ونود أن نشكر الدكتور غاري نولان من جامعة ستانفورد لتوفير خط الخلية التعبئة والتغليف فينيكس GP لإنتاج جزيئات فيروس. نشكر الدكتور روجر تسين في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لتوفير TD الطماطم. كما نود أن نشكر مرفق سان دييغو جامعة ولاية التدفق الخلوي الأساسية لخدمتهم والمساعدة.

1. إعداد خلايا الثدييات وإنتاج الفيروسية وتنبيغ لالمتوازية الوراثية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 2.5 × 10 6 الخلايا الملتصقة في 10 سم لوحة (أو حوالي 50-60٪ confluency) يوم واحد قبل ترنسفكأيشن في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS). للفيروسات الرجعية استخدام الإنتاج التعبئة والتغليف خلية خط لاختيار مثل فينيكس-GP (هدية عينية من غاري نولان، جامعة ستانفورد). ملاحظة: خط الخلية التعبئة والتغليف يعبر عن مستقر الكمامة وبول البروتينات لتشكيل الجسيمات فيروسات في العابرة. جعل خلايا المؤكد صحية والالتزام بها لوحة في أحادي الطبقة، قبل ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وإعداد خليط ترنسفكأيشن الحمض النووي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى 125 ميكرولتر من المصل خالية DMEM إضافة 3 ميكروغرام إلتهاب الفم التقرحي الفيروسات مغلف بروتين سكري ناقلات (PCI-VSVG) و 3 ميكروغرام من ناقلات نقل تحمل الجين ببروتين من الفائدة. خلط وإضافة 15 ميكرولتر من polyethylimine (2 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، ويضاف إلى خلايا إسقاط الحكيم. ملاحظة: يضاف Polyethylimine إلى خليط متجانس DNA كما كاشف ترنسفكأيشن لتشكيل polyplexes. من أجل الحصول على جسيمات فيروسية مختلفة تحمل علامات البروتين الفلورسنت، وتنفيذ كل ترنسفكأيشن بشكل مستقل مع علامة الاختيار. تذكر أن نقل ناقلات فيروسات حوالي 7 كيلو بايت في الطول ولا يمكن تعبئتها اذا فوق 10 كيلو بايت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية. من أجل زيادة الفيروسية لوحات مكان الإنتاج في 30 ° C أو 32 ° C بدلا من ذلك. ملاحظة: 24 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن آخر ساعة يمكن استبدال مع 7 مل من وسائل الإعلام الجديدة، وعلى الرغم من أن هذا قد يحسن صحة الخلايا قد خفض الحمل الفيروسي في طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن جمع الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على طاف وفلتر مع فلتر 0.45 ميكرومتر تترافلوروإيثيلين. استخدام جمعت حديثا طاف الفيروسي لالتنبيغ. أوراسكوم تليكوم القابضةerwise حفاظ طاف في aliquots في -80 ° C وتجنب تجميد أذاب. تذكر أن عيار الفيروسية ستنخفض على الأرجح تصل إلى 50٪ مع كل دورة تجميد لاذابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة خط خلية من اختيار 24 ساعة قبل تنبيغ إذا تمسكا، أو مباشرة قبل التنبيغ إذا غير ملتصقة. البذور 2.0 × 10 5-3،0 × 10 5 الخلايا الملتصقة (هنا هوه 7.5.1 وHEK 293T) أو 5.0 × 10 5 ل 1 × 10 6 خلايا غير ملتصقة (هنا SupT1) لكل بئر في لوحة 6 جيدا. ملاحظة: تأكد من معايرة عدد الخلايا إلى أن المصنف قبل التنبيغ، وخاصة جدا لخلايا ملتصقة، لذلك خلايا على تحقيق confluency من حوالي 60٪ في وقت التنبيغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكروغرام / مل Polybrene (hexadimethrene بروميد) إلى خلايا المصنف ثم قم بإضافة جمعها سابقا طاف الفيروسي للحصول على حوالي 20-40٪ العدوى (هنا 2 مل). ملاحظة: وزارة الداخلية أو نسبة الإصابة هي في معظمها تعسفية، والفرز سوف تسمح لتضخيم أي subpopulatأيون من الخلايا. ومن الواضح أن ارتفاع معدل الإصابة يخفف ويسرع عملية التضخيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيغ الخلايا بواسطة الطرد المركزي في شنقا دلو الدوار في 1،500 x ج لمدة 120 دقيقة في 32 ° C. الخلايا resuspend غير ملتصقة مع وسائل الإعلام الجديدة قبل الحضانة. لخلايا ملتصقة، مع استبدال الطازجة وسائل الإعلام 24 ساعة بعد تنبيغ. ملاحظة: من المستحسن أن يختم لوحات قبل الطرد المركزي مع parafilm لتجنب امتداد. لزيادة التنوع خلية barcoded وراثيا، تنبيغ الخلايا مع الجسيمات الفيروسية تحمل البروتينات الفلورية مختلفة (تم الحصول عليها من الخطوة 1.4). عند اختيار علامات الفلورسنت، تأكد من أنها متوافقة مع أجهزة القياس وكانت هناك معلمات الفلورسنت مميزة. </li></ol> 2. اختيار والتضخيم من خلايا Barcoded وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل خلايا الثدييات transduced التدفق الخلوي لا يقل عن 72 ساعة بعد تنبيغ ل quantitate نسبة مئوية من التنبيغ. استخدام خط خلية غير transduced مقارنة عن السيطرة السلبية. ملاحظة: كما سيتم استخدام الفرز لتنقية السكان الخلية barcoded الفردي، نسبة مئوية عالية من التنبيغ الأولي، في حين ليس من الضروري، يجب تسريع عملية التضخيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستفادة من خلية فارز الاختيار للحصول على الخلايا التي تعبر عن البروتين من الفائدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهذا الغرض، وضمان يتم تعيين البوابات بشكل صحيح في القنوات الصحيحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقيام بذلك استخدام نفس خط الخلية السذاجة كما المراقبة السلبية وتعيين المعلمة / قناة الجهد حتى يتسنى للسكان السلبي هو أقل قيمة 10 3 على كل محور الفلورسنت. تحديد النابضة لمضان إيجابي عن الأحداث التي تظهر فوق ذلك من السيطرة السلبية لكل قناة الفلورسنت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كن على علم بأن كل صك قد تختلف وينبغي تعديل الجهد الصحيح لتحديد النابضة وفقا لذلك، مما يجعل الضوابط الإيجابية والسلبية حتمية في كل إكسبالإعداد erimental. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن مضان في هذا الإعداد التجريبية استخدام قناة FITC (530/30 تمريرة الفرقة فلتر شرع من قبل 502 مرشح تمرير طويل) لEGFP، وقناة PE (585/42 تمريرة الفرقة فلتر شرع من قبل مرشح 556 تمريرة طويلة) لTD الطماطم ، وقناة APC (660/20 الفرقة تمرير مرشح) للE2 قرمزي. ملاحظة: ليزر 488 نانومتر يثير EGFP والدفتيريا الطماطم بينما هو متحمس E2 قرمزي بواسطة الليزر 633 نانومتر. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النوع إلى 15 مل أنابيب مخروطية مع 1 مل من 100٪ FCS. ملاحظة: إن عملية فرز السكان الخلية الفلورسنت ليست إلزامية كما يمكن للمرء أن الانتقال مباشرة مع هذا النوع من الحيوانات المستنسخة الفردية (انظر أدناه). فرز السكان مشددة على أساس مضان المختار يضمن السكان احتياطية لاختيار المستقبلية من الحيوانات المستنسخة الفردية. نضع في اعتبارنا أن الخلايا الفردية هي في الأوقات الصعبة في النمو في حين يبلغ عدد سكانها كبير من الخلايا يمكن تجميد بسهولة، ومن ثم إذابة وتضخيمها في مرحلة لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سفي أسفل السكان فرزها في شنقا دلو الدوار الطرد المركزي في 524 غرام عند 32 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا. اعادة تعليق في 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة، والخلايا لوحة إعادة بحيث الخلية confluency هو أقل من 60٪ للسماح النمو والانقسام ليومين على الأقل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبيل المثال، لوحة الخلايا الملتصقة عند حوالي 3 × 10 5 الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام لكل بئر في لوحة 6 جيدا و2 × 10 6 الخلايا في 2 مل من وسائل الاعلام في 6 سم لوحة. استخدام DMEM للخلايا ملتصقة وRPMI للخلايا غير ملتصقة (أو أي وسيلة معينة إذا لزم الأمر). وضع خلايا مطلي في حاضنة عند 37 درجة مئوية لعدة أيام للسماح التضخيم. </li></ol></li></ol> 3. الحصول السكان نسيلي من الخلايا Barcoded وراثيا في شدة مختلفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على السكان نسيلي من الخلايا transduced في الأصل (الخطوة 1.7) أو من السكان فرزها (الخطوة 2.3). ملاحظة: هذا سيضمن مستوى المساواة أو ما شابه ذلك من الفلورسنت التعبير البروتين بين كل خليةالصورة ضمن السكان (عدد سكانها ضيق مع CV صغيرة في متوسط ​​كثافة مضان تصل إلى 40٪). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهذا الغرض، خلايا مفردة النوع في لوحات 96-جيدا مع وحدة ترسب الخلايا الآلي (ACDU). وضع بوابات للفرز وفقا لسكان الفائدة. يتم تعيين ضمان البوابات على نطاق وسجل واحد على الأقل بصرف النظر الحصول على السكان تمييزها عند اختيار الخلايا في شدة الفلورسنت مختلفة. لهذا الإجراء هو موضح هنا، استخدم نفس التدفق الخلوي التجريبية التي أنشئت باعتبارها واحدة هو موضح في الخطوة 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الحيوانات المستنسخة الفردية في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع على الأقل. من خلال عملية التضخيم تحليل الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن معدلات النمو السكاني تنشأ من خلايا فردية وليس من أكثر من واحد. ملاحظة: تذكر أن فارز سيضع خلية واحدة لكل بئر في المتوسط، وعلى الرغم من بعض الآبار قد لا يكون أي خلية في كل شيء، وبعضها الآخر قد يكون أكثر من واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان أن بوينشأ pulation من خلية واحدة فقط، أن يكون لطيف للغاية مع لوحة وأبدا تخل الآبار من قبل pipetting. مراقبة لوحة، وكذلك من قبل بشكل جيد، وتحت المجهر. ملاحظة: في حين أن الخلايا الفردية قد يكون من الصعب في بعض الأحيان لتحديد وبمجرد أن تبدأ تقسيم أنها ستكون التعرف عليها بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كن على علم بأن أغلب الأحيان الخلايا أجمة &quot;على طول الحواف. تجاهل تلك الآبار حيث يمكن ملاحظة السكان نسيلي متعددة والحفاظ على تلك التي لها السكان احدة مشددة. ملاحظة: من المستحسن أن نقل تلك في لوحات أكبر لتضخيم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة السكان نسيلي المفترض من قبل تحليلها من قبل التدفق الخلوي. مقارنتها إلى السيطرة السلبية باستخدام نفس التدفق الخلوي الإعداد التجريبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل سوى نسبة من العينة والحفاظ على ما تبقى كما النسخ الاحتياطي. اختر السكان الأكثر منفصل واضح على أساس متوسط ​​الشدة وضيق من السكان. تضخيم لهم حسب الحاجة أو تجميد أسهم فيتجميد وسائل الإعلام مع 20٪ الجلسرين في -80 ° C لفترات قصيرة من الوقت أو النيتروجين السائل لفترة أطول. ملاحظة: تذكر أن عدد السكان نسيلي &quot;الحقيقي&quot; ينبغي أن يكون لها نمط مضان ضيق جدا. </li></ol></li></ol> 4. ضمان قدرات الإرسال المتعدد للإنتاجية عالية الفحص (HTS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين أكبر عدد ممكن من السكان نسيلي متميزة حسب الحاجة التي يمكن مواصلة الاستفادة في شكل المضاعفة. اختيار الحيوانات المستنسخة مع تمييزها امتصاص / أطياف الانبعاث و / أو شدة مختلفة. إذا تم استخدام شكل لوحة 96 بئرا، الذي هو مناسبة لHTS، البذور 50،000 الخلايا في 200 ميكرولتر لكل بئر. ملاحظة: نضع في اعتبارنا أن عدد الخلايا هو مجرد تقدير، ويمكن تغيير على أساس الخلية من نوع وسواء كانت ملتصقة أو لا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينة باستخدام التدفق الخلوي للتأكد من أن كل واحد من خطوط الخلايا الفلورسنت أنشئت مستقلة يمكن تمييزها عن بعضها البعض. قبل التحليل إعداد سلبيوالضوابط لون واحد لضبط المعلمات والقيم التعويض. ملاحظة: إعداد المعلمات للتمييز بوضوح المختلطة السكان تمكنهم إلى مزيد من الاستفادة في شكل المضاعفة. </li></ol> 5. التكيف مع خطوط الخلايا Barcoded وراثيا لتطبيق البيولوجية للاختيار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيغ إنشاء خطوط الخلايا barcoded وراثيا مع الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على عناصر الفحص الاختيار، كما هو موضح هنا في Stolp وآخرون. 2013 59. تذكر أن فحص الاختيار ينبغي أن يحتل قناة الفلورسنت إضافية ومميزة، وبالتالي يجب ان يكون لتحويلها إلى خط الخلية barcoded المناسب. ملاحظة: كل خط خلية barcoded يمكن أن تتحمل مقايسة مختلف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا barcoded نوع الفلورسنت وراثيا لتلك التي تحتوي على عناصر الفحص. يمكن هندستها عناصر الفحص بالإضافة إلى علامة أو بروتين فلوري (كما هو الانصهار أو من خلال موقع على دخول الريبوسوم الداخلية) و ملاحظة:أو الكشف مباشرة من خلال النشاف الغربي، وتدفق الخلوي أو المجهري. النظام المستخدمة في هذا البروتوكول يعتمد على HA التعبير سطح حاتمة وحده، أو مع إضافي التعبير FLAG حاتمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على السكان نسيلي تحتوي على مقايسة مع الأجسام المضادة المترابطة HA وAPC-fluorescently. ثم تحليل السكان نسيلي مع مكافحة FLAG وFITC مترافق تلوين الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتتبع إعادة فحص وتحليل أو &quot;فك&quot; السكان في القناة المناسبة حيث متميزة خطوط الخلايا barcoded وراثيا يمكن تمييزها. هنا، فك طبيعة الركيزة عن طريق تحليل في القناة PE لTD كشف الطماطم. </li></ol></li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هنا تم الجمع بين اثنين من إجراءات راسخة؛ الهندسة الوراثية من خلال التكنولوجيا فيروسات والكشف عن البروتينات الفلورية باستخدام التدفق الخلوي. الفلورسنت المتوازية الوراثية القائم على البروتين لإنتاج خطوط الخلايا الفريدة توفر وسيلة قوية وبسيطة لتطبيقات المضاعفة. تول...

تقنيات مثل التحليل الطيفي مضان، مضان المجهر والتدفق الخلوي، وكلها تعتمد على مضان، خاصية استغلال على نطاق واسع في التطبيقات الكيميائية الحيوية، الطب الحيوي، والكيميائية. مضان، سواء جوهري أو من خلال وضع العلامات تم استغلاله، لتحليل البروتين أنماط التعبير وملامح، ومصير الخلية، وتفاعلات البروتين والوظائف البيولوجية 1-9، ومن خلال مضان / فورستر نقل الطاقة الرنين للكشف عن التفاعلات جزيء حيوي والتغيرات متعلق بتكوين 10-13. منذ عزل Aequorea فيكتوريا الأخضر الفلورسنت البروتين (GFP) 14، واكتشاف طبيعيا البروتينات الفلورية إضافية من الكائنات المجوفة الأخرى، وخاصة الشعاب المرجانية، ازداد إلى حد كبير عدد من البروتينات الفلورية القائمة مع تمييزها أطياف الإثارة / الانبعاثات. هذه، جنبا إلى جنب مع إدخال طفرات في جيناتها 15-19، هفه عن المزيد من توسيع الاحتمالات، والحصول على لوحة الحقيقي للالبروتينات الفلورية المتاحة للعلماء التي تستغل المجهر، التدفق الخلوي والتكنولوجيات القائمة مضان أخرى لأبحاثهم. في موازاة ذلك، على الرغم من أن بشكل مستقل، وتطوير التكنولوجيا فيروسات قد سهلت بشكل كبير في التعبير مستقر المعلومات الجينية خارج الرحم في خلايا الثدييات 20-23. وبالتالي، ليس من المستغرب أن هذه التقنية قد استخدمت لنقل جينات البروتينات الفلورية إلى عدد واسع من أنواع والأنسجة 24-28 الخلية أو لإنتاج حيوانات معدلة وراثيا 29-31. بعد طبيعة الفيروسات القهقرية، هو عرض المعلومات الجينية للبروتين فلوري خارج الرحم داخل جينوم الخلية 32 و الخلية يصبح الفلورسنت `لever&#39;. وقد سمح هذا العقار تتبع مصير الخلية، أو من خلية واحدة ضمن مجموعة من السكان من الخلايا. الخلية الآن الفلورسنت ديها بالتالي أكيأحمر biosignature الخاصة بها ويمكن تعريفها بأنها barcoded. في biosignature فريدة تحدد من الخلايا الأخرى، والأهم من ذلك، تميز من خلايا التلاعب بها وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية مختلفة مع تمييزها أطياف الامتصاص / الانبعاثات. التطبيقات البيولوجية مثل تتبع عوامل إعادة برمجة نحو تعدد القدرات 33، وتحليل العوامل النووية الدقيقة لاستجلاء توطين نويي 34، وبناء البلازميدات مراسل الفلورسنت للدراسات النسخي 35 أو وضع العلامات الوراثية من الخلايا العصبية لدراسة هندسة الشبكات العصبية 36 ، هي مجرد أربعة أمثلة على العديد من التي استغلت مختلفة جينات بروتين فلوري لنفس الإعداد التجريبية. التدفق الخلوي وقد استخدمت على نطاق واسع لتحليل العمليات الحيوية على مستوى الخلية واحد، مثل التعبير الجيني، دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، ويشير من خلال فسفوريلأوجه 37-43. والتعبير مستقر للجينات بروتين فلوري في خلايا الثدييات وزيادة تعزيز فائدة التدفق الخلوي للخلية تحليل 38،44 ويجند مستقبلات التفاعلات 45. وقد سمحت تعزيز قدرات التدفق الخلوي لتصبح المنهجية المستخدمة على نطاق واسع للالإنتاجية العالية وارتفاع محتوى فحص 46. على الرغم من العدد توسعت الآن لالفلورية والروبوتات التقنيات التي يمكن لنظم قارئ لوحة الزوجين، والتصوير والتدفق الخلوي، يبدو أن هناك نقص في التصميم التجريبي التي يمكن استغلالها وتناسب هذه القدرات التكنولوجية المحسنة. وهناك حاجة بشكل كبير المنهجيات المعتمدة على الخلايا سريعة وموثوقة وبسيطة وقوية لتطبيقات المضاعفة التي تزيد من تعزيز القدرة الإنتاجية العالية. وهذا ينطبق بشكل خاص في مجال اكتشاف الأدوية حيث المقايسات خلية مقرها الهندسة في شكل المضاعفة يمكن أن تعزز قوة عالية الإنتاجية فحص 39،47-50 </sup&gt;. مضاعفة، لأنها تسمح تحليلات متزامنة في عينة واحدة، مما يعزز قدرات عالية الإنتاجية 51-54. المتوازية الوراثية الفلورسنت يسمح ليس فقط لمضاعفة أنيقة، ولكن أيضا، هندسة مرة واحدة، تلتف على ضرورة بروتوكولات تستغرق وقتا طويلا، ويقلل من تكاليف ترافق مع الأجسام المضادة، والخرز والبقع 39،52،55، ويمكن أن تقلل من عدد من الشاشات العالية المطلوبة ل تطبيقات الإنتاجية. لقد وصف مؤخرا كيف أن التكنولوجيا فيروسات يمكن أن تعزز من خلال مضاعفة المتوازية الوراثية الفلورسنت لتطبيقات البيولوجية، بالإعراب عن مقايسة وضعت سابقا لمراقبة HIV-1 نشاط الأنزيم البروتيني 56،57 مع مختلف المتغيرات السائدة سريريا 58. وأوضح المنهجية بطريقة أكثر وصفية مع التركيز على كيفية اختيار وتضخيم الخلايا barcoded الفلورسنت وراثيا وكيفية إنتاج ألواح من السكان نسيلي التعبير عن البروتينات الفلورية متميزة و / أو كثافه مضان مختلفةالمنشأ. لوحات من السكان الخلية تمييزها على أساس خصائصها الفلورية تعزيز قدرات المضاعفة، والتي يمكن استغلالها مزيد بالاشتراك مع المقايسات خلية القاعدة التي تتناول المسائل البيولوجية المختلفة. يصف بروتوكول أيضا كيفية مهندس لجنة من خلايا barcoded تحمل واحدة من المقايسات خلية القاعدة التي سبق وضعها في المختبر، كما سبيل المثال 59. وبالتالي لا يقصد هذا البروتوكول لإظهار فيروسات تكنولوجيا راسخة / lentiviral لنقل الجيني، قيمة البروتينات الفلورية أو تطبيقات التدفق الخلوي 60،48 بل لإظهار قوة تعزيز الجمع بين ثلاثة لتطبيقات المضاعفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

مضاعفة الفلورسنت barcoded وراثيا الخلايا لأغراض التطبيقات البيولوجية يمكن أن يتحقق إلا مرة واحدة وقد ولدت السكان نسيلي الفردية. مضاعفة هو الأكثر فعالية عندما السكان barcoded لها خصائص متميزة الفلورسنت واضحة مع الحد الأدنى من التداخل الطيفي. على سبيل المثال هو موضح في ا...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications at JoVE.com

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

Video: Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

مغلق الثقافة خلية بروتوكول النظام باستخدام السفن HYPERStack مع تقنية الغاز مادة نافذ

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

مطلق قياس العائد الكم من عينات مسحوق

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.