود RNeasy تدور (~ 2 ميكروغرام / ميكرولتر × 50 ميكرولتر). إذا كانت هناك حاجة أكبر كمية من الحمض النووي الريبي، والإعدادية الثاني يمكن أن تكون مصنوعة من جناسة الأنسجة المتبقية. لا تتخلص من جناسة المتبقية حتى تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي، فقط في حالة. اعتمادا على نموذج العدوى، وحجم قيحة وسلالة الممرض، نسبة الممرض RNA في الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة يختلف من 0٪ -2٪، وعادة ما يندرج ضمن 0.05٪ -0.5٪ النطاق. على سبيل المثال، 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة من C. إصابة البيض الكلى يمكن أن تولد التهم الخام مساوية ل10 نانوغرام من الذهب الخالص C. البيض RNA من ثقافة في المختبر (10 نانوغرام / 10 ميكروغرام = 0.1٪). لأن نسبة الممرض RNA في الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة تختلف في نطاق واسع، فإنه من الصعب أن نعرف كمية pathogeن RNA في كمية معينة من مجموع RNA. لتجنب هدر codeset (250 جينات X 192 ردود الفعل، والتكلفة لكل رد فعل حوالي 200 $) على عينات الحمض النووي الريبي مع الممرض دون مستوى الكشف، قد يتم تنفيذ خطوة لمراقبة الجودة RNA لتحديد مستوى الممرض RNA داخل كل عينة. ويمكن القيام بذلك عن طريق إما Q-RTPCR أو codeset صغيرة تحتوي على عدد قليل من الجينات التدبير المنزلي. التطبيع باستخدام الجينات الممرض هو خطوة حاسمة قبل ملامح التعبير يمكن مقارنة بين عينات مختلفة. هناك ثلاث طرق شائعة الاستخدام للتطبيع. 1. استخدام العد الكلي من جميع الجينات في codeset. 2. استخدام واحد أو عدد قليل من الجينات &quot;التدبير المنزلي&quot;. 3. استخدام الوسط الهندسي (N عشر الجذرية للمنتج من الأرقام N) من الجينات التي أعرب عنها إلى حد كبير. لcodeset كبيرة (&gt; 100 الجينات) التي تحتوي على تحقيقات تم اختيارها عشوائيا، وذلك باستخدام العدد الكلى للتطبيع يمكن أن يكون خيارا جيدا، لأن العد الكلي لعدد كبير من الجينات لا علاقة لها قد الإيمانيعكس تماما كمية المدخلات RNA. لcodeset صغيرة (&lt;100 الجينات) التي تحتوي تركز على عملية معينة المسابير (مثل نمو خوطي، بالنظر إلى أن جينات النمو خوطي تميل إلى أن يشترك تنظيم)، واختيار واحد أو عدد قليل من الجينات التدبير المنزلي عن السيطرة لتطبيع أمر ضروري. TDH3، جين الأيض أعرب بقوة، وقد خدم كذلك التحكم في العديد من التجارب. الطريقة الثالثة هو مزيج من أسلوب 1 و 2، مع التركيز على مساهمة متساوية من الجينات التي أعرب عنها إلى حد كبير. على الرغم من أن منصة nCounter لا الجينوم، فإنه يسمح الكمي لمستوى التعبير لمدة تصل إلى 800 الجينات في فحص واحد. لذلك، واختيار الجينات أكبر قدر من المعلومات لتحليل هو أمر حاسم لنجاح التنميط. وقد استخدمت نهجين لتحديد للتحقيقات. النهج الأول هو &quot;قائم على المعرفة&quot;. يتم تصنيف المعلومات من التعبير المنشورة والبيانات الوظيفية للكشف عن الجينات التي تنطوي على أهمية محتملة للتياردراسة مثل جينات الاستجابة البيئية 6-9. هذا النهج يتيح المقارنة سهلة لفي الجسم الحي التنميط البيانات إلى العديد من قواعد البيانات الموجودة، وبالتالي توفير إطار لتفسير البيانات. النهج الثاني هو &quot;استكشاف أساس&quot;. ويتم اختيار فئة من الجينات في الجينوم ميكروب، مثل كل الجينات تحديد عوامل النسخ، تحركات أو البروتينات جدار الخلية للتحقيقات. هذا النهج يتيح تحديد عوامل الفوعة جديدة واكتشاف علاقات تنظيمية جديدة على أساس المجراة التنميط البيانات 6.

ديناميات التعبير الجيني يحمل معلومات حيوية عن كيفية استجابة الخلايا للتغيرات البيئية. في حالة وجود ميكروب إصابة، يمكن للبيانات التعبير الجيني تقديم رؤى ذات الصلة سريريا على كيف يتكيف الممرض للبيئة عدوى ويسبب ضررا لالمضيف. في العقدين الماضيين، وقد ولدت دراسات التعبير الجيني على حد سواء في التجارب المختبرية والحية كمية كبيرة من البيانات وضعت أساسا لفهم العدوى البيولوجيا 1-3. ومع ذلك، والتكنولوجيات التنميط الحالية بما في ذلك ميكروأري وRNAseq، ليست هي الأمثل لالتنميط التعبير الجيني الممرض خلال العدوى. استضافة يشكل RNA وهو جزء الساحقة (عادة&gt; 99٪) من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن عينات الأنسجة المصابة. يساهم RNA المضيف إلى خلفية عالية على المجهرية، ويهيمن تسلسل يقرأ من RNAseq. عزل الخلايا الممرض من الأنسجة المصابة، من الناحية النظرية، يمكن أن تساعد على إثراء لالممرض RNA، ولكنه يطرح بالإضافةمشاكل سورة: أنه يتطلب كميات كبيرة من الأنسجة المصابة. هذا الإجراء يمكن أن تكون مملة. والأهم من ذلك، فإنه من الصعب للحفاظ على الدولة الأم أو سلامة RNA خلال عملية طويلة. من أجل توليد المزيد من البيانات شاملة ودقيقة عن العوامل المسببة للأمراض التعبير الجيني خلال العدوى الحقيقية، شرعنا في وضع بروتوكول يسمح الكمي موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لأنواع RNA أقلية في عدد السكان RNA مختلطة. NanoString nCounter هو منصة وضعت مؤخرا أن يجعل قياس المضاعفة المباشر في التعبير الجيني باستخدام الرقمية أزواج التحقيق شريط مشفر 4، 5. هذه المنصة لديها مستوى حساسية مماثلة لتلك التي من QRT-PCR ولكن لا تتطلب التضخيم الأنزيمية. التكنولوجيا ليست واسعة الجينوم، لأنها تتيح الكشف عن ما يصل الى 800 جينات مختلفة في كل فحص. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحديد الجينات بالمعلومات كما تحقيقات لتحديد ملامح. هنا نستخدم التعبير الجيني التنميط دراسة همهمة الرئيسيةالممرض، المبيضات البيض، أثناء وجود عدوى الغازية على سبيل المثال، لإثبات: 1) التفاصيل الفنية للإجراءات التجريبية (بروتوكول)، 2) الحساسية، واستنساخ والنطاق الديناميكي لهذه الطريقة (نتائج ممثل)، و 3) هام اعتبارات لتصميم وإجراء التجارب على أساس هذا البروتوكول (مناقشة). هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لمختلف مسببات الأمراض وطبقت بنجاح في عدد من نماذج العدوى 6-9.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

بالنسبة لمعظم مسببات الأمراض الثدييات والتعبير الجيني التنميط الدراسات كانت محدودة بسبب الصعوبات التقنية لتحديد بدقة النصوص الممرض الجينات من الأنسجة المصابة. يشكل الممرض RNA جزء صغير جدا من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن عينات الأنسجة المصابة. كلا ميكروأري والتكنولوجيات RNAseq صعوبات في توليد موثوقة يقرأ عن الجينات الممرض أعرب ضعيفة. سلالات الممرض متحولة مع انخفاض في انتشار فيفو تشكل تحديا أكبر. نحن هنا وصف في الجسم الحي التعبير الجيني بروتوكول التنميط هذا هو سريع جدا وحساسة للغاية وتكرار للغاية. وضعنا هذا البروتوكول خلال تحقيقنا للالفطرية البيض الممرض المبيضات في نموذج الفئران من داء المبيضات نشر hematogenously. استخدام هذا البروتوكول، ونحن قد وثقت الدورات وقت ينظم حيوي C. البيض التعبير الجيني خلال عدوى في الكلى، وميزات غير متوقعة اكتشف منردود التعبير الجيني للفطريات العلاج من تعاطي المخدرات في الجسم الحي.

واحد يتمثل التحدي الرئيسي للتعبير عن العوامل المسببة للأمراض الجينية التنميط في الجسم الحي هو الحصول على ما يكفي من يقرأ الممرض RNA. ونظرا لانخفاض نسبة النصوص الممرض في الحمض النووي الريبي مجموع، كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي مجموع (&gt; 10 ميكروغرام) لديها لاستخدامها في كل رد فعل. منصة لديها ميزة فريدة من نوعها في هذا المنظور: فهو يستخدم كل مسبار القبض والتحقيق تقرير لزيادة الخصوصية، بحيث الكم الهائل من الحمض النووي الريبي المضيف لا يسبب قدرا كبيرا من الضوضاء. كما هو مبين في الشكل 1 (مقتبس من المرجع 6)، وكانت التهم الخام خلفية من عينة الأنسجة غير المصابة (النقاط الحمراء) عن أقل من 10، في حين كانت التهم الخام من عينتين الأنسجة المصابة (النقاط الزرقاء) عن أعلى 10. البيانات التعبير المتولدة باستخدام هذا البروتوكول هي تكرار للغاية. كما هو مبين في الشكل 1 (مقتبس من المرجع 6)، التهم الخام من اثنين مكررات البيولوجية (النقاط الزرقاء، وعينات الكلى بعد العدوى 48 ساعة) كان غو جداد الارتباط، مع قيمة-R مربع يساوي 0.945. يوفر منصة أيضا مجموعة ديناميكية كافية لتشمل مستويات التعبير البيولوجية الطبيعية (الشكل 1، وتراوحت التهم الخام بين 10 و 10 1 6). باستخدام مجموعة التحقيق تحديد 248 جينات الاستجابة البيئية، كنا قادرين على تمييز مرحلتين التعبير الممرض الجين (الشكل 2، مقتبس من المرجع 6): تتكون في وقت مبكر الجينات استجابة التعبير الجينات مع مستويات RNA مختلفة إلى حد كبير بين اللقاح و 12 ساعة عينات بعد الإصابة (P &lt;0.05 و&gt; تغير 2 أضعاف في التعبير)، واستجابة التعبير أواخر الجينات تتكون الجينات مع مستويات RNA التي تختلف بشكل كبير بين نقطة زمنية 12 ساعة على 48 ساعة عينات بعد العدوى (P &lt;0.05 و&gt; تغير في التعبير 2 أضعاف). هذه النتائج تشير إلى أن C. وينظم البيض التعبير الجيني ديناميكيا اثناء infectio الغازيةن من مجموعة الثدييات. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> الشكل 1. التهم الخام من أنسجة الكلى المصابة وغير المصابة (مقتبس من المرجع 6). مسبار يهم لمدة المصاب (48 ساعة بعد الإصابة، ونقاط البيانات الزرقاء) واحد (نقاط البيانات الحمراء) غير المصابة يتم عرض عينات الكلى كما مبعثر المؤامرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> الشكل 2. التعبير عن C. البيض الجينات التي تستجيب للبيئة خلال العدوى الغازية (مقتبس من المرجع 6). التغيرات في مستويات التعبير أثناء الغزو الكلى الماوس ل248 C. يتم عرض الجينات البيض في الحرارة ومتنسيق ا ف ب. يتم عرض القيم المتوسطة من يثلث البيولوجية ليصل التنظيم (الصفراء) وأسفل تنظيم (الأزرق) من الجينات في 12 و 24 و 48 ساعة بعد العدوى بالنسبة لتعني مستويات اللقاح (0 ساعة). يمثل تشبع اللون ومدى التغير التعبير، مع التشبع الكامل في 10 أضعاف حتى- أو لأسفل التنظيم. يتم توسيع أجزاء من حرارة خريطة لتوضيح ممثل في وقت مبكر يصل ينظم الجينات (أعلى) والجينات في وقت متأخر (وسط)، والجينات في وقت مبكر ينظم أسفل (أسفل). في هذه الأجزاء، يتم عرض عينات فردية على حدة لتوضيح التكاثر. نحدد التغييرات التعبير في وقت مبكر كما فروق ذات دلالة إحصائية بين اللقاح و 12 عينات ساعة. نحدد التغييرات التعبير في وقت متأخر كما فروق ذات دلالة إحصائية بين عينات ساعة 12 و 48. يشير أهمية للتغيرات في&gt; 2 أضعاف وف قيمة &lt;0.05. تم تطبيع البيانات لكل عينة إلى مستويات الحمض النووي الريبي من TDH3 التحكم الجيني قبل احتساب متوسط ​​القيم. معايير مهمة تسمح لنا بعض dynamicaالجينات تنظيم LLY الوقوع في كل من فئات التعبير المبكرة والمتأخرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform at JoVE.com

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Views.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Video: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetics

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

مؤشر تنافسي رقمي قائم على PCR لتحليل عالي الإنتاجية للياقة البدنية في السالمونيلا

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

تحليل صورة التشفير الشريطي المتعدد للتنميط المناعي وتوصيف الخرائط المكانية في تحليل الخلية الواحدة لعينات أنسجة البارافين

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Cancer Research

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Developmental Biology

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioengineering

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biology

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

تحليل النسخ عالي الإنتاجية للتحقيق في التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...