This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. المسخ مكتبة البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مناطق يتعرضون لتتحول مع مساعدة من خوارزميات حسابية على أساس المتاحة التركيب البلوري أو التماثل نماذج 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، استهداف منطقتين من AAO من محاري ايرنغي عن الطفرات العشوائية وإعادة التركيب (الأرصاد [α1] -Val109، Phe392-Gln566)، في حين أن تضخيم ما تبقى من الجينات (844 بي بي) عن ارتفاع الدقة PCR (الشكل 1). ملاحظة: عدة قطاعات يمكن دراستها عن طريق تتحول بطريقة مستقلة أو مجتمعة 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم المناطق المستهدفة من قبل مطفرة PCR. إنشاء المناطق الواقعة بين شرائح (~ 50 نقطة لكل منهما) متداخلة عن طريق إضافة ردود الفعل PCR في مناطق محددة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مطفرة PCR من شرائح المستهدفة في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر التي تحتوي على قالب الحمض النووي (0.92 نانوغرام / ميكرولتر)، و 90 نانومتر بنسبة ضئيلة معنى (RMLN لقطاع MI وAAO-BP لشريحة M-II)، و 90 نانومتر لntisense التمهيدي (AAO-92C لقطاع MI وRMLC لشريحة M-II)، 0.3 ملي dNTPs (0.075 مم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 1.5 ملي MgCl 2، 0.05 ملي MnCl 2 و 0.05 U / ميكرولتر طق الحمض النووي بوليميريز. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (1 دورة)؛ 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، 74 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 74 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم المناطق غير مطفرة مع فائق البلمرة الإخلاص وتشمل المناطق المقابلة تداخل القطاعات تسبب الطفرات الوراثية و / أو يتدلى ناقلات خطي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مخاليط رد فعل في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر تحتوي على قالب الحمض النووي (0.2 نانوغرام / ميكرولتر)، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة الشعور HFF، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة العقاقير HFR، 0.8 ملي dNTPs (0.2 ملم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) و 0.02 U / ميكرولتر iproof البلمرة DNA. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في &lt;قوي&gt; الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (1 دورة)؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة). ملاحظة: مع الشروط الموضحة في 1.2 و 1.3 التداخل من 43 سنة مضت (المنطقة البلازميد-M1)؛ 46 سنة مضت (M1 المنطقة منطقة HF)؛ 47 سنة مضت (HF المنطقة-M2 المنطقة) و61 سنة مضت (M2 البلازميد كل إقليم) مصممة (الشكل 1) لصالح في الربط المجراة في الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية كافة شظايا PCR (مطفرة وغير مطفرة) مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي ناقلات بحيث مناطق ما يقرب من 50 نقطة المرافقة يتم إنشاؤها التي هي مثلي إلى 5&#39;- و3&#39;ينتهي من الجين المستهدف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط التفاعل الخطية التي تحتوي على 2 ميكروغرام الحمض النووي، 7.5 U بام مرحبا، 7.5 U Xho الأول، 20 ميكروغرام BSA و 2 ميكرولتر من الاحتياطي بام مرحبا 10X في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة و 40 دقيقة. بعد ذلك، انتقل مع تعطيل في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية ناقلات خطي عن طريق استخراج هلام الاغاروز لتجنب التلوث مع البلازميد دائري المتبقية (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مزيج رد فعل الهضم في ميجا جيدا من شبه إعدادي انخفاض درجة انصهار agarose هلام (0.75٪، ث: •)، فضلا عن قسامة (5 ميكرولتر) من مزيج رد فعل في المتاخمة كذلك المراسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الحمض النووي الكهربائي (5 فولت / سم بين الأقطاب، 4 ᵒC) وفصل agarose هلام الموافق الضخمة جيدا وتخزينها في 4 ᵒC في 1X تاي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على حارة مع سلم الوزن الجزيئي والصحفي. تصور العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. نيك الموقف حيث متجه الأماكن خطي. ملاحظة: كما أن نوعية ناقلات خطي تنقيته هو critiعامل كال لإعادة التركيب الناجح والتجمع في الخميرة، وتجنب تلطيخ هلام لالكهربي الحمض النووي شبه إعدادي. استخدام الأصباغ والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لاستخراج الهلام قد تؤثر على استقرار ناقلات الحمض النووي، والمساس في الجسم الحي كفاءة إعادة التركيب. كبديل لالأصباغ EtBr السامة، يتم استخدام جل الأحمر والأصباغ SYBR عادة لتلطيخ هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة عدم وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد ناقلات خطي في جزء الضخمة جيدا باستخدام بتوجيه من النكات في حارة مراسل الملون بحيث يمكن أن تكون معزولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج ناقلات خطي من الاغاروز وتطهيره مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: استخدام نسخة عالية-ناقلات المكوك episomal مع علامات المضادات الحيوية وauxotrophy: في هذا المثال قمنا باستخدام اليوراسيل مستقل والأمبيسلين المقاومة pJRoC30 ناقلات تحت سيطرة المروج الخميرة GAL1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ميل متساوي الموليةxture من شظايا PCR ومزجها مع ناقلات خطي في نسبة 2: 1، مع ما لا يقل عن 100 نانوغرام البلازميد خطي (اختبار نسب مختلفة من مكتبة متساوي المولية / ناقلات مفتوحة لتحقيق عوائد التحول جيدة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية من شظايا PCR وناقلات خطي في 260 نانومتر و 280 نانومتر لتحديد تركيز والنقاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خلايا المختصة الخميرة مع الخليط الحمض النووي باستخدام عدة خميرة التحول التجاري (أنظر الجدول لوازم) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، استخدام البروتيني ناقصة وURA3 - S. تعتمد الخباز السلالة، BJ5465. تحويل الخلايا مع ناقلات circularized الوالدين كمعيار داخلي أثناء الفرز (أنظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، تحقق الخلفية من خلال تحويل ناقلات خطي في حالة عدم وجود شظايا PCR. ملاحظة: في حالة اكتشاف مستويات إفراز منخفضة الأولية، استخدم س.الخباز البروتيني سلالات ناقصة مثل BJ5465 لتعزيز تراكم البروتينات النشطة في supernatants الثقافة. إذا كان انزيم الهدف يخضع hyperglycosylation، واستخدام سلالات بالغليكوزيل ناقصة (على سبيل المثال، Δ kre2 التي هي قادرة على ربط الأوليغومرات المانوز أصغر فقط) يمكن أن يكون خيارا مناسبا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا تحولت على لوحات SC التسرب واحتضان لهم عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. لوحة (على SC التسرب لوحات تستكمل مع اليوراسيل) URA3 - S. خلايا خميرة تفتقر البلازميد كعنصر تحكم السلبية للفحص (أنظر أدناه). </li></ol> 2. عالية الإنتاجية الفحص الفحص (الشكل 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء عدد مناسب من لوحات 96-جيدا العقيمة (23 وحات لتحليل مكتبة من 2000 استنساخ) مع 50 ميكرولتر الحد الأدنى من المتوسط ​​لكل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المستعمرات الفردية من SC التسرب لوحات وتحويلها إلى لوحات 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل لوحة، تطعيم العمود رقم 6 مع نوع الوالدين كمعيار داخلي وH1 بشكل جيد مع URA3 - S. خلايا خميرة (في المتوسط ​​SC تستكمل مع اليوراسيل) مع عدم وجود البلازميد كعنصر تحكم السلبية. ملاحظة: شغل حسنا H1 تحديدا مع وسائل الاعلام التسرب تستكمل مع اليوراسيل. وفارغة تحتوي كذلك وسائل الإعلام دون الخلايا يمكن أن تكون مستعدة أيضا كعنصر تحكم العقم إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحات مع أغطية والتفاف عليها في بارافيلم. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية، 225 دورة في الدقيقة والرطوبة النسبية 80٪ في شاكر رطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بارافيلم، إضافة 160 ميكرولتر من المتوسط ​​التعبير إلى كل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل، ختم لوحات واحتضان لهم لمدة 24 ساعة أخرى. ملاحظة: يتم إعداد المتوسطة الحد الأدنى والمتوسط ​​التعبير كما ذكرت في مكان آخر (19). قد تختلف مستويات إفراز اعتمادا على الجينات قيد الدراسة وفقا لذلك، رانه الحضانة يجب أن يكون الأمثل مرات في كل حالة لمزامنة نمو الخلايا في جميع الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحات (لوحات رئيسية) في 2800 ز س لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 ميكرولتر من طاف من الآبار في لوحة الرئيسي إلى لوحة المتماثلة باستخدام السائل التعامل مع multistation الروبوتية. ملاحظة: لصالح إفراز انزيم فإنه من المستحسن أن تحل محل الببتيد إشارة الأصلي من البروتين الهدف من الببتيدات إشارة تستخدم عادة للتعبير مغاير في الخميرة (على سبيل المثال، فإن العامل α prepro زعيم، زعيم K 1 القاتل السم من س. الخباز، أو حتى إصدارات خيالية من كلا الببتيدات 13). بدلا من ذلك، إشارة الببتيد الأصلي ويمكن أن تتطور بشكل حصري لإفراز في الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من 2 مم ص -methoxybenzylalcohol في 100 ملي فوسفات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 6.0 بمساعدة الروبوت pipetting ل. تحريك لوحات لفترة وجيزة مع 96-نحنليرة لبنانية لوحة خلاط واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الروبوت pipetting ل، إضافة 160 ميكرولتر من كاشف FOX إلى كل لوحة نسخة ويقلب لفترة وجيزة مع الخلاط (تركيز النهائي من FOX الخليط في البئر: 100 ميكرومتر زايلينول البرتقال، و 250 ميكرومتر الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 و25 مم H 2 SO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عدة إضافات إلى كاشف لتعزيز حساسية، مثل العضوية المشارك المذيبات ([دمس، والإيثانول والميثانول) أو السوربيتول 17. هنا، تضخيم الاستجابة عن طريق إضافة السوربيتول إلى تركيز النهائي من 100 ملي (الشكل 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحات (وضع نقطة النهاية، ر 0) في 560 نانومتر على قارئ لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في RT حتى يتطور لون وقياس امتصاص مرة أخرى (ر 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النشاط النسبي من الفرق بين القيمة المطلقة بعد الحضانة، وأنه من القياس المبدئي تطبيع لحلجنوع ntal لكل لوحة (Δt 1 - ر 0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض يضرب أفضل متحولة إلى مرتين متتاليتين إعادة الفحوصات لاستبعاد ايجابيات كاذبة. ملاحظة: عادة، تتضمن إعادة الفحص والعزل البلازميد من الخميرة، والتضخيم والتنقية في كولاي، تليها التحول من خلايا الخميرة الطازجة مع البلازميد 19. يعاد فحص-كل استنساخ مختارة في pentaplicate. </li></ol>

