This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. المسخ مكتبة البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مناطق يتعرضون لتتحول مع مساعدة من خوارزميات حسابية على أساس المتاحة التركيب البلوري أو التماثل نماذج 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، استهداف منطقتين من AAO من محاري ايرنغي عن الطفرات العشوائية وإعادة التركيب (الأرصاد [α1] -Val109، Phe392-Gln566)، في حين أن تضخيم ما تبقى من الجينات (844 بي بي) عن ارتفاع الدقة PCR (الشكل 1). ملاحظة: عدة قطاعات يمكن دراستها عن طريق تتحول بطريقة مستقلة أو مجتمعة 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم المناطق المستهدفة من قبل مطفرة PCR. إنشاء المناطق الواقعة بين شرائح (~ 50 نقطة لكل منهما) متداخلة عن طريق إضافة ردود الفعل PCR في مناطق محددة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مطفرة PCR من شرائح المستهدفة في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر التي تحتوي على قالب الحمض النووي (0.92 نانوغرام / ميكرولتر)، و 90 نانومتر بنسبة ضئيلة معنى (RMLN لقطاع MI وAAO-BP لشريحة M-II)، و 90 نانومتر لntisense التمهيدي (AAO-92C لقطاع MI وRMLC لشريحة M-II)، 0.3 ملي dNTPs (0.075 مم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 1.5 ملي MgCl 2، 0.05 ملي MnCl 2 و 0.05 U / ميكرولتر طق الحمض النووي بوليميريز. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (1 دورة)؛ 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، 74 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 74 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم المناطق غير مطفرة مع فائق البلمرة الإخلاص وتشمل المناطق المقابلة تداخل القطاعات تسبب الطفرات الوراثية و / أو يتدلى ناقلات خطي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مخاليط رد فعل في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر تحتوي على قالب الحمض النووي (0.2 نانوغرام / ميكرولتر)، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة الشعور HFF، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة العقاقير HFR، 0.8 ملي dNTPs (0.2 ملم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) و 0.02 U / ميكرولتر iproof البلمرة DNA. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في &lt;قوي&gt; الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (1 دورة)؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة). ملاحظة: مع الشروط الموضحة في 1.2 و 1.3 التداخل من 43 سنة مضت (المنطقة البلازميد-M1)؛ 46 سنة مضت (M1 المنطقة منطقة HF)؛ 47 سنة مضت (HF المنطقة-M2 المنطقة) و61 سنة مضت (M2 البلازميد كل إقليم) مصممة (الشكل 1) لصالح في الربط المجراة في الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية كافة شظايا PCR (مطفرة وغير مطفرة) مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي ناقلات بحيث مناطق ما يقرب من 50 نقطة المرافقة يتم إنشاؤها التي هي مثلي إلى 5&#39;- و3&#39;ينتهي من الجين المستهدف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط التفاعل الخطية التي تحتوي على 2 ميكروغرام الحمض النووي، 7.5 U بام مرحبا، 7.5 U Xho الأول، 20 ميكروغرام BSA و 2 ميكرولتر من الاحتياطي بام مرحبا 10X في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة و 40 دقيقة. بعد ذلك، انتقل مع تعطيل في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية ناقلات خطي عن طريق استخراج هلام الاغاروز لتجنب التلوث مع البلازميد دائري المتبقية (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مزيج رد فعل الهضم في ميجا جيدا من شبه إعدادي انخفاض درجة انصهار agarose هلام (0.75٪، ث: •)، فضلا عن قسامة (5 ميكرولتر) من مزيج رد فعل في المتاخمة كذلك المراسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الحمض النووي الكهربائي (5 فولت / سم بين الأقطاب، 4 ᵒC) وفصل agarose هلام الموافق الضخمة جيدا وتخزينها في 4 ᵒC في 1X تاي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على حارة مع سلم الوزن الجزيئي والصحفي. تصور العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. نيك الموقف حيث متجه الأماكن خطي. ملاحظة: كما أن نوعية ناقلات خطي تنقيته هو critiعامل كال لإعادة التركيب الناجح والتجمع في الخميرة، وتجنب تلطيخ هلام لالكهربي الحمض النووي شبه إعدادي. استخدام الأصباغ والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لاستخراج الهلام قد تؤثر على استقرار ناقلات الحمض النووي، والمساس في الجسم الحي كفاءة إعادة التركيب. كبديل لالأصباغ EtBr السامة، يتم استخدام جل الأحمر والأصباغ SYBR عادة لتلطيخ هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة عدم وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد ناقلات خطي في جزء الضخمة جيدا باستخدام بتوجيه من النكات في حارة مراسل الملون بحيث يمكن أن تكون معزولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج ناقلات خطي من الاغاروز وتطهيره مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: استخدام نسخة عالية-ناقلات المكوك episomal مع علامات المضادات الحيوية وauxotrophy: في هذا المثال قمنا باستخدام اليوراسيل مستقل والأمبيسلين المقاومة pJRoC30 ناقلات تحت سيطرة المروج الخميرة GAL1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ميل متساوي الموليةxture من شظايا PCR ومزجها مع ناقلات خطي في نسبة 2: 1، مع ما لا يقل عن 100 نانوغرام البلازميد خطي (اختبار نسب مختلفة من مكتبة متساوي المولية / ناقلات مفتوحة لتحقيق عوائد التحول جيدة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية من شظايا PCR وناقلات خطي في 260 نانومتر و 280 نانومتر لتحديد تركيز والنقاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خلايا المختصة الخميرة مع الخليط الحمض النووي باستخدام عدة خميرة التحول التجاري (أنظر الجدول لوازم) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، استخدام البروتيني ناقصة وURA3 - S. تعتمد الخباز السلالة، BJ5465. تحويل الخلايا مع ناقلات circularized الوالدين كمعيار داخلي أثناء الفرز (أنظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، تحقق الخلفية من خلال تحويل ناقلات خطي في حالة عدم وجود شظايا PCR. ملاحظة: في حالة اكتشاف مستويات إفراز منخفضة الأولية، استخدم س.الخباز البروتيني سلالات ناقصة مثل BJ5465 لتعزيز تراكم البروتينات النشطة في supernatants الثقافة. إذا كان انزيم الهدف يخضع hyperglycosylation، واستخدام سلالات بالغليكوزيل ناقصة (على سبيل المثال، Δ kre2 التي هي قادرة على ربط الأوليغومرات المانوز أصغر فقط) يمكن أن يكون خيارا مناسبا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا تحولت على لوحات SC التسرب واحتضان لهم عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. لوحة (على SC التسرب لوحات تستكمل مع اليوراسيل) URA3 - S. خلايا خميرة تفتقر البلازميد كعنصر تحكم السلبية للفحص (أنظر أدناه). </li></ol> 2. عالية الإنتاجية الفحص الفحص (الشكل 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء عدد مناسب من لوحات 96-جيدا العقيمة (23 وحات لتحليل مكتبة من 2000 استنساخ) مع 50 ميكرولتر الحد الأدنى من المتوسط ​​لكل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المستعمرات الفردية من SC التسرب لوحات وتحويلها إلى لوحات 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل لوحة، تطعيم العمود رقم 6 مع نوع الوالدين كمعيار داخلي وH1 بشكل جيد مع URA3 - S. خلايا خميرة (في المتوسط ​​SC تستكمل مع اليوراسيل) مع عدم وجود البلازميد كعنصر تحكم السلبية. ملاحظة: شغل حسنا H1 تحديدا مع وسائل الاعلام التسرب تستكمل مع اليوراسيل. وفارغة تحتوي كذلك وسائل الإعلام دون الخلايا يمكن أن تكون مستعدة أيضا كعنصر تحكم العقم إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحات مع أغطية والتفاف عليها في بارافيلم. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية، 225 دورة في الدقيقة والرطوبة النسبية 80٪ في شاكر رطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بارافيلم، إضافة 160 ميكرولتر من المتوسط ​​التعبير إلى كل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل، ختم لوحات واحتضان لهم لمدة 24 ساعة أخرى. ملاحظة: يتم إعداد المتوسطة الحد الأدنى والمتوسط ​​التعبير كما ذكرت في مكان آخر (19). قد تختلف مستويات إفراز اعتمادا على الجينات قيد الدراسة وفقا لذلك، رانه الحضانة يجب أن يكون الأمثل مرات في كل حالة لمزامنة نمو الخلايا في جميع الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحات (لوحات رئيسية) في 2800 ز س لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 ميكرولتر من طاف من الآبار في لوحة الرئيسي إلى لوحة المتماثلة باستخدام السائل التعامل مع multistation الروبوتية. ملاحظة: لصالح إفراز انزيم فإنه من المستحسن أن تحل محل الببتيد إشارة الأصلي من البروتين الهدف من الببتيدات إشارة تستخدم عادة للتعبير مغاير في الخميرة (على سبيل المثال، فإن العامل α prepro زعيم، زعيم K 1 القاتل السم من س. الخباز، أو حتى إصدارات خيالية من كلا الببتيدات 13). بدلا من ذلك، إشارة الببتيد الأصلي ويمكن أن تتطور بشكل حصري لإفراز في الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من 2 مم ص -methoxybenzylalcohol في 100 ملي فوسفات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 6.0 بمساعدة الروبوت pipetting ل. تحريك لوحات لفترة وجيزة مع 96-نحنليرة لبنانية لوحة خلاط واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الروبوت pipetting ل، إضافة 160 ميكرولتر من كاشف FOX إلى كل لوحة نسخة ويقلب لفترة وجيزة مع الخلاط (تركيز النهائي من FOX الخليط في البئر: 100 ميكرومتر زايلينول البرتقال، و 250 ميكرومتر الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 و25 مم H 2 SO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عدة إضافات إلى كاشف لتعزيز حساسية، مثل العضوية المشارك المذيبات ([دمس، والإيثانول والميثانول) أو السوربيتول 17. هنا، تضخيم الاستجابة عن طريق إضافة السوربيتول إلى تركيز النهائي من 100 ملي (الشكل 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحات (وضع نقطة النهاية، ر 0) في 560 نانومتر على قارئ لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في RT حتى يتطور لون وقياس امتصاص مرة أخرى (ر 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النشاط النسبي من الفرق بين القيمة المطلقة بعد الحضانة، وأنه من القياس المبدئي تطبيع لحلجنوع ntal لكل لوحة (Δt 1 - ر 0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض يضرب أفضل متحولة إلى مرتين متتاليتين إعادة الفحوصات لاستبعاد ايجابيات كاذبة. ملاحظة: عادة، تتضمن إعادة الفحص والعزل البلازميد من الخميرة، والتضخيم والتنقية في كولاي، تليها التحول من خلايا الخميرة الطازجة مع البلازميد 19. يعاد فحص-كل استنساخ مختارة في pentaplicate. </li></ol>

<ol>
	<li>J&#228;ckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts+by+evolution.">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li><li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis.">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li><li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+enzyme+universe:+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution.">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li><li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+past,+present+and+future.">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li><li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution.">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li><li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+selection+of+the+host+organism.">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).</li><li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering:+lessons+from+synthetic+biology.">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution:+an+efficient+tool+to+improve+enzymes.">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension.">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li><li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li><li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination.">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li><li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+assembler,+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways.">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium.">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li><li>Garcia-Ruiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+ligninolytic+oxidoreductases:+from+functional+expression+to+stabilization+and+beyond.">Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond.</a> Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).</li><li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aryl-alcohol+oxidase:+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation.">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+(MORPHING)+for+directed+enzyme+evolution.">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919 (2014).</li><li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells.">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li><li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+for+designing+smart+libraries.">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li><li>Vi&#241;a-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides.">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex.">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology:+Past,+present,+and+future.">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pocket+manual+of+directed+evolution:+Tips+and+tricks.">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .</li><li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies.">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في هذه المقالة، نحن لخصت معظم النصائح والحيل المستخدمة في المختبر لدينا لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه في س. الخباز (باستخدام AAO كمثال) بحيث يمكن تكييفها للاستخدام مع العديد من أنظمة انزيم حقيقية النواة الأخرى ببساطة عن طريق اتباع النهج المشترك هو مو?...

التطور الجزيئي الموجه هو وسيلة قوية وسريعة وموثوق بها لتصميم الإنزيمات 1، 2، ومن خلال جولات متكررة من الطفرات العشوائية، إعادة التركيب والفحص، إصدارات محسنة من الإنزيمات يمكن أن تتولد التي تعمل على ركائز جديدة، في تفاعلات جديدة، في غير طبيعي البيئات، أو حتى لمساعدة الخلية لتحقيق أهداف الأيض جديدة 3-5. بين المضيفين استخدامها في التطور الموجه، والبيرة خميرة الخباز يوفر ذخيرة من الحلول للتعبير الوظيفي للبروتينات حقيقية النواة المعقدة التي لا تتوفر إلا في نظرائهم بدائية النواة 6،7. تستخدم شاملة في دراسات بيولوجيا الخلايا، وهذا النموذج حقيقية النواة الصغيرة لديها العديد من المزايا من حيث التعديلات بعد متعدية، وسهولة التلاعب والتحول الكفاءة، وكلها صفات هامة لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه 8. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع وتيرةإعادة التركيب الحمض النووي مثلي في س. الخباز بالإضافة إلى جهاز فعال في تصحيح التجارب المطبعية يفتح مجموعة واسعة من الاحتمالات لإنشاء مكتبة والتجمع الجينات في الجسم الحي، وتعزيز تطور أنظمة مختلفة من الانزيمات واحدة لمسارات صناعية معقدة 9-12. أنفقت مختبرنا العقد الماضي أدوات واستراتيجيات تصميم للتطور الجزيئي للligninases مختلفة في خميرة (إنزيم أكسدة-اختزال تشارك في تدهور اللجنين خلال تسوس الخشب) 13-14. في هذه الاتصالات، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لإعداد والمكتبات شاشة متحولة في س. الخباز لنموذج flavooxidase، أوكسيديز -aryl من الكحول (AAO 15) -، والتي يمكن ترجمتها بسهولة إلى العديد من الإنزيمات الأخرى. ويشمل البروتوكول طريقة التطور الموجه تركيزا (تحوير: الطفري المنظمة التوحد عملية كتبها مثلي في الجسم الحي التجمع) بمساعدة من جهاز خلية الخميرة 16، لدا حساس جدا الفحص الفحص بناء على رد فعل فنتون من أجل الكشف عن النشاط AAO تفرز في مرق الثقافة 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&amp;ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&amp;ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&amp;ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&amp;ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&amp;ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. PCR Reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM each</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&amp;ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>For error prone PCR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Plasmid linearization&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>For staining DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. FOX assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&amp;ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&amp;ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standard curve</td></tr><tr><td>Xylenol Orange disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&amp;ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. Agarose gel stuff&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&amp;ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA analysis dye</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting temperature agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&amp;ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. Kits and cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease deficient strain with genotype: MAT&amp;alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competent cells</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>For plasmid purification and amplification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA gel extraction</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr><td>Yeast Transformation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmid extraction from yeast</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;7. Plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr><tr><td>96-well plate lid</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr></tbody></table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

التطور الموجه في خميرة الخباز يقدم العديد من المزايا الجذابة عند تصميم الانزيمات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية، وهي عملية تنطوي على البناء، والاستنساخ والتعبير المكتبات متحولة، بالإضافة إلى ارتفاع وتيرة مثلي إعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول لإنشاء والمكتبات شاشة متحولة في الخميرة على أساس مثال على فطرية أريل الكحول أوكسيديز (AAO) لتعزيز نشاطها الكامل. تعرض جزأين البروتين لتطور ركزت توجيهها بواسطة الطفرات العشوائية وإعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. سمحت يتدلى من ~ 50 نقطة المرافقة كل قطعة إعادة التجميع الصحيح من الجين AAO الانصهار في ناقلات خطي مما أدى إلى كامل البلازميد تكرار مستقل. تم فحص المكتبات متحولة المخصب مع المتغيرات AAO الوظيفية في س. supernatants الخباز مع حساسية فحص عالية الإنتاجية بناء على رد فعل فنتون. عملية العامة للبناء المكتبة في س. وصف الخباز هنا يمكن تطبيقها بسهولة أن تتطور العديد من الجينات حقيقية النواة الأخرى، وتجنب ردود الفعل PCR إضافية، في المختبر إعادة التركيب الحمض النووي وربط الخطوات.

AAO من P. eryngii هو flavooxidase خارج الخلية التي تزود مستخلصات الفطرية مع H 2 O 2 لبدء الهجوم على اللجنين. تعرض اثنين من شرائح AAO إلى التطور الموجه تركز على أيدي تتحول من أجل تعزيز نشاطها والتعبير في س. الخباز 19. بغض النظر عن الانزيمات ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening at JoVE.com

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K Views.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

Video: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Genetics

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>تحسين وظائف البروتين من خلال تقنيات عرض سطح الخميرة

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>هندسة البروتين بواسطة عرض سطح الخميرة

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

هندسة البروتين بواسطة عرض سطح الخميرة

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Bioengineering

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

توجه طريقة تطور في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

هندسة البروتين بواسطة عرض سطح الخميرة

هندسة البروتين بواسطة عرض سطح الخميرة

هندسة البروتين بواسطة عرض سطح الخميرة

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في