This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Mutante de construcción de biblioteca <ol><li> Elegir las regiones para ser sometidos al de transformación con la ayuda de algoritmos de cálculo en base a la estructura cristalina o de homología de 18 modelos disponibles. <ol><li> Aquí, el objetivo de dos regiones de AAO de Pleurotus eryngii para la mutagénesis al azar y la recombinación (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mientras que la amplificación de la resto del gen (844 bp) por PCR de alta fidelidad (Figura 1). Nota: Varios segmentos pueden ser estudiados por MORPHING de manera independiente o combinada 16. </li></ol></li><li> Amplificar las zonas seleccionadas por PCR mutagénica. Crear áreas entre segmentos (~ 50 pb cada uno) se superponen mediante la superposición de las reacciones de PCR de las regiones definidas. <ol><li> Preparar PCR mutagénica de los segmentos objetivo en un volumen final de 50 l que contenía ADN molde (0.92 ng / l), 90 nM sentido oligo (RMLN para el segmento de MI y AAO-BP para el segmento M-II), 90 nM unacebador ntisense (AAO-92C para el segmento de MI y RMLC para el segmento M-II), dNTPs 0,3 mM (0,075 mM cada uno), 3% (v / v) sulfóxido de dimetilo (DMSO), 1,5 mM MgCl 2, MnCl 0,05 mM 2 y 0,05 U / l de Taq ADN polimerasa. Secuencias de cebadores se detalla en la Figura 1. </li><li> Utiliza el siguiente programa de PCR: 95ºC durante 2 min (1 ciclo); 95 ° C durante 45 s, 50ºC durante 45 s, 74ºC durante 45 segundos (28 ciclos); y 74 ° C durante 10 min (1 ciclo). </li></ol></li><li> Amplificar las regiones no mutagénicos con ultra alta fidelidad de la polimerasa e incluyen las áreas correspondientes se solapan los segmentos mutagénicos y / o salientes vector linealizado. <ol><li> Preparar las mezclas de reacción en un volumen final de 50 l que contenía: plantilla de ADN (0,2 ng / l), 250 nM sentido oligo HFF, 250 nM HFR oligo antisentido, mM dNTPs 0,8 (0,2 mM cada uno), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) y 0,02 U / l iproof ADN polimerasa. secuencias de los cebadores se detallan en &lt;strong&gt; Figura 1. </li><li> Utiliza el siguiente programa de PCR: 98 ° C durante 30 segundos (1 ciclo); 98 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 25 seg, 72 ° C durante 45 seg (28 ciclos); y 72 ° C durante 10 min (1 ciclo). Nota: Con las condiciones descritas en el punto 1.2 y 1.3 solapamientos de 43 pb (región de plásmido-M1); 46 pb (M1 región por región HF); 47 pb (región-región M2 HF) y 61 pb (M2 plásmido región) se han diseñado (Figura 1) para favorecer el empalme en vivo en la levadura. </li><li> Purificar todos los fragmentos de PCR (mutagénicos y no mutagénicos) con un kit de extracción de gel comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Linealizar el vector de modo que se crean regiones de aproximadamente 50 pares de bases que flanquean que son homólogos a los extremos 5 &#39;y 3&#39; extremos del gen diana. <ol><li> Preparar una mezcla de reacción que contiene linealización 2 g de ADN, 7,5 U Bam HI, 7,5 U XhoI, 20 g de BSA y 2 l de tampón de Bam HI 10x en un volumen final de 20 l. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 2 horas y 40 min. A continuación, proceder a la inactivación a 80 ° C durante 20 minutos. </li></ol></li><li> Se purifica el vector linealizado mediante extracción en gel de agarosa para evitar la contaminación con el plásmido circular residual (Figura 2). <ol><li> Cargar la mezcla de reacción de digestión en el mega-pocillo de una bajo punto de fusión en gel de agarosa semi-preparativa (0,75%, w: v), así como una parte alícuota (5 l) de la mezcla de reacción en el adyacente así como un reportero. </li><li> Ejecutar electroforesis de ADN (5 V / cm entre los electrodos, 4 ᵒC) y separar el gel de agarosa correspondiente a la mega bien y que lo conserve en 4 ᵒC en 1x TAE. </li><li> Manchar el carril con la escala de peso molecular y el reportero. Visualizar las bandas bajo luz UV. Nick la posición en los lugares vector linealizado. Nota: Como la calidad del vector linealizado purificado es un critifactor de cal para la recombinación exitosa y montaje en la levadura, para evitar mancharse gel de electroforesis de ADN semi-preparativa. El uso de colorantes y la exposición UV para la extracción de gel puede afectar a la estabilidad del vector de ADN, comprometer la eficacia de recombinación in vivo en. Como alternativa a los colorantes EtBr tóxicos, colorantes SYBR Gel Red y se utilizan comúnmente para la tinción de gel. </li><li> En la ausencia de luz UV, identificar el vector linealizado en el fragmento de mega-bien utilizando la guía de las muescas en el carril de reportero manchado de modo que pueda ser aislado. </li><li> Extraer el vector linealizado a partir de agarosa y se purifica con un kit de extracción de gel comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nota: Use vectores lanzadera episomal de alta copia con marcadores de antibióticos y auxotrofía: En este ejemplo se empleó el uracilo independiente y ampicilina resistencia pJRoC30 vector, bajo el control del promotor de levadura GAL1. </li></ol></li><li> Preparar un IM equimolarxture de los fragmentos de PCR y se mezcla con el vector linealizado en una proporción de 2: 1, con no menos de 100 ng de plásmido linealizado (prueba de diferentes proporciones de biblioteca equimolar / vector abierta para lograr buenos rendimientos de transformación). <ol><li> Medir la absorbancia de los fragmentos de PCR y el vector linealizado en 260 nm y 280 nm para determinar su