<ol>
	<li>J&#228;ckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts+by+evolution.">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li><li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis.">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li><li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+enzyme+universe:+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution.">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li><li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+past,+present+and+future.">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li><li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution.">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li><li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+selection+of+the+host+organism.">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).</li><li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering:+lessons+from+synthetic+biology.">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution:+an+efficient+tool+to+improve+enzymes.">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension.">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li><li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li><li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination.">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li><li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+assembler,+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways.">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium.">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li><li>Garcia-Ruiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+ligninolytic+oxidoreductases:+from+functional+expression+to+stabilization+and+beyond.">Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond.</a> Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).</li><li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aryl-alcohol+oxidase:+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation.">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+(MORPHING)+for+directed+enzyme+evolution.">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919 (2014).</li><li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells.">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li><li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+for+designing+smart+libraries.">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li><li>Vi&#241;a-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides.">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex.">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology:+Past,+present,+and+future.">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pocket+manual+of+directed+evolution:+Tips+and+tricks.">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .</li><li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies.">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في هذه المقالة، نحن لخصت معظم النصائح والحيل المستخدمة في المختبر لدينا لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه في س. الخباز (باستخدام AAO كمثال) بحيث يمكن تكييفها للاستخدام مع العديد من أنظمة انزيم حقيقية النواة الأخرى ببساطة عن طريق اتباع النهج المشترك هو مو?...

