Name: gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF) e R01 DE017088 (SGF).

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso il Los Angeles Biomedical Research Institute (protocollo 011.000) e svolte secondo il National Institutes of Health (NIH) linee guida per il trattamento etico degli animali. I topi sono stati ingabbiati in una struttura AAALAC accreditati situato nel campus di Harbor-UCLA Ricerca e Formazione dell&#39;Istituto. Un veterinario a tempo pieno che si specializza in medicina degli animali da laboratorio ha supervisionato la loro cura. Ingabbiamento e l&#39;allevamento è stato fornito secondo le linee guida nella pubblicazione &quot;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&quot; US Public Health Service. Ogni tentativo è stato fatto per trattare i topi con umanità. La sopravvivenza e la salute dei topi è stato monitorato tre volte al giorno. Ovviamente malati, i topi sono stati letargici segregati dal gruppo e sacrificati per ridurre al minimo le sofferenze. I topi sono stati sacrificati per overdose pentobarbital (210 mg / kg), come raccomandato dal gruppo di esperti sul Euthanasia della American Veterinary Medical Association. 1. Preparazione di tessuti, reagenti e strumenti <ol><li> Utilizzare topi maschi Balb / c ponderazione 20-22 g per tutti gli studi. Seminare tre topi per gruppo sperimentale per via endovenosa con 1 x 10 6 lievito fasi C. cellule albicans. Sacrificare animali e reni raccolto in punti temporali specifici dopo l&#39;infezione. Mettere ciascun rene in una provetta tappo a vite, scatto congelare in azoto liquido, e conservare a -80 ° C per l&#39;estrazione di RNA più tardi 6. Nota: Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti come descritto in dettaglio nel Xu et al 6.. </li><li> Preparare i seguenti reagenti e strumenti prima di rimuovere i reni da -80 ° C freezer: <ol><li> Aprire un kit di estrazione di RNA totale. Aggiungere 2-mercaptoetanolo (1% v / v) al buffer RLT e mescolare bene (preparare 2 ml per ciascun campione). </li><li> Preparare fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25: 24: 1 (600 microlitri necessità per ogni campione). </li><li> Etichettare le provette tipo M omogeneizzazione (M-tubo) e freddo su ghiaccio. </li><li> Etichetta 2 ml a vite tubi tappo, e aggiungere circa 300 perline Zirconia microlitri per ogni provetta. </li><li> Controllare gli strumenti sono disponibili: dissociatore di tessuto, beadbeater, tavolo centrifuga con adattatori per tubi da 50 ml e 96 pozzetti, fotometro. </li></ol></li></ol> 2. RNA Estrazione da tessuti infetti <ol><li> Rimuovere le provette contenenti reni da -80 ° C freezer e messo in ghiaccio. Aggiungere 1.2 ml di tampone RLT con 2-mercaptoetanolo per ogni rene. Decantare rene con tampone in un M-tipo tubi di omogeneizzazione. </li><li> Omogeneizzare il rene con un dissociatore tessuto sulla pre-caricato impostazione RNA_02.01. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 1 minuto in una centrifuga da tavolo a RT. </li><li> Trasferire 600 microlitri omogeneizzato alla provetta tappo a vite contenente Zirconia perline. Salvare il omogenato rimanente sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 600 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25: 24: 1 ai tubi di passaggio precedente. </li><li> Chiudere i coperchi strettamente e vortex su beadbeater per 3 minuti in un 4 ° C cella. </li><li> Centrifugare le provette a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C in camera fredda. </li><li> Trasferire accuratamente la fase acquosa in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, mescolare bene con uguale volume di etanolo al 70%, quindi caricare sulla colonna di spin (carico due volte). </li><li> Lavare la colonna rotazione una volta con 700 microlitri di buffer RW, seguito da due volte con 500 microlitri di buffer RPE. Centrifugare uno minuto supplementare in un tubo di raccolta asciutto per rimuovere liquido residuo nella colonna di spin. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 8.000 x g. </li><li> Eluire RNA con 50 microlitri H 2 O. Misurare la concentrazione di RNA a OD 260 utilizzando uno spettrofotometro. </li></ol> 3. profilo di espressione genica Utilizzo di Digital di codificazione <ol><li> Thaw codeset giornalista (provetta con tappo verde) e la cattura codeset (provetta con tappo grigio) sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 130 microlitri tampone di ibridazione per la riporter set di codici, capovolgere per mescolare e spin down. </li><li> Aggiungere 20 ml di miscela per ciascuna delle provette di reazione 12. </li><li> Aggiungere 10 mg di RNA totale del tessuto (in un volume di 5 ml) ad ogni provetta. Mescolare pipettando. </li><li> Aggiungere 5 ml di cattura set di codici per ogni provetta. Mescolare girando il tubo seguito da una rapida rotazione verso il basso. </li><li> Incubare le reazioni a 65 ° C in un termociclatore con coperchio riscaldato O / N (~ 18 ore). </li><li> Rimuovere una cartuccia campione da -20 ° C e farlo riscaldare a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere due piastre dei reagenti da 4 ° C e centrifugare a 670 xg per 2 minuti in una centrifuga da tavolo. </li><li> Impostare la stazione della preparazione seguendo le istruzioni passo-passo sullo schermo, selezionare l&#39;opzione alta sensibilità. </li><li> Rimuovere le reazioni dal termociclatore e caricare immediatamente sulla stazione di preparazione. Selezionare per eseguire il programma elevata sensibilità (3 ore). </li><li> Quando il programma stazione della preparazione, rimuovere la cartuccia e sigillare le corsie con un nastro adesivo trasparente. Apply olio minerale per il fondo della cartuccia (per la generazione di una nCounter solo, le generazioni successive non richiedono questo passaggio), quindi caricare la cartuccia sull&#39;analizzatore digitale. </li><li> Impostare l&#39;analizzatore digitale seguendo le istruzioni passo-passo sullo schermo, selezionare l&#39;opzione di scansione ad alta risoluzione. </li><li> Selezionare l&#39;opzione (600 campi) alta risoluzione, eseguire il programma di scansione (~ 4.5 ore). </li><li> Quando il programma scansione, scaricare i risultati (o scegliere di ricevere i risultati via e-mail), e importare i dati grezzi nel software del produttore. Il software controlla automaticamente la qualità dei dati e alzare le bandiere se la qualità dei dati cade fuori del range di normalità. Eseguire la regolazione tecnica usando la funzione built-in (opzionale, seguire le istruzioni del software), quindi esportare i dati in un file excel. </li><li> Normalizzare i dati utilizzando uno dei seguenti metodi: conteggi totali di tutti i geni nel codeset; uno o pochi geni di controllo interno; media geometricageni altamente espressi (vedi la discussione). </li><li> Calcolare i valori di espressione medi per ciascun gene (se l&#39;esperimento è stato fatto in replicati o triplicato), quindi calcolare il rapporto dei livelli di espressione tra i diversi gruppi sperimentali. </li><li> (opzionale) Analizzare e visualizzare i risultati di profilazione di funzioni incorporate nel software nSolver o un programma di clustering quali MultiExperiment Viewer 10. </li></ol>

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	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

Questo protocollo è stato sviluppato per ottimizzare il profilo trascrizionale di infettare microbi utilizzando una piattaforma nanoString nCounter. L&#39;intera procedura, dalla raccolta di tessuto a dati di espressione, richiede meno di 48 ore. I hands-on tempo è di circa 4 h per 12 campioni. Una variabile fondamentale in questo protocollo è la quantità di tampone RLT aggiunto al tessuto al primo passo. Troppo buffer diluire l&#39;omogeneizzato e portare ad abbassare la concentrazione di RNA, mentre troppo poco buffer può portare alla formazione di gel viscoso dopo la fase di estrazione del fenolo cloroformio e non lasciano fase acquosa per il recupero dell&#39;RNA. I volumi ottimali empiricamente determinato di tampone RLT per tessuti di topo (assumendo dimensioni tipiche) sono: rene (1,2 ml), lingua (1,0 ml) e del polmone (2,0 ml). Per patogeni microbici, particolarmente questi coltivate in forma filamentosa, il passo tallone battendo aiuta a rompere parete cellulare spessa per far uscire completamente contenuto cellulare. Nella fase di eluizione, al fine di aumentare l&#39;RNA finalela concentrazione, il primo eluato turno può essere aggiunto di nuovo alla colonna, ed eluire una seconda volta. Circa 100 mg di RNA totale del tessuto possono essere recuperati da una colonna RNeasy rotazione (~ 2 mg / mL x 50 ml). Se è necessaria maggiore quantità di RNA, un secondo preparazione può essere effettuata dal restante omogenato tissutale. Non smaltire dell&#39;omogenato rimanente fino è stata misurata la concentrazione di RNA, per ogni evenienza. A seconda del modello di infezione, le dimensioni dell&#39;inoculo e il ceppo patogeno, la percentuale di patogeno RNA in RNA totale del tessuto varia da 0% -2%, e tipicamente rientra nella gamma 0,05% -0,5%. Ad esempio, 10 mg di RNA totale da tessuti C. albicans infettato rene potrebbe generare conteggi pari a quello di 10 ng di puro C. albicans RNA da una coltura in vitro (10 ng / mg 10 = 0,1%). Poiché la percentuale di patogeno RNA in RNA tissutale totale varia in un ampio intervallo, è difficile conoscere la quantità di pathogen RNA in una data quantità di RNA totale. Per evitare sprechi codeset (per 250 geni x 192 reazioni, il costo per reazione è di circa $ 200) su campioni con patogeno RNA al di sotto del livello di rilevamento, un passo di controllo di qualità dell&#39;RNA può essere eseguita per determinare il livello patogeno RNA in ciascun campione. Questo può essere fatto o Q-rtPCR o un piccolo codeset contenente alcuni geni housekeeping. Normalizzazione usando geni patogeni è un passaggio fondamentale prima che i profili di espressione può essere paragonato tra diversi campioni. Ci sono tre metodi comunemente usati per la normalizzazione. 1. Utilizzare i conteggi totali di tutti i geni nel codeset. 2. Utilizzare uno o pochi geni &quot;housekeeping&quot;. 3. Utilizzare la media geometrica (N esima del prodotto di N numeri) di geni altamente espressi. Per una grande codeset (&gt; 100 geni) contenente sonde selezionati casualmente, utilizzando conteggi totali per la normalizzazione può essere una buona scelta, perché i conteggi totali di un gran numero di geni indipendenti possono fedecorrispondere alla quantità di input RNA. Per un piccolo set di codici (geni) &lt;100 contenenti sonde focalizzate su uno specifico processo (come la crescita ifale, dato che i geni di crescita ifale tendono ad essere co-regolata), la scelta di uno o pochi geni housekeeping come controllo per la normalizzazione è essenziale. TDH3, un gene metabolico robusta espresso, ha servito bene come controllo per molti esperimenti. Il terzo metodo è un ibrido del metodo 1 e 2, con particolare attenzione per la parità contributo geni altamente espressi. Anche se la piattaforma non è nCounter genome wide-, permette la quantificazione del livello di espressione per un massimo di 800 geni in un singolo test. Pertanto, scegliendo i geni più informativi da analizzare è fondamentale per il successo della profilatura. Sono stati utilizzati due approcci per selezionare per le sonde. Il primo approccio è &quot;basata sulla conoscenza&quot;. Informazioni dall&#39;espressione pubblicata e sui dati funzionale è compilato allo schermo per i geni che sono di potenziale interesse per la correntestudiare, come i geni di risposta ambientali 6-9. Questo approccio consente un facile confronto di dati in vivo profilatura a molti set di dati già esistenti, fornendo in tal modo contesto l&#39;interpretazione dei dati. Il secondo approccio è &quot;esplorazione based&quot;. Una categoria di geni in un genoma microbo, come tutti i geni che specificano i fattori di trascrizione, chinasi o proteine ​​della parete cellulare sono scelti per le sonde. Questo approccio permette di identificare nuovi fattori di virulenza e di scoperta di nuovi rapporti normativi basati sulla profilazione dei dati in vivo 6.

Le dinamiche di espressione genica detiene informazioni vitali su come una cellula risponde ai cambiamenti ambientali. Nel caso di un microrganismo infettante, dati di espressione genica potrebbero fornire approfondimenti clinicamente rilevanti su come un agente patogeno si adatta all&#39;ambiente infezione e provoca danni all&#39;ospite. Negli ultimi due decenni, gli studi di espressione genica sia in vitro che in vivo hanno generato grande quantità di dati e gettato le basi per la comprensione della biologia infezione 1-3. Tuttavia, le tecnologie di profilazione attuali, compresa microarray e RNAseq, non sono ottimali per la profilazione dell&#39;espressione genica patogeno durante l&#39;infezione. Host RNA costituisce una porzione schiacciante (di solito&gt; 99%) del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. L&#39;RNA ospite contribuisce ad alto background su microarray, e domina la sequenza legge da RNAseq. Isolamento cellulare patogeno dal tessuto infetto, in teoria, può contribuire ad arricchire per l&#39;RNA patogeni, ma pone aggiuntaAl problemi: richiede grandi quantità di tessuti infetti; la procedura può essere noioso; e, soprattutto, è difficile conservare allo stato nativo o integrità dell&#39;RNA durante il processo lungo. Al fine di generare dati più completi e precisi sull&#39;espressione genica patogeni durante le infezioni reali, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo che consente una quantificazione affidabile e conveniente delle specie di RNA di minoranza in una popolazione mista di RNA. NanoString nCounter è una piattaforma recentemente sviluppato che rende la misurazione diretta multiplexed dell&#39;espressione genica mediante coppie di sonde con codici a barre digitali 4, 5. Questa piattaforma ha un livello di sensibilità paragonabile a quella di QRT-PCR, ma non necessita di amplificazione enzimatica. La tecnologia non è Genome-wide, permette il rilevamento di fino a 800 geni differenti in ogni test. Pertanto, è fondamentale per selezionare geni informativi come sonde per profilatura. Qui usiamo profilo di espressione genica studio di un grande ronzioun patogeno, Candida albicans, durante un&#39;infezione invasiva come esempio, per dimostrare: 1) dettagli tecnici delle procedure sperimentali (protocollo), 2) La sensibilità, riproducibilità e la gamma dinamica di questo metodo (risultati rappresentativi), e 3) Importante Considerazioni per la progettazione e l&#39;esecuzione di esperimenti basati su questo protocollo (discussione). Questo protocollo può essere facilmente adattato per vari patogeni ed è stato applicato con successo in un certo numero di modelli di infezione 6-9.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

Per la maggior parte dei patogeni mammiferi, profili di espressione genica studi sono stati limitati da difficoltà tecniche per quantificare con precisione trascrizioni gene patogeno da tessuti infetti. Patogeni RNA costituisce una piccola parte del RNA totale isolato da campioni di tessuto infetto. Sia microarray e tecnologie RNAseq hanno difficoltà nel generare affidabile legge per i geni patogeni debolmente espressi. Ceppi patogeni mutanti con ridotta proliferazione in vivo rappresentano una sfida ancora più grande. Qui si descrive un vivo dell&#39;espressione genica protocollo profiling in quanto è molto veloce, estremamente sensibile e altamente riproducibile. Abbiamo sviluppato questo protocollo durante la nostra indagine sui funghi patogeni albicans Candida in un modello murino di candidosi disseminata ematogena. Usando questo protocollo, abbiamo documentato andamento nel tempo della C. regolata dinamicamente espressione genica albicans durante l&#39;infezione ai reni, e caratteristiche inaspettate scoperte dirisposte di espressione genica per antimicotico trattamento farmacologico in vivo.

Una sfida principale per l&#39;espressione genica patogeno profiling in vivo è quello di ottenere abbastanza legge da patogeno RNA. Data la bassa percentuale di trascritti patogeni in RNA totale, grandi quantità di RNA totale (&gt; 10 mg) deve essere usato per ogni reazione. La piattaforma ha un vantaggio unico in questa prospettiva: si utilizza sia una sonda di cattura ed una sonda relazione aumentare la specificità, in modo che la quantità enorme di RNA ospitante non causa un notevole livello di rumore. Come mostrato in Figura 1 (adattato da Rif. ​​6), il conteggio di prime da un campione di tessuto infetto (punti rossi) sono tutti inferiori 10, mentre conteggi di due campioni di tessuti infetti (punti blu) sono tutti superiori 10. Dati di espressione generati utilizzando questo protocollo sono altamente riproducibili. Come mostrato in figura 1 (adattato da Rif. ​​6), la conta prime da due repliche biologiche (puntini blu, campioni dopo l&#39;infezione ai reni 48 hr) aveva molto good correlazione con il valore R-quadrato è uguale a 0,945. La piattaforma fornisce anche gamma dinamica sufficiente a comprendere i livelli di espressione biologici naturali (Fig 1, conteggi compresi tra 1 e 10 10 6). Utilizzando un set di sonde che specifica 248 geni di risposta ambientali, siamo stati in grado di distinguere due fasi di espressione genica patogeno (Figura 2, adattato da Rif. ​​6): un gene risposta precoce espressione comprende geni con livelli di RNA molto diversi tra inoculo e 12 ore campioni post-infezione (p &lt;0,05 e&gt; cambia 2 volte in espressione), e una risposta di espressione genica in ritardo comprende geni con livelli di RNA che sono significativamente diversi tra il punto di tempo di 12 ore a campioni post-infezione 48 hr (P &lt;0.05 e&gt; cambiamento nell&#39;espressione 2 volte). Questi risultati indicano che C. espressione genica albicans è regolata dinamicamente durante infectio invasivan di un ospite mammifero. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Figura 1. Raw conta da tessuti renali infetti e non infetti (adattato da Rif. ​​6). Sonda conta per due infetti (48 ore dopo l&#39;infezione, i punti dati blu) e uno (punti dati rossi) non infetti campioni renali sono presentate come una dispersione trama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> Figura 2. Espressione di C. albicans geni sensibili all&#39;ambiente durante l&#39;infezione invasiva (adattati da Rif. ​​6). Le variazioni di livelli di espressione durante l&#39;invasione del rene del mouse per 248 C. geni albicans sono presentati in un calore mFormato ap. Valori medi di triplicato biologici sono mostrati fino-regolazione (giallo) e down-regolazione (blu) di geni a 12, 24, e 48 ore dopo l&#39;infezione rispetto a livelli medi di inoculo (0 ore). La saturazione del colore rappresenta la portata del cambiamento dell&#39;espressione, con la piena saturazione a 10 volte up- o down-regulation. Porzioni della mappa di calore sono espanse per illustrare rappresentante precoce up-regolate geni (in alto), i geni in ritardo (al centro), e geni primi down-regolati (in basso). In queste parti, singoli campioni sono presentate separatamente per illustrare la riproducibilità. Definiamo espressione cambia presto differenze significative tra l&#39;inoculo e 12 campioni hr. Definiamo modifiche in fase avanzata di espressione come differenze significative tra i campioni 12 e 48 hr. Significato si riferisce ai cambiamenti di&gt; 2 volte e un valore p &lt;0,05. I dati per ciascun campione sono stati normalizzati a livelli di RNA dal gene di controllo TDH3 prima sono stati calcolati i valori medi. I nostri criteri di assegnazione permettono qualche Dynamicageni lly regolati a cadere in entrambe le classi di espressione precoce e tardiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Views.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Video: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

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Genetica

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Immunologia e infezioni

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Analisi di immagini di codici a barre multiplexed per l'immunoprofilazione e la caratterizzazione della mappatura spaziale nell'analisi a singola cellula di campioni di tessuto di paraffina

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Ricerca sul cancro

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Biologia dello sviluppo

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioingegneria

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biologia

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

Riepilogo

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Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell'intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

Analisi di immagini di codici a barre multiplexed per l'immunoprofilazione e la caratterizzazione della mappatura spaziale nell'analisi a singola cellula di campioni di tessuto di paraffina

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

Barcoding genetica con proteine fluorescenti per applicazioni multiplexati

Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

Riepilogo

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Analisi di immagini di codici a barre multiplexed per l'immunoprofilazione e la caratterizzazione della mappatura spaziale nell'analisi a singola cellula di campioni di tessuto di paraffina

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

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Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Barcoding genetica con proteine fluorescenti per applicazioni multiplexati