concentración y pureza. </li></ol></li><li> Transformar células competentes de levadura con la mezcla de ADN utilizando un kit de transformación de levadura comercial (véase la Tabla de suministros) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> A continuación, utilice una proteasa deficiente y URA3 - S. dependientes cerevisiae cepa, BJ5465. Transformar las células con el vector parental circularizado como un estándar interno durante la selección (véase a continuación). Además, compruebe el fondo mediante la transformación del vector linealizado en ausencia de fragmentos de PCR. Nota: En caso de detectar niveles iniciales bajos de secreción, use S.cerevisiae cepas deficientes en proteasa como BJ5465 de favorecer la acumulación de proteína activa en sobrenadantes de cultivo. Si la enzima diana se somete a hiperglicosilación, el uso de cepas deficiente en glicosilación (por ejemplo, Δ kre2 que sólo es capaz de fijar oligómeros de manosa más pequeñas) podría ser una opción adecuada. </li></ol></li><li> Placa de las células transformadas en placas de deserción SC y los incuban a 30 ° C durante tres días. Placa (en placas de deserción SC suplementado con uracilo) URA3 - S. células cerevisiae que carecen de plásmido como control negativo para la detección (ver abajo). </li></ol> 2. Alta-Throughput Screening de ensayo (Figura 3) <ol><li> Llenar un número apropiado de placas de 96 pocillos estériles (23 placas para analizar una biblioteca de 2.000 clones) con 50 l de medio mínimo por pocillo con la ayuda de un robot de pipeteado. </li><li> Recoger las colonias individuales de la SC-abandono placas y transferirlos a las placas de 96 pocillos. <ol><li> En cada placa, inocular número de columna 6 con el tipo parental como patrón interno y así H1 con URA3 - S. células cerevisiae (en medio SC suplementado con uracilo) sin plásmido como control negativo. Nota: Bueno H1 está llena específicamente con los medios de deserción suplementado con uracilo. Un medio bien contiene en blanco sin células también puede prepararse como un control de esterilidad adicional. </li></ol></li><li> Se cubren las placas con sus tapas y envolverlos en Parafilm. Incubar las placas durante 48 horas a 30 ° C, 225 rpm y 80% de humedad relativa en un agitador húmedo. </li><li> Retire el Parafilm, añadir 160 l de medio de expresión a cada pocillo con la ayuda del robot de pipeteado, vuelva a sellar las placas y se incuban durante 24 horas. Nota: medio mínimo y medio de expresión se preparan como informado en otras partes 19. los niveles de secreción pueden variar en función del gen bajo estudio y, en consecuencia, tél incubación veces deben ser optimizados en cada caso para sincronizar el crecimiento de las células en todos los pocillos. </li><li> Centrifugar las placas (placas maestras) a 2800 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferencia de 20 l del sobrenadante de los pocillos de la placa principal a la placa de réplica usando un manejo multiestación robótico líquido. Nota: Para favorecer la secreción de enzimas, es aconsejable sustituir el péptido señal nativa de la proteína diana mediante péptidos señal comúnmente utilizados para la expresión heteróloga en la levadura (por ejemplo, el factor α prepro-líder, el líder de la K 1 Killer toxina de S. cerevisiae, o incluso versiones quiméricas de ambos péptidos 13). Alternativamente, el péptido señal nativo puede ser desarrollado exclusivamente para la secreción en la levadura. </li><li> Añadir 20 l de p -methoxybenzylalcohol 2 mM en tampón de fosfato de sodio 100 mM pH 6,0 con la ayuda del robot de pipeteado. Agitar las placas brevemente con un 96-nosll mezclador de placas y se incuba durante 30 min a TA. </li><li> Con el robot de pipeteado, añadir 160 l de reactivo FOX a cada placa de réplica y agitar brevemente con el mezclador (concentración final de la mezcla de FOX en el pozo: 100 M xilenol naranja, 250 M Fe (NH4) 2 (SO4) 2 y 25 mm de H 2 SO 4). <ol><li> Añadir varios aditivos al reactivo para mejorar la sensibilidad, tales como co-disolventes orgánicos (DMSO, etanol, metanol) o sorbitol 17. Aquí, amplificar la respuesta mediante la adición de sorbitol a una concentración final de 100 mM (Figura 4). </li></ol></li><li> Leer las placas (modo de punto final, t 0) a 560 nm en un lector de placas. </li><li> Incubar las placas a temperatura ambiente hasta que se desarrolle el color y medir la absorción de nuevo (t 1). <ol><li> Calcular la actividad relativa de la diferencia entre el valor Abs después de la incubación y el de la medición inicial normalizado a la pareTipo ntal para cada placa (Dt 1 - t 0). </li></ol></li><li> Someter los mejores éxitos mutantes a dos re-exámenes consecutivos para descartar falsos positivos. Nota: Por lo general, re-proyecciones incluyen el aislamiento del plásmido de la levadura, la amplificación y purificación en Escherichia coli, seguido de la transformación de células de levadura fresca con el plásmido 19. Cada clon seleccionado se vuelve a proyectará en pentaplicate. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, hemos resumido la mayor parte de los consejos y trucos empleados en nuestro laboratorio para diseñar enzimas por evolución dirigida en S. cerevisiae (usando AAO como ejemplo) para que puedan ser adaptados para su uso con muchos otros sistemas de enzimas eucariotas simplemente siguiendo el enfoque común se describe aquí. En cuanto a la creación de la biblioteca, el morphing es un método rápido de un solo recipiente para introducir y recombinar las mutaciones...

Evolución molecular dirigida es un método robusto, rápido y fiable para diseñar enzimas 1, 2. A través de rondas iterativas de mutación al azar, recombinación y análisis, versiones mejoradas de las enzimas se pueden generar que actúan sobre los nuevos sustratos, en las reacciones novedosas, en no natural ambientes, o incluso para ayudar a la célula para alcanzar nuevos objetivos metabólicos 3-5. Entre los anfitriones utilizados en la evolución dirigida, levadura Saccharomyces cerevisiae de cerveza ofrece un repertorio de soluciones para la expresión funcional de las proteínas eucariotas complejos que no son de otra manera disponible en homólogos procariotas 6,7. Se utiliza exhaustivamente en estudios de biología celular, este pequeño modelo eucariota tiene muchas ventajas en términos de las modificaciones post-traduccionales, la facilidad de manipulación y la eficiencia de transformación, todos los cuales son rasgos importantes para diseñar enzimas por evolución dirigida 8. Por otra parte, la alta frecuenciade la recombinación del ADN homólogo en S. cerevisiae acoplado a su aparato de prueba de lectura eficiente abre una amplia gama de posibilidades para la creación de la biblioteca y el conjunto de genes in vivo, el fomento de la evolución de los diferentes sistemas de enzimas individuales a vías artificiales complejos 9-12. Nuestro laboratorio ha pasado la última década el diseño de herramientas y estrategias para la evolución molecular de diferentes ligninasas en la levadura (oxidorreductasas implicadas en la degradación de la lignina durante la descomposición de la madera natural) 13-14. En esta comunicación, presentamos un protocolo detallado para preparar y bibliotecas mutantes pantalla en S. cerevisiae para un modelo flavooxidase, alcohol-oxidasa-arilo (AAO 15) -, que se puede traducir fácilmente a muchas otras enzimas. El protocolo consiste en un método de evolución dirigida centrado (MORPHING: Proceso mutagénico Organizada recombinación homóloga in vivo por la Agrupación), asistido por el aparato de célula de levadura 16, unada ensayo de cribado muy sensible basado en la reacción de Fenton con el fin de detectar la actividad de AAO secretada en el caldo de cultivo 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>CAS N&#186; 69-52-3 M.W. 371.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0378</td>
			<td>CAS N&#186; 56-75-7 M.W. 323.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>CAS N&#186; 59-23-4 M.W. 180.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>CAS N&#186; 50-99-7 M.W. 180.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83400</td>
			<td>CAS N&#186; 17629-30-0 M.W. 594.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>CAS N&#186; 7778-77-0 M.W. 136.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. PCR Reactions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Agilent genomics</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>172-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td>CAS N&#186; 13446-34-9 M.W. 197.91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4545</td>
			<td>For error prone PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Plasmid linearization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>For staining DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. FOX assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3754</td>
			<td>CAS N&#186; 7783-85-9 M.W. 392.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anysil Alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W209902</td>
			<td>CAS N&#186; 105-13-5 M.W. 138.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td>CAS N&#186; 50-70-4 M.W. 182.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>FOX standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenol Orange disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52097</td>
			<td>CAS N&#186; 1611-35-4 M.W. 716.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel stuff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>28035</td>
			<td>CAS N&#186; 9012-36-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>DNA analysis dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1Kb Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>DNA M.W. standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye 6x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting temperature agarose</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-3112</td>
			<td>CAS N&#186; 39346-81-1</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Kits and cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae strain BJ5465</td>
			<td>LGC Promochem, Spain</td>
			<td>ATTC 208289</td>
			<td>Protease deficient strain with genotype: MAT&#945; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli XL2-Blue competent cells</td>
			<td>Agilent genomics</td>
			<td>200150</td>
			<td>For plasmid purification and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740,609,250</td>
			<td>DNA gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740,588,250</td>
			<td>Column miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Transformation Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>YEAST1-1KT</td>
			<td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td>
			<td>Zymo research</td>
			<td>D2001</td>
			<td>Plasmid extraction from yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>655161</td>
			<td>Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate lid</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>656171</td>
			<td>Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

La evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas atractivas en el diseño de enzimas para aplicaciones biotecnológicas, un proceso que consiste en la construcción, la clonación y la expresión de bibliotecas de mutantes, junto a la alta frecuencia de recombinación homóloga de ADN in vivo. A continuación, se presenta un protocolo para crear y bibliotecas mutantes de levadura en pantalla basado en el ejemplo de un fungicida aril-alcohol oxidasa (AAO) para mejorar su actividad total. Dos segmentos de proteínas se sometieron a la evolución dirigida-centrado por mutagénesis aleatoria y recombinación de ADN in vivo. Voladizos de ~ 50 pb que flanquean cada segmento permite el correcto montaje del gen AAO-fusión en un vector linealizado que da lugar a un plásmido de replicación autónoma completa. Bibliotecas mutantes enriquecidos con variantes funcionales AAO se rastrearon en S. sobrenadantes cerevisiae con un ensayo de alto rendimiento sensible basado en la reacción de Fenton. El proceso general deconstrucción de la biblioteca en S. cerevisiae se describe aquí se puede aplicar fácilmente a evolucionar muchos otros genes eucarióticos, evitando reacciones adicionales de PCR, en la recombinación de ADN y la ligadura pasos in vitro.

AAO de P. Eryngii es un flavooxidase extracelular que suministra peroxidasas fúngicas con H 2 O 2 a empezar a atacar la lignina. Dos segmentos de AAO se sometieron a la evolución dirigida centrado-morphing con el fin de mejorar su actividad y su expresión en S. 19 cerevisiae. Independientemente de las enzimas extranjeros albergadas por S. cerevisiae, el problema más crítico en la construcción de bibliotecas de mut...

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Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Dirigida Método Evolución en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K vistas.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

Video: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Investigación

Genética

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Proyección de biblioteca sobreexpresión basado en apareamiento en levaduras

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Una pantalla de supresor asistida por secuenciación profunda, espontánea en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biología

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimización de las funciones de las proteínas a través de técnicas de visualización de la superficie de la levadura

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Ingeniería de proteínas por visualización de superficie de levadura

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Bioingeniería

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.