التطور الجزيئي الموجه هو وسيلة قوية وسريعة وموثوق بها لتصميم الإنزيمات 1، 2، ومن خلال جولات متكررة من الطفرات العشوائية، إعادة التركيب والفحص، إصدارات محسنة من الإنزيمات يمكن أن تتولد التي تعمل على ركائز جديدة، في تفاعلات جديدة، في غير طبيعي البيئات، أو حتى لمساعدة الخلية لتحقيق أهداف الأيض جديدة 3-5. بين المضيفين استخدامها في التطور الموجه، والبيرة خميرة الخباز يوفر ذخيرة من الحلول للتعبير الوظيفي للبروتينات حقيقية النواة المعقدة التي لا تتوفر إلا في نظرائهم بدائية النواة 6،7. تستخدم شاملة في دراسات بيولوجيا الخلايا، وهذا النموذج حقيقية النواة الصغيرة لديها العديد من المزايا من حيث التعديلات بعد متعدية، وسهولة التلاعب والتحول الكفاءة، وكلها صفات هامة لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه 8. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع وتيرةإعادة التركيب الحمض النووي مثلي في س. الخباز بالإضافة إلى جهاز فعال في تصحيح التجارب المطبعية يفتح مجموعة واسعة من الاحتمالات لإنشاء مكتبة والتجمع الجينات في الجسم الحي، وتعزيز تطور أنظمة مختلفة من الانزيمات واحدة لمسارات صناعية معقدة 9-12. أنفقت مختبرنا العقد الماضي أدوات واستراتيجيات تصميم للتطور الجزيئي للligninases مختلفة في خميرة (إنزيم أكسدة-اختزال تشارك في تدهور اللجنين خلال تسوس الخشب) 13-14. في هذه الاتصالات، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لإعداد والمكتبات شاشة متحولة في س. الخباز لنموذج flavooxidase، أوكسيديز -aryl من الكحول (AAO 15) -، والتي يمكن ترجمتها بسهولة إلى العديد من الإنزيمات الأخرى. ويشمل البروتوكول طريقة التطور الموجه تركيزا (تحوير: الطفري المنظمة التوحد عملية كتبها مثلي في الجسم الحي التجمع) بمساعدة من جهاز خلية الخميرة 16، لدا حساس جدا الفحص الفحص بناء على رد فعل فنتون من أجل الكشف عن النشاط AAO تفرز في مرق الثقافة 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>CAS N&#186; 69-52-3 M.W. 371.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0378</td>
			<td>CAS N&#186; 56-75-7 M.W. 323.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>CAS N&#186; 59-23-4 M.W. 180.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>CAS N&#186; 50-99-7 M.W. 180.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83400</td>
			<td>CAS N&#186; 17629-30-0 M.W. 594.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>CAS N&#186; 7778-77-0 M.W. 136.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. PCR Reactions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Agilent genomics</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>172-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td>CAS N&#186; 13446-34-9 M.W. 197.91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4545</td>
			<td>For error prone PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Plasmid linearization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>For staining DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. FOX assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3754</td>
			<td>CAS N&#186; 7783-85-9 M.W. 392.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anysil Alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W209902</td>
			<td>CAS N&#186; 105-13-5 M.W. 138.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td>CAS N&#186; 50-70-4 M.W. 182.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>FOX standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenol Orange disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52097</td>
			<td>CAS N&#186; 1611-35-4 M.W. 716.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel stuff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>28035</td>
			<td>CAS N&#186; 9012-36-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>DNA analysis dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1Kb Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>DNA M.W. standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye 6x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting temperature agarose</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-3112</td>
			<td>CAS N&#186; 39346-81-1</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Kits and cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae strain BJ5465</td>
			<td>LGC Promochem, Spain</td>
			<td>ATTC 208289</td>
			<td>Protease deficient strain with genotype: MAT&#945; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli XL2-Blue competent cells</td>
			<td>Agilent genomics</td>
			<td>200150</td>
			<td>For plasmid purification and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740,609,250</td>
			<td>DNA gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740,588,250</td>
			<td>Column miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Transformation Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>YEAST1-1KT</td>
			<td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td>
			<td>Zymo research</td>
			<td>D2001</td>
			<td>Plasmid extraction from yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>655161</td>
			<td>Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate lid</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>656171</td>
			<td>Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

التطور الموجه في خميرة الخباز يقدم العديد من المزايا الجذابة عند تصميم الانزيمات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية، وهي عملية تنطوي على البناء، والاستنساخ والتعبير المكتبات متحولة، بالإضافة إلى ارتفاع وتيرة مثلي إعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول لإنشاء والمكتبات شاشة متحولة في الخميرة على أساس مثال على فطرية أريل الكحول أوكسيديز (AAO) لتعزيز نشاطها الكامل. تعرض جزأين البروتين لتطور ركزت توجيهها بواسطة الطفرات العشوائية وإعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. سمحت يتدلى من ~ 50 نقطة المرافقة كل قطعة إعادة التجميع الصحيح من الجين AAO الانصهار في ناقلات خطي مما أدى إلى كامل البلازميد تكرار مستقل. تم فحص المكتبات متحولة المخصب مع المتغيرات AAO الوظيفية في س. supernatants الخباز مع حساسية فحص عالية الإنتاجية بناء على رد فعل فنتون. عملية العامة للبناء المكتبة في س. وصف الخباز هنا يمكن تطبيقها بسهولة أن تتطور العديد من الجينات حقيقية النواة الأخرى، وتجنب ردود الفعل PCR إضافية، في المختبر إعادة التركيب الحمض النووي وربط الخطوات.

AAO من P. eryngii هو flavooxidase خارج الخلية التي تزود مستخلصات الفطرية مع H 2 O 2 لبدء الهجوم على اللجنين. تعرض اثنين من شرائح AAO إلى التطور الموجه تركز على أيدي تتحول من أجل تعزيز نشاطها والتعبير في س. الخباز 19. بغض النظر عن الانزيمات ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening at JoVE.com

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K Views.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

Video: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

توجه طريقة تطور